Extracto
β, β-Dimethylacrylshikonin, uno de los componentes activos de los extractos de raíz de Lithospermum erythrorhizon, poseer actividad antitumoral. En este estudio, hemos discutido los mecanismos moleculares de β, β-dimethylacrylshikonin en la apoptosis de las células SGC-7901. β, β-Dimethylacrylshikonin redujo la viabilidad celular de las células SGC-7901 en una dosis y tiempo dependiente y la apoptosis celular inducida. β, el tratamiento β-Dimethylacrylshikonin en las células SGC-7901 el regulado la expresión de XIAP, CIAP-2 y Bcl-2 y regulado hasta la expresión de Bak y Bax y causó la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de citocromo c . Además, β, el tratamiento β-dimethylacrylshikonin condujo a la activación de las caspasas-9, 8 y 3, y la escisión de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), que fue abolida por pretratamiento con el inhibidor pan-caspasa Z-VAD-FMK . β, β-Dimethylacrylshikonin indujo la fosforilación de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) en células SGC-7901. U0126, un inhibidor de MEK específica, bloqueó la activación de ERK por β, β-β y dimethylacrylshikonin abrogada, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin. Nuestros resultados demuestran que β, β-dimethylacrylshikonin inhibe el crecimiento de las células cancerosas SGC-7901 gástrica mediante la inducción de la vía de señalización de ERK, y proporcionó una pista para la evaluación preclínica y clínica de β, β-dimethylacrylshikonin para la terapia del cáncer gástrico.
cita: Shen XJ, Wang HB, Ma XQ, Chen JH (2012) β, β-Dimethylacrylshikonin induce la apoptosis dependiente mitocondrias a través de ERK en células de cáncer gástrico humano SGC-7901. PLoS ONE 7 (7): e41773. doi: 10.1371 /journal.pone.0041773
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: March 1, 2012; Aceptado: 25 Junio 2012; Publicado: 27 Julio 2012
Copyright: © Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Provincial de Zhejiang de Ciencias Naturales de china para X-QM (LY12H28005), y la Fundación de Ciencias de la Universidad de Medicina china de Zhejiang a H-BW (2011ZY05). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es uno de los tumores malignos agresivos, aunque con el desarrollo de radioterapia, quimioterapia y terapia biológica, los efectos secundarios graves son inevitables [1], por lo tanto, los fármacos antitumorales más eficaces con menos efectos secundarios para el tratamiento del cáncer gástrico son necesarios.
Lithospermum erythrorhizon es una importante hierba china. Tiene algunos componentes activos: Deoxyshikonin, Isobutyrylshikonin, Acetylshikonin, Isovalerylshikonin, β, β-Dimethylaerylshikonin (Fig. 1A) y shiconina [2]. En la medicina tradicional china, exhibe múltiples funciones biológicas, incluyendo anti-microbianas, anti-inflamatorios, anti-tumoral, la regulación inmune y propiedades anti-VIH [3] - [6]. El efecto anti-tumor de shikonina y sus derivados se probaron primero por sus actividades contra el crecimiento tumoral en el sarcoma murino-180 [7]. Shiconina exposiciones efecto no sólo matando las células tumorales directamente, pero también mediante la inhibición de la angiogénesis tumoral [8]. Los estudios revelaron que la apoptosis inducida shikonin en el melanoma humano maligno, cáncer de vejiga, cáncer cervical, cáncer de pulmón y cáncer de hígado, y así sucesivamente [9] - [13]. Sin embargo, tiene menos efectos secundarios y efectos más protectores sobre las células normales humanos [14], [15]. Hsu PC et al demostraron que shikonin condujo a la apoptosis celular a través de la regulación de p27, p53, Bax y baja regulación de Bcl-2 y Bcl-XL en el carcinoma colorrectal humano COLO 205 células [16]. La invasión tumoral inhibida por shikonin en algunas células cancerosas pueden a través de la baja regulación de la mediada por NF-kB MMP-9 expresión [17]. Shiconina también induce la apoptosis a través de la producción de ROS en el carcinoma hepatocelular [12]. Singh F et al también encontró que shiconina disminución de los niveles de fosforilados EGFR, ERK y la proteína tirosina quinasas y el aumento de los niveles intracelulares de las proteínas relacionadas con la apoptosis, lo que provocó que las células de carcinoma epidermoide de someterse a la apoptosis [18].
