Extracto
Floridzina (florizin o floretina 2 '-
O
glucósido) es conocido por el bloqueo de la absorción de glucosa intestinal. Hemos investigado el efecto anticancerígeno de floridzin y sus derivados novedosos que utilizan líneas celulares de cáncer humano. Se han sintetizado nuevos derivados acilados de floridzina con seis ácidos grasos de cadena larga diferentes por acilación enzimática regioselectiva utilizando
Candida Antarctica
lipasa B. Los efectos antiproliferativos de los nuevos compuestos se investigaron en comparación con los compuestos originales, floridzina, aglicona floretina, los seis ácidos grasos libres y los fármacos quimioterapéuticos (sorafenib, doxorrubicina y daunorrubicina) utilizando células HepG2 carcinoma hepatocelular humano, adenocarcinoma de mama humano células MDA-MB-231 y las células de leucemia aguda monocítica THP-1 junto con hepatocitos humanos y ratas normales. Los ésteres de ácidos grasos de floridzina inhibieron significativamente el crecimiento de las dos células de carcinoma y leucemia mientras que las dosis de tratamiento similares no eran tóxicos para los hepatocitos humanos o de rata normales. La potencia antiproliferativa de los ésteres grasos de floridzina era comparable a la potencia de los fármacos quimioterapéuticos. Los ésteres de ácidos grasos de floridzina inhiben las topoisomerasas de ADN IIα actividad que pudiera inducir G
0 /G detención
1 fase, la apoptosis inducida por la activación de la caspasa-3, y disminución del nivel de ATP y el potencial de membrana mitocondrial en las células HepG2. Sobre la base de la alta selectividad en las células cancerosas, ácido decosahexaenoic (DHA) fue seleccionado éster de floridzin para el análisis de la expresión génica mediante RT
2PCR matriz de destino medicamento contra el cáncer humano. efecto antiproliferativo de éster de DHA de floridzin podría estar relacionada con la regulación a la baja de los genes anti-apoptóticos (BCL2), receptores de factores de crecimiento (familia EBFR, IGF1R /IGF-2, PDGFR) y sus socios de señalización corriente abajo (PI3K /Akt /mTOR, Ras /Raf /MAPK), maquinaria del ciclo celular (CDKs, de TERT, TOP2A, TOP2B), así como epigenética reguladores (HDACs). Estos resultados sugieren que los ésteres grasos de floridzina tienen potenciales efectos quimioterapéuticos mediadas a través de la expresión atenuada de varias proteínas clave implicadas en la regulación del ciclo celular, la actividad de las topoisomerasas de ADN IIα y mecanismos epigenéticos seguidos por la detención del ciclo celular y la apoptosis
Visto.: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe VPH (2014) ésteres de ácidos grasos de Floridzina inducir la apoptosis de las células de cáncer de hígado humano a través de la expresión de genes alterados. PLoS ONE 9 (9): e107149. doi: 10.1371 /journal.pone.0107149
Editor: Gnanasekar Munirathinam, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Marzo, 2014; Aceptado: August 12, 2014; Publicado: 17 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Nair et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación: HPVR:. Descubrimiento programa de subvención de las Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC; la subvención Número 327056; http://www.nserc-crsng.gc.ca) de (; la subvención Número 192020; http://www.acoa-apeca.gc.ca ACOA) el programa de Innovación del Atlántico fondos (FIA) de la Agencia de Oportunidades del Atlántico Canadiense Canadá y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC), la forma más común de cáncer de hígado, representan el quinto tumor maligno en todo el mundo y la tercera causa de mortalidad entre la muerte relacionada con el cáncer [1]. En Canadá, la incidencia de CHC ha aumentado en las últimas décadas [2]. CHC representa el 71,9% de los cánceres de hígado en machos y hembras en Canadá. De acuerdo con las estadísticas del cáncer de Canadá en 2013, la tasa de incidencia de cáncer de hígado en Canadá ha aumentado en un 3,6% por año, y la tasa de mortalidad aumentó en un 2,2% por año. Los factores que contribuyen de HCC incluyen el contacto con hepatocarcinogens en especial aflatoxinas [3], hepática infección viral y la cirrosis hepática [4]. Las posibles opciones de tratamiento curativo son la resección quirúrgica, trasplante de hígado, y la ablación o embolización transarterial [1]. La quimioterapia, multicinasa oral de sorafenib inhibidor (Nexavar) es el fármaco más utilizado para el tratamiento del HCC, pero la ganancia en la supervivencia es modesto [5]. La no disponibilidad de tratamientos eficaces y de alta tasa de prevalencia ha llevado a la búsqueda de nuevos enfoques adecuados para la prevención y el tratamiento de cáncer de hígado. Como resultado, muchos fitoquímicos han sido explorados como agentes quimiopreventivos potenciales que pueden revertir o suprimir la progresión hepatocarcinogénica.
Los flavonoides, una de las principales clases de polifenoles, han mostrado algunas propiedades quimiopreventivos contra CHC en un gran número de en vitro [6], [7] y en estudios in vivo [1], [8]. Floridzin (florizin o floretina 2 '-
O
glucósido), una dihidrochalcona, es uno de los principales glucósidos flavonoides fenólicos que se encuentran en la manzana [9]. La principal acción farmacológica de floridzina es la inhibición de los transportadores de glucosa dependientes de sodio ligado (SGLT1 y SGLT2) que bloquea la absorción de glucosa intestinal y producir glucosuria renal [9]. Además de su propiedad antidiabético, floridzina tiene otras actividades biológicas tales como la inhibición de la peroxidación de los lípidos [10], la prevención de la pérdida ósea en ratas [11] y la mejora de la memoria en ratones [12]. Floridzina estimular la melanogénesis mediante el aumento de la expresión del gen de la tirosinasa a través de la vía de señalización cAMP [13]. Phloretin, la aglicona de floridzina, se ha informado que tienen una actividad antioxidante potente en la captación de peroxinitrito y la inhibición de la peroxidación de lípidos [14]. Glicosilación en 2-OH disminuyó las actividades antioxidantes de floridzina por 18 veces en comparación con floretina [14]. Phloretin a las concentraciones de 100 mM aumentada relacionado TNF-ligando inductor de apoptosis (TRAIL) inducida por la apoptosis y la citotoxicidad en células LNCaP de cáncer de próstata [15]. Sin embargo, no existe un informe sobre los efectos quimiopreventivos de cáncer de floridzin. En un estudio de la actividad antitumoral de polifenoles de la manzana, floridzina no afectó a la proliferación de cualquiera de las células trasplantadas de ratón B16 de melanoma o células de tumor mamario de ratones BALB-MC.E12 de ratón [16].
En nuestro laboratorio, floridzina se aciló regioselectiva con una serie de cadena larga, saturados, ácidos grasos, mono- y poli-insaturados mediante el uso de lipasa inmovilizada B, de
Candida antarctica
(Novozyme 435) [17]. Lipasa catalizada de esterificación y transesterificación de glucósidos flavonoides se han reportado para aumentar la lipofilia y la mejora contra el cáncer efecto del compuesto padre [18]. Por lo tanto, en este estudio, se investigó el potencial citotóxico de los ésteres de ácidos grasos de floridzina sobre la proliferación celular de tumores sólidos tales como células de carcinoma HepG2 hepatocelulares y de adenocarcinoma de mama células MDA-MB-231, así como células de leucemia aguda monocitos THP-1. Normales hepatocitos humanos HP-F y hepatocitos de rata RTCP10 también se utilizaron para determinar la especificidad de los ésteres en las células cancerosas. Esta es la primera vez que estos nuevos ésteres de ácidos grasos de floridzina se han probado para el efecto antiproliferativo de las células cancerosas. Además de dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de los ésteres de ácidos grasos de floridzina en las células HepG2, la actividad de las topoisomerasas de ADN IIα, detención del ciclo celular, permeabilidad de la membrana mitocondrial, la actividad de caspasa 3 y procesos apoptóticos asociados también fueron investigados. Además, se analizó el efecto del éster de ácido decosahexaenoic (DHA) de floridzin en la expresión de 84 genes que los objetivos para la terapéutica contra el cáncer y el desarrollo de fármacos. Nuestros resultados proporcionados pruebas experimentales que apoyan la investigación adicional de los ésteres de ácidos grasos de floridzin especialmente éster de DHA de floridzin como un candidato eficaz y seguro quimioterapéutico.