(A) La estructura química de β, β-dimethylacrylshikonin (. MW 370.4). (B) Efectos de β, β-dimethylacrylshikonin sobre la inhibición de la viabilidad celular de las células SGC-7901. Las células se trataron con diferentes concentraciones de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h y 48 h. La viabilidad de células relacionadas se determinó mediante el ensayo de MTT. La viabilidad del grupo de control (0,1% DMSO) se fijó a 100%. Los datos representan la media ± desviación estándar obtenida a partir de tres experimentos independientes. * P indica & lt; 0,05 en comparación con el grupo control, respectivamente
La evidencia reciente mostró que β, β-dimethylacrylshikonin tuvieron efecto significativo anti-tumor en el carcinoma hepatocelular mediante la activación de la caspasa-3 [19].. Sin embargo, tal efecto de β, β-dimethylacrylshikonin en células de cáncer gástrico humanos no se ha descrito y los mecanismos moleculares aún no están bien comprendidos. Por lo tanto, en el presente estudio, Discutiremos efecto de β, β-dimethylacrylshikonin en la célula de cáncer gástrico humano SGC-7901 y su señalización relacionada a comprender mejor el mecanismo de β, β-dimethylacrylshikonin sobre el cáncer gástrico.
materiales y Métodos
materiales y reactivos
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Cultivo de células y ensayo de proliferación celular
células SGC-7901 se cultivaron en medio RPMI 1640 con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, UT), y se mantuvo a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. A continuación, se sembraron células en una placa de 96 pocillos a una concentración final de 5 × 10
3 células /pocillo y se incubaron en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FCS durante 24 h, después de eso, las células fueron tratadas con la concentración indicada de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 hy 48 h. Se retiró el medio y se añadió medio fresco a cada pocillo junto con 20 l de solución de MTT (5 mg /ml). Después de 4 h de incubación, se añadieron 150 l de DMSO a cada pocillo. Las placas se leyeron a la longitud de onda de 570 nm utilizando Varioskan flash multimodo Reader (Thermo Scientific, EE.UU.). Cuatro reduplicate pozos se utilizaron para cada tratamiento, y los experimentos se repitieron tres veces.
Cambios morfológicos fueron colocados
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DAPI (4 ', 6-diamino-2-fenilindol) tinción
células SGC-7901 se colocaron en el pocillo de una placa de seis pocillos. Después de cultivo de células de 24 h, se trataron con β, β-dimethylacrylshikonin para los períodos de tiempo indicados, a continuación, las células se fijaron en acetona fría durante 30 min, y se incubaron con DAPI (1 mg /ml) durante 30 min. Los núcleos apoptóticos caracteriza por ser intensamente teñidas fueron detectados mediante microscopía fluorescente. (Modelo IX71, Olympus, Tokio, Japón): perfil
Anexina V /PI para ensayos de apoptosis
Para los ensayos /PI, las células anexina V se tiñeron con AnnexinV-FITC y PI, y se evaluó la apoptosis por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del mannufacturer (BD PharMingen, San Diego, CA, EE.UU.). Brevemente, 1 × 10
5 células se lavaron dos veces con PBS, y se tiñeron con 5 l de AnnexinV-FITC y 5 l de PI en 500 l de tampón de unión durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células apoptóticas se determinaron utilizando el software de la diva BD FACS (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Anexina V tinción sirve como una medida de la externalización de fosfatidilserina y las células que son anexina V
+ /PI
-. Representan células apoptóticas temprano
Medición del potencial de membrana mitocondrial
Cells ( 5 × 10
5 células /ml) fueron tratados con o sin β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /l) durante 24 h y se tiñeron con JC-1 (BD MitoScreen JC-1 kit, Becton Dickinson, EE.UU.) para 15 min a 37 ° C. potencial de membrana mitocondrial se detectó por citometría de flujo (FACSCanto II, Becton Dickinson, EE.UU.).
análisis Western Bloting
Las células fueron tratadas con la concentración indicada de β, β-dimethylacrylshikonin durante el tiempo indicado en medio RPMI 1640 con 10% de FCS. Las células se recogieron en PBS enfriado en hielo, y los extractos celulares se prepararon en tampón RIPA con cóctel inhibidor de proteinasa a partir de Calbiochem (San Diego, CA). Las concentraciones de proteína de los lisados celulares se determinaron y se hirvieron con tampón de carga de gel durante 10 min a 100 ° C. Las muestras que contienen 30 mg de proteína total se sometieron a electroforesis en 10% geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Temecula, CA). Después de la transferencia, la membrana se bloquearon en TBST (TBS que contiene 0,1% de Tween 20) que contiene 5% de leche desnatada durante 2 h, seguido de incubación durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios apropiados. Después de lavar tres veces en TBST, las membranas se incubaron durante 2 horas a 37 ° C con 1:5000 rábano picante anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa. Por último, las membranas se visualizaron utilizando el sistema de detección de quimioluminiscencia (kit Immun-Star WesternC, Bio-Rad, EE.UU.).
inmunofluorescencia tinción
mediante inmunofluorescencia tinción se utilizó para analizar la distribución subcelular de citocromo c en las células SGC-7901 inducidos por β, β-dimethylacrylshikonin. Las células cultivadas en coverlips de vidrio estériles se fijaron en acetona fría durante 10 min. Después de permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 durante 20 min a temperatura ambiente, las células fueron bloqueadas en 3% de albúmina de suero bovino durante 30 min y se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo anti-c citocromo (1:30). Después de lavar tres veces en PBS, las células SGC-7901 se marcaron con Alexa Fluor 488 de anticuerpo secundario conjugado. DAPI se añadió posteriormente para la tinción nuclear. El análisis microscópico se realizó mediante una microscopía de fluorescencia (modelo IX71, Olympus, Tokio, Japón).