Materiales y Métodos
compuestos
Prueba y productos químicos
Los ésteres de ácidos grasos de floridzin (Pz) a saber. éster de ácido esteárico de Pz (ácido Pz-esteárico), éster de ácido oleico de Pz (ácido Pz-oleico), éster de ácido linoleico de Pz (ácido Pz-linoleico), éster de ácido α-linolénico de Pz-α-linolénico Pz ( ), éster de DHA de Pz (Pz-DHA) y éster de ácido eicosapentaenoico (EPA) de Pz (Pz-EPA) se sintetizaron en nuestro laboratorio como se informó anteriormente [17].
Floridzina, floretina, caspasa 3 colorimétrico kit de ensayo, yoduro de propidio, los ácidos grasos ácido oleico es decir, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido α-linolénico, EPA y DHA se adquirieron de Sigma-Aldrich Canadá. Cell Titer 96 Aqueous ensayo de una solución de la proliferación celular (MTS), CytoTox 96 citotoxicidad no radiactivo (LDH) de ensayo y kits de ensayo luminiscentes CellTiter-Glo se adquirieron de Promega, Madison, WI, EE.UU.. Estéril dimetilsulfóxido (DMSO) (ATCC), kit de detección de apoptosis /necrosis GFP-certificada para microscopía de Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Canadá; ADN apoptótica ApoTarget rápida kit de detección de escalera de Invitrogen, Burlington, ON, Canadá; DCFDA-Celular Especies de Oxígeno ensayo de detección de forma de kit reactiva Abcam, Toronto, ON, Canadá; y 5 ', 6,6-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine yoduro (JC-1) a partir de Cayman Chemicals, Burlington, ON, Canadá También se utilizaron para el estudio.
líneas celulares y condiciones de cultivo
células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) y THP-1 células de leucemia monocítica aguda se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE.UU. (número de certificado de Dalhousie Universidad de Bioseguridad el uso de líneas de células es de 2013 a 10). las células HepG2 se cultivaron en medio de Eagle modificado mínimo esencial (EMEM) complementado con 10% de FBS (ATCC) y 1% de penicilina-estreptomicina (ATCC). células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado mM de suero bovino fetal 2-mercaptoetanol y 10%: 0,05 a una concentración final de 10%. -231 MDA-MB células de cáncer de mama (ATCC HTB-26) se obtuvieron de Cedarlane, Berlington, ON, Canadá) y se mantuvieron en medio DMEM (Sigma-Aldrich Canadá) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina , 2 mM L-glutamina, HEPES 5 mM (pH 7,4) y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). Criopreservados hepatocitos humanos normales (HP-F), chapado en medio de mantenimiento de hepatocitos medio y hepatocitos fueron adquiridos de Zen-Bio, Investigación tiangle Park, Carolina del Norte, EE.UU.. hepatocitos humanos normales en placas en placas de 96 pocillos recubiertas de colágeno 1 de cultivo de células (Life Technologies) y se mantuvieron en medio de mantenimiento de los hepatocitos por 24 h para permitir la recuperación de células y la unión. hepatocitos de rata (RTCP10), medios de comunicación y medios de descongelación de incubación se adquirieron de Life Technologies. hepatocitos de rata se cultivaron en colágeno 1 recubiertas placas de 96 pocillos (Life Technologies, Burlington, ON, Canadá) utilizando medios de descongelación y mantenidas en medio de incubación. Todos los tipos de células se mantuvieron a 37 ° C en una incubadora bajo 5% de CO
2/95% atmósfera de aire a una humedad constante.