El análisis estadístico
Los datos presentados son la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos independientes. Ellos fueron evaluados por análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). Se encontraron diferencias significativas en p. & lt; 0,05
Resultados
β, β-Dimethylacrylshikonin inhibe la viabilidad de las células SGC-7901
Con el fin de determinar el efecto citotóxico de β, β-dimethylacrylshikonin en células de cáncer gástrico. células SGC-7901 se trataron con 2,5, 5, 7,5, 10 mmol /L de β, β-dimethylacrylshikonin durante 24 h y 48 h, la reducción de la viabilidad de las células tratadas con β, β-dimethylacrylshikonin fue 92,41 ± 6,06%, 76,49 ± 3,18%, 67,19 ± 1,82%, y 61,76 ± 0,18%, respectivamente, a las 24 h en comparación con las células tratadas con vehículo (Fig. 1B). Para el tratamiento de 48 h, la viabilidad celular fue 52,03 ± 9,45%, 38,99 ± 1,43%, 30,70 ± 1,58%, y 27,4 ± 0,31% (Fig. 1B). La máxima concentración inhibitoria media (IC
50) de β, β-dimethylacrylshikonin para las células SGC-7901 era de 11,04 M y 2,89 M a las 24 h y 48 h, respectivamente.
β, β-Dimethylacrylshikonin induce SGC -7901 células apoptosis
células SGC-7901 fueron tratados primero con β, β-dimethylacrylshikonin, los resultados mostraron que las células fueron sometidas a marcados cambios morfológicos tras el tratamiento con 10 mmol /L β, β-dimethylacrylshikonin en comparación con el control no tratado para 24 h. En presencia de β, β-dimethylacrylshikonin, el número de células SGC-7901 reduce y las células se convirtió en redondo y pequeño en forma, y se separe de la placa en comparación con el grupo de control negativo (Fig. 2A). β, β-dimethylacrylshikonin también indujo condensación nuclear con DAPI intensiva en comparación con el nuclear de células SGC-7901 de control durante 24 h (Fig. 2B). Se detectó
(A) la morfología de la célula mediante el uso de un microscopio invertido con 200 × magnificación. (B) la condensación del ADN (flecha blanca) se midió por tinción DAPI y se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia con 200 x aumentos. (C) El estado de apoptosis se evaluó mediante ensayo de unión de Anexina V-FITC. La parte inferior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
-) fue considerado como la etapa temprana de las células apoptóticas y parte superior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
+) se consideró como la fase crónica de células apoptóticas. La parte izquierda inferior (Anexina V-FITC
- /PI
-) se consideró como células viables y la parte superior izquierda (Anexina V-FITC
- /PI
+) se consideró como necrótico las células.
para determinar si la citotoxicidad de β, β-dimethylacrylshikonin involucrada la apoptosis, se evaluó el efecto apoptótico de β, β-dimethylacrylshikonin en las células SGC-7901 por citometría de flujo de Anexina V y yoduro de propidio ( PI) tinción. El porcentaje de células apoptóticas tempranas (Anexina V
+ /PI
-) fue de 1,6%, 7,2%, 18,1%, 24,3% y 24,4% en respuesta al vehículo, 2,5, 5, 7,5, y 10 mol /L β, β-dimethylacrylshikonin respectivamente durante 24 h (Fig. 2C). Curiosamente, las células apoptóticas tardías (Anexina V
+ /PI
+) fueron significativamente superiores en las células SGC-7901 (29,7% con 7,5 mol /L y 33,6% con 10 mmol /L β, el tratamiento β-dimethylacrylshikonin ) (Fig. 2C).