Las células se contaron usando un hemocitómetro (Bright-Line hemocitómetro, Sigma-Aldrich Canadá) y se cultivaron de acuerdo con el número de células para cada experimento en 6, 24 o 96 formato bien durante 24 h antes de la adición de muestras de ensayo. Todas las muestras de ensayo se solubilizaron en DMSO esterilizada por filtración (& lt; 0,5% en el medio de cultivo) antes de la adición al medio de cultivo. Las células de control también se ejecuta en paralelo y se someten a los mismos cambios en los medios de comunicación con & lt; 0,5% de DMSO
proliferación de células de ensayo
La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTS.. En, células breves HepG2 (5 × 10
3 células /100 l /pocillo), MDA-MB-231 (5 × 10
3 células /100 l /pocillo), THP-1 (25 × 10
3/100 l /pocillo), los hepatocitos humanos y de rata normales (1 × 10
4 células /100 l /pocillo) se sembraron por triplicado, en placas de cultivo de un tejido de 96 pocillos estériles de fondo plano. Después de 24 h de incubación, los ésteres grasos floridzina, floridzina, floretina, se prepararon los ácidos grasos libres de ésteres o sorafenib respectivos en los medios y se añadieron 100 l de cada tratamiento a cada pocillo, de cada tratamiento en tres repeticiones. De este modo, las células se expusieron a diversas concentraciones (0,1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 mM) de cada tratamiento. Los controles consisten de células con medios que contienen DMSO (& lt; 0,5%), pocillos de blanco de prueba contenían el compuesto de ensayo en medios sin células y los pozos en blanco contenían medios de comunicación sin células. Después adicionales 3, 6, 12, 18 o 24 h, 20 l de reactivo MTS en combinación con el agente de acoplamiento de electrones, se añadieron metosulfato de fenazina a los pocillos y las células se incubaron en un incubador humidificado durante 3 h. La absorbancia a 490 nm (OD490) se midió utilizando un lector de microplacas Flurostar Optima (BMG Labtech, Cary, NC, EE.UU.) para obtener el número de células viables con respecto a la población control. Porcentaje de viabilidad de las células tratadas con compuestos de prueba se expresan como porcentaje en comparación con el control (& lt; 0,5% de DMSO). CE
50 valores (concentración requerida para reducir la viabilidad de las células en un 50% en comparación con las células de control) para cada compuesto de ensayo se analizó utilizando el software GraphPad Prism, La Jolla, CA, EE.UU.. El índice selectivo (SI) del ácido graso ésteres de floridzina se define como la relación de la citotoxicidad (CE
50 valores) sobre las células normales HP-f para cáncer sólido HepG2, MDA-MB-231 células (SI = EC
50 sobre las células HP-F /CE
50 en células de cáncer de sólidos). Las muestras con valores de SI mayor que tres fueron considera que tienen una alta selectividad hacia las células cancerosas.
Ensayo de citotoxicidad
La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima citosólica estable que se libera tras la lesión de la membrana en la apoptosis /células necróticas. la actividad de LDH se midió usando CytoTox 96 no radiactivos Ensayo de citotoxicidad (Promega, Madison, WI, EE.UU.), en el que la LDH liberada en los sobrenadantes del cultivo se mide con un ensayo enzimático acoplado, lo que resulta en la conversión de una sal de tetrazolio en un producto formazan rojo. células HepG2 (5000/100 l /pocillo) se sembraron y se trató con 100 mM de ésteres de ácidos grasos, floridzina floridzina, floretina, ácidos grasos libres de los ésteres respectivos o sorafenib preparadas en medio libre de suero y se incubaron (37 ° C, 5% de CO
2) durante 6 h. Después de la centrifugación, el sobrenadante se retiró a una placa de ensayo, y se midió la LDH liberada de las células en medio de cultivo. La liberación máxima se obtuvo después de tratamiento de control de las células con 1% de Triton X-100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. El /porcentaje necrótico apoptótica se expresa utilizando la fórmula: (valor de la muestra /liberación máxima) x 100%. Estudios previos realizados por el proveedor habían manifestado claramente que en las células HepG2, la actividad LDH concentración máxima está en 1 a 6 h incubaciones porque la actividad de LDH liberada de las células tiene una vida media de aproximadamente 9 h [19]. los resultados del ensayo de MTS mostraron que todos los ésteres de ácidos grasos de floridzina inhibidas 70-80% la proliferación celular en 6 h, por lo tanto, analizamos la actividad de LDH después de 6 h de incubación.
observación morfológica de apoptosis en las células HepG2
2.5.1. observación morfológica bajo el microscopio de contraste de fase invertida.
células HepG2 se sembraron por igual en placas de 24 pocillos tratadas de cultivo de tejidos de fondo plano (BD Biosciences), y después se trató con 100 mM de ésteres de ácidos grasos de floridzina, floridzina, floretina , sorafenib y DMSO (& lt; 0,5%) control. Después de 24 h de tratamiento, se observó la morfología de las células HepG2 con un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon Eclipse E 100, Nikon, Mississauga, ON, Canadá) y se capturaron con un aumento de 400X utilizando Infinity cámara microscopía digital (corporación Lumenera, Ottawa, ON, Canadá).
2.5.2. Determinación de apoptosis /necrosis por microscopía de fluorescencia.
células HepG2 se sembraron en Nunc Lab-Tek dos diapositivas cámara (Sigma-Aldrich Canadá) a una densidad de 1 × 10
6 células /cámara. Las células unidas fueron tratados luego o bien con ésteres de ácidos grasos 100 M de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib o vehículo DMSO (como control) durante 24 h. Los portaobjetos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato diluida. Después de quitar la cámara, se añadió cada portaobjetos con 50 l de reactivo de detección dual que contiene el reactivo de detección de apoptosis (anexina V-EnzoGold) y reactivo de detección de necrosis (7-AAD) en tampón de unión 1X. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min en la oscuridad. Después de la tinción, las células se lavaron con tampón de unión y se cubrieron con un cubreobjetos de vidrio. Se observaron las células teñidas bajo una fluorescencia Zeiss Axiovert 200 m microscopio invertido (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canadá) a aumento de × 40 con un conjunto de filtros para Anexina V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) y 7 -AAD (Ex /Em: 546/647 nm).
Análisis de la apoptosis mediante la fragmentación del ADN
HepG2 (1 × 10
5) se sembraron las células en placas de cultivo de 24 pocillos y se permite que se adhieran durante la noche. Después de esto, las células fueron tratadas ya sea con ésteres de ácidos grasos 100 M de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib o vehículo DMSO (como control). Las placas se re-incubaron durante otras 24 h. la fragmentación del ADN se detectó usando ADN apoptótica rápida ApoTarget Kit de detección de contactos (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El principio implica la detección de los fragmentos de ADN internucleosomal formados durante la apoptosis. Brevemente, las células muertas y las células adherentes tratadas con tripsina flotante se recogieron y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. Después de lavar con solución salina tamponada con fosfato diluida, las células se lisaron con tampón de lisis 35 l TE (un componente del kit). Para el lisado, se añadieron 5 l de enzima A (un componente de kit) y se incubaron a 37 ° C durante 10 min. Después, se añadió 5 l de enzima B (un componente del kit), se mezcló suavemente y se incubó a 50 ° C durante 30 min. El ADN se precipitó con acetato de amonio y etanol absoluto a -20 ° C. Después de la centrifugación (10 min a 12.000 rpm) y secado al aire, el sedimento de ADN se disolvió en 30 l de tampón de suspensión de ADN. Para la detección de la escalera de ADN, las muestras de ADN extraídas se corrieron en un gel de agarosa al 1,2% que contenía 0,5 mg /ml rojo gel en tampón de Tris-Borato-EDTA (TBE). Después de la electroforesis, el gel imagen fue capturada con Gel Doc 100 del sistema (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canadá).
Ensayo de la caspasa 3-Actividad
La actividad de la enzima caspasa 3 se medido usando la caspasa 3 kit de ensayo colorimétrico adquiridos de Sigma-Aldrich. Las células HepG2 (2 × 10
6 células /pocillo), cultivadas en placas de 6 pocillos, fueron tratados con 100 mM ésteres de ácidos grasos de floridzin, floridzin, floretina, sorafenib o vehículo DMSO (como control). Las células se lisaron y el contenido de proteína de lisado celular se cuantificó por el ensayo de proteína BCA (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ON, Canadá). Actividad de la caspasa-3 se midió en el 200 g de lisado de células usando el sustrato peptídico específico-caspasa, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), conjugado con moléculas indicadoras p-nitroanilina (ρ-NA). La escisión de este péptido por la caspasa libera el cromóforo que se mide colorimétricamente a una longitud de onda de 405 nm como se describe en el protocolo del proveedor.
Ciclo Celular Análisis
células HepG2 se cultivaron en placas a 5 x 10
5 células por ml en una placa de seis pocillos. Después de 24 h de incubación (37 ° C, 5% de CO
2), las células fueron tratadas con 100 mM ésteres de ácidos grasos de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib o DMSO (& lt; 0,5%) de control preparado en los medios y se incubaron para las 24 h adicionales. Después de tripsinización, las células se lavaron y se centrifugaron a 2000 xg durante 10 min y el sedimento se resuspendió en 0,5 ml de PBS. La fijación se terminó mediante la adición de 1,2 ml de etanol al 70% frío durante 2 h. Las células fijadas se lavaron con PBS y se centrifugaron a 2000 xg durante 10 min. Después de suspender las células en 0,3 ml de PBS, se añadieron 8 l de ADNasa libre de ARNasa (10 mg /ml) y se incubaron durante 1 h. Después de añadir, a 15 l de yoduro de propidio (0,5 mg /ml), las células se incubaron en 4 ° C durante 30 min. Se analizaron las células para el ciclo celular utilizando citómetro de flujo FACS Calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) con una longitud de onda de excitación de 488 nm y emisión a 670 nm. El contenido de ADN se determinó mediante el software ModFit (Verity Software House, Topsham, ME, EE.UU.), que proporciona histogramas para evaluar la distribución del ciclo celular.
mitocondrial metabolismo energético Ensayos
ensayo de nivel de ATP.
niveles celulares de ATP se midieron con el kit de ensayo luminiscente CellTiter-Glo obtenido de Promega según las instrucciones del fabricante. células HepG2 chapados en un negro amuralladas placa de 96 pocillos de fondo claro se incubaron con ésteres de ácidos grasos 100 M de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib, ácidos grasos libres o DMSO (& lt; 0,5%) de control en medios de comunicación. Después de 24 h, CellTiter-Glo reactivo igual al volumen de medio de cultivo celular presente en cada contenido de los pocillos y se mezcló durante 2 min en un agitador orbital para inducir la lisis celular. La luminiscencia se registró en un lector de microplacas Flurostar Optima (BMG Labtech) después de la incubación a temperatura ambiente durante 10 min para estabilizar la señal luminiscente. El nivel de ATP en una muestra se presentó como porcentaje en comparación con el control no tratado.
mitocondrial potencial de membrana (MMP).
células HepG2 se sembraron en un negro amuralladas fondo claro de 96 pocillos estéril plana placas de cultivo de tejidos de fondo (BD Biosciences, EE.UU.) a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo (100 l) y se incubaron en un CO
2 incubadora durante 24 horas a 37 ° C. Las células fueron tratadas con ésteres de ácidos grasos 100 M de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib, ácidos grasos libres o DMSO (& lt; 0,5%) de control preparada en los medios y se incubaron durante 24 h. La solución de tinción JC-1 se preparó con PBS y se añadió 5 M a cada pocillo. Las células se incubaron adicionalmente en un CO
2 incubadora a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar la placa con PBS dos veces, se midió la fluorescencia utilizando un lector de microplacas Fluostar Optima (BMG Labtech) a 535 nm para monómeros JC-1 y a 590 nm para JC-1 agregados.
topoisomerasa humana IIα ( topo IIα) actividad catalítica
La actividad catalítica topo IIα se controló mediante electroforesis utilizando la topoisomerasa II kit de detección de drogas (TopoGEN, Inc., de Columbus, OH, EE.UU.). Brevemente, 20 l de mezclas de reacción contenía 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl, mM MgCl 100
2, ATP 20 mM, 300 mg de BSA /ml y ditiotreitol 5 mM. ADN superenrollado (ADN PHOT1), superenrollado proporcionado en el kit se determinó que era ideal para este ensayo porque es pequeño y fácil de manejar y tiene un gran número de elementos de reconocimiento topo IIα. Después se añadieron 2 l (0,25 g) de ADN PHOT1, seguido de la adición de 100 M ésteres de ácidos grasos de floridzina, floridzina, floretina, sorafenib o DMSO (& lt; 0,5%) de control en un disolvente, la reacción se inició mediante la adición de 4 unidades (2 l) de ADN humano topo IIα y llevadas a cabo a 37 ° C durante 30 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 2 l de 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS), seguido de digestión con 2 l de proteinasa K (50 mg /ml) a 37 ° C durante 15 min para degradar la enzima. Después de la adición de 2 l de tampón de carga (0,25% de azul de bromofenol y 50% de glicerol) se añadió a la mezcla, las muestras se cargaron en gel de agarosa al 1%. La electroforesis se llevó a cabo a 66 V (2 V /cm) para 5 h en tampón TBE usando el Sistema de Biorad electroforética en gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). ADN superenrollado (DNA PHOT1) y el ADN relajado se incluyeron en la electroforesis funcionar como marcadores para la topología del ADN. Los geles se tiñeron a continuación en 0,5 mg /ml de gel rojo en TBE durante 30 minutos y destained durante 15 minutos en agua destilada antes de la adquisición de imágenes digitales usando el sistema Gel Doc 100 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Una unidad de actividad de la topoisomerasa II se definió como la cantidad mínima de enzima requerida para alcanzar la relajación completa de 0,5 mg de ADN PHOT1 superhelical en 30 min a 37 ° C. La inhibición de la actividad de relajación de la topoisomerasa II fue investigado por el mismo procedimiento utilizando cuatro unidades de enzima y 100 compuestos de ensayo M. El porcentaje de inhibición se calculó mediante la siguiente fórmula: Donde S
de control es el porcentaje de ADN superenrollado en el carril de control (sin compuestos de la enzima y de prueba), S
0 es el porcentaje de ADN superenrollado en el carril sin compuestos de ensayo y S es el porcentaje de ADN superenrollado en el carril con los compuestos de prueba y enzima.
análisis en tiempo real RT-PCR
Gene perfiles de expresión se obtuvieron a partir de células HepG2 tratadas con ésteres de DHA de floridzina o sorafenib o células de control DMSO tratados. extracción de RNA total se realizó con ARN total Arum MINIKIT (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). concentración de ARN y la pureza se determinó midiendo la absorbancia utilizando un NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE.UU.). La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa formaldehído. ARN (400 ng) se utiliza para sintetizar ADNc mediante RT
2 kit de primera cadena (SABiosciences, Frederick, MD, EE.UU.). RT
se utilizó 2 matrices de ARN de control de calidad de la PCR (SABiosciences, Frederick, MD, USA) para evaluar la calidad de las muestras de ADNc antes de la caracterización de los objetivos de medicamento contra el cáncer humano MR
2 perfilador matriz PCR (SABiosciences, Frederick, MD, ESTADOS UNIDOS). perfiles de expresión génica de 84 genes fueron investigados utilizando las dianas de fármacos cáncer humano RT
2 perfilador matriz PCR (HAP-507ZD) en un Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) utilizando RT
2 en tiempo real SYBR verde PCR master mix (SABiosciences, Frederick, MD, EE.UU.). La matriz también tiene cinco genes de referencia (beta-2-microglobulina (B2M), hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1), proteína ribosomal L13a (RPL13A), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), y beta actina (ACTB), tres inversa controles de transcripción (CRF), tres controles positivos de PCR (PPC), y un control de ADN genómico (GDC), por lo que hasta 96 ensayos. Después de la normalización con el gen de referencia RPL13A, niveles de expresión génica se evaluaron individualmente usando el ciclo umbral (Ct) valores utilizando RT
(programa basado en Microsoft Excel de SABiosciences, Mississauga, ON, Canadá) 2 perfilador PCR software de análisis de datos de la matriz Se calcula: 1)? Ct de cada gen = Ct del gen de interés - Ct promedio de referencia elegido. genes 2) ΔΔCt para cada gen en dos grupos; ΔΔCt = Ct (éster o sorafenib Pz-DHA) - Ct (control) & amp; 3) veces el cambio para cada gen del grupo de control al grupo tratado con éster Pz-DHA como 2
(- ΔΔCt). RT
2 Datos de RNA QC de PCR no mostró ninguna contaminación de ADN genómico (Ct & lt; 35 indicará menos GDC) o la presencia de impurezas en las muestras de ARN basado en el valor Ct de PPC (Ct debe ser de 20 ± 2 en cada array) y no mostró inhibición de la transcripción inversa en base a los valores de Ct de RTC y PPC. La reproducibilidad se mantuvo mediante el uso de tres réplicas biológicas a partir de tres experimentos individuales.
estadístico
analiza
EC
50 valores se calcularon utilizando GraphPad Prism software 6 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, ESTADOS UNIDOS). El análisis estadístico se realizó mediante el Sistema de Análisis Estadístico (SAS, versión 9.2). ANOVA de una vía con comparaciones post hoc de Tukey a P & lt; 0,001 se utilizó para las comparaciones estadísticas. Todos los datos se presentan como un valor medio con su desviación estándar indicada (media ± DE).
Resultados
Efecto antiproliferativo de ésteres de ácidos grasos de floridzin en varias células cancerosas y normales
en el presente estudio, los posibles efectos citotóxicos de ésteres de ácidos grasos de floridzin, floridzin, ácidos grasos libres y floretina, así como medicamentos para el cáncer comerciales estándar fueron investigados en hepatocarcinoma humano (HepG2), adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) líneas y leucemia monocítica aguda (THP-1) celulares, hepatocitos humanos normales primarios y hepatocitos de rata mediante el uso de ensayo MTS. El ensayo mostró que los ésteres de ácidos grasos de floridzina mata HepG2, MDA-MB-231 y las células THP-1 en un grado similar y en una dosis (Figura 1) y de manera dependiente del tiempo (Tabla 1). Después de 24 h de incubación, en las células HepG2, antiproliferación CE
50 para el ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido α-linolénico, ésteres de DHA y EPA de floridzina fueron 37,8, 31,5, 29,2, 53,1, 51,9 y 26,8 mM, respectivamente . CE
50 fueron 35.2, 37.9, 32.3, 63.8, 55.5 y 26.5 micras de células MDA-MB-231. CE
50 valores de estos ésteres en las células THP-1 fueron 40.7, 2.1, 6.2, 35.7, 27.3, y 14.8 M. Aunque los ésteres de ácidos grasos de floridzina mostraron alta potencia como agente antiproliferativo, ninguno de los ácidos de la molécula matriz, floridzina y grasos individual mostró ningún efecto sobre la viabilidad celular (CE
50 & gt; 100 mM) de HepG2, MDA-MB-231 o THP células -1. Curiosamente, floretina aglicona mostró un importante efecto antiproliferativo (CE
50 39,6 M) en células THP-1 (Tabla 1).
células de carcinoma hepático (HepG2) y hepatocitos humanos normales (HP-F) y hepatocitos de rata (células RTCP10) fueron expuestas a compuestos de prueba en 1, 10, 50, 100 M durante 24 h. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTS. Los datos que se presentan como el porcentaje de viabilidad respecto al vehículo sólo se tratan grupo de control. Los datos se presentan como la media ± SD (n = 3) son representativos de al menos tres experimentos independientes separadas. * P & lt; 0,05 significativamente diferente del grupo de control sólo vehículo (HSD de Tukey, P & lt; 0,01).
Para evaluar la especificidad de los ésteres de ácidos grasos de floridzin a las células cancerosas, el efecto del fármaco sobre el la viabilidad celular en hepatocitos normales se cuantificó por ensayo de citotoxicidad en hepatocitos humanos normales (HP-F) y de rata (RTCP10). células HP-F se trataron con 100 mu M y menores concentraciones de todos los ésteres de ácidos grasos de floridzina, floridzina, ácido graso, sorafenib y floretina durante 24 h (Tabla 1). ésteres de ácidos grasos de floridzina no afectaron la viabilidad de los hepatocitos humanos normales con CE
50 & gt; 100 mM y son más específicos de líneas celulares de cáncer (Tabla 1, Figura 1). En el tratamiento 100 M de ésteres de ácidos grasos de floridzina durante 24 h, ésteres de ácidos grasos de floridzina mostraron menos toxicidad (& gt; 90% de viabilidad) en hepatocitos de rata también (Figura 1). Se detectaron las actividades citotóxicas más prometedoras y más selectivos en ésteres Pz-DHA y EPA-Pz. Ésteres de ácidos grasos de floridzina excepto el ácido Pz-esteárico (aproximadamente 50% de viabilidad) también mostró mucha menos actividad en la inhibición de la viabilidad celular (& gt; 80% de viabilidad) de hepatocitos de rata que la de líneas celulares de cáncer. Estos resultados sugieren que los ésteres de ácidos grasos de floridzina pueden tener moderado a efectos secundarios mínimos. Las actividades citotóxicas más prometedores y más selectivas se detectaron con éster Pz-DHA. La CE
50 (M) y los valores de SI de Pz-DHA en HepG2, MDA-MB-231, THP-1 fueron 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5) y 27,3 (SI = 21,38) , respectivamente (Tabla 1). El DHA es un ácido común en la dieta de omega-3 los ácidos grasos y también posee propiedades antiproliferativas [20]. Por lo tanto, se seleccionó éster Pz-DHA para el estudio de la expresión génica usando objetivo de drogas humano RT
array 2-PCR como se demostró el efecto citotóxico más fuerte en las células cancerosas y era el menos tóxico sobre las células normales en comparación con otros ésteres de ácidos grasos de floridzina