β, β-dimethylacrylshikonin induce eventos mitocondriales asociadas con la apoptosis en las células SGC-7901
proteínas Bcl-2 la familia incluyen proteínas pro-apoptóticos (Bax, Bak y bid) y las proteínas anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, la CIAP-2, XIAP y survivin). Ellos pueden activar o inhibir la liberación de factores de aguas abajo que conducen a la activación de caspasa-3 y PARP en la ejecución de la apoptosis [20]. Con el fin de detectar las proteínas relacionadas con la apoptosis, proteínas pro-apoptóticas (Bax, Bak) y proteínas anti-apoptóticas (XIAP, CIAP-2, Bcl-2, Bcl-XL, survivina) fueron detectados por Western Blot después de SGC-7901 las células se trataron con diferentes concentraciones de β, β-dimethylacrylshikonin (0, 2,5, 5, 7,5 y 10 mol /L) durante 24 h. Los resultados indicaron que β, β-dimethylacrylshikonin disminuir la expresión de XIAP, CIAP-2, Bcl-2 (Fig. 3A). Sin embargo, la baja regulación de XIAP y Bcl-2 fueron menos pronunciadas, mientras que la baja regulación de la CIAP-2 fue muy dramática y dependiente de la dosis. No hubo ningún cambio significativo de Bcl-XL y survivn en las células SGC-7901. Ya sea β, β-dimethylacrylshikonin puede modular la expresión de las proteínas pro-apoptóticas (Bax, Bak) también se examinó. Se encontró que el β, β-dimethylacrylshikonin aumento de la expresión de Bak de una manera dependiente de la dosis, pero tuvo poco efecto sobre Bax (Fig 3B).
análisis de transferencia Western de las proteínas anti-apoptóticas:. Bcl-2, Bcl-xL, la CIAP-2, XIAP y survivin (a), y las proteínas pro-apoptóticas: Bax, Bak (B), y PARP escindida, escinde la caspasa-9, se escindió de la caspasa-8, se escindió de la caspasa-3 (C) en extractos de células enteras después de las células SGC-7901 fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin para 24 h. Los niveles de proteína de la actina también se midieron como controles. (D) Detección del potencial de membrana mitocondrial mediante citometría de flujo. células SGC-7901 se trataron con o sin β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 24 h y se tiñeron con JC-1 durante 15 min a 37 ° C y se sometieron a citometría de flujo. (E) células SGC-7901 se fijaron y marcaron durante citocromo c (verde) y ADN (azul). células SGC-7901 (F) fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin en presencia o ausencia de Z-VAD-FMK (10 mmol /L) durante 24 h. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western usando anticuerpo contra la caspasa-3 escindida, PARP escindida. Los niveles de proteína de la actina también se midieron como controles. células SGC-7901 (G) fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin en presencia o ausencia de Z-VAD-FMK (10 mmol /L) durante 24 h. El estado de apoptosis se determinó por Anexina V-FITC ensayo de unión. La parte inferior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
-) fue considerado como la etapa temprana de las células apoptóticas y parte superior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
+) se consideró como la fase crónica de células apoptóticas. La parte izquierda inferior (Anexina V-FITC
- /PI
-) se consideró como células viables y la parte superior izquierda (Anexina V-FITC
- /PI
+) se consideró como necrótico las células.
proteínas familia de las caspasas son enzimas críticas para la ejecución de la apoptosis. Entre los miembros de la familia de la caspasa, caspasa-3 es un ejecutor clave para la apoptosis en células de mamífero [21]. Puede ser activado a través de la vía extrínseca mediada por receptores de muerte caspasa-8 y la mitocondria dependiente de la caspasa-9 vía intrínseca [22], [23]. Con el fin de comprender mejor el mecanismo molecular de la apoptosis, las células SGC-7901 fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin y se detectaron por análisis de transferencia de Western para el cambio de expresión de la caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9, los resultados mostraron una elevación dependiente de la dosis de la caspasa-3 escindido, escinde la caspasa-8 y se escindió, las células tratadas β-dimethylacrylshikonin caspasa-9 en β. la escisión de PARP, otra característica bien conocida de la apoptosis, también se encontró en β, las células tratadas β-dimethylacrylshikonin (Fig. 3C). La disfunción mitocondrial inducido apoptosis que es a menudo la consecuencia de una disminución del potencial de membrana mitocondrial. Se ha demostrado que es central para la ruta apoptótica. Las células SGC-7901 se trataron con o sin β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 24 h, los resultados mostraron mitocondrias potencial de membrana se redujo de 98,6% a 56,9% después de β, β-dimethylacrylshikonin se trató a la SGC- 7901 células (Fig. 3D). A continuación examinó la distribución y localización subcelular de citocromo c de encontrar si la vía está involucrada en las mitocondrias β, β-apoptosis inducida dimethylacrylshikonin. Después de células SGC-7901 fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 24 h, la distribución de citocromo c se visualizó con un microscopio láser confocal, las células tratadas β, β-dimethylacrylshikonin mostraron morfología borrosa (Fig. 3E) en contraste con el obviamente apariencia clara en las células de control, lo que indica la translocación de citocromo c de la mitocondria en el citoplasma en β, β-dimethylacrylshikonin células tratadas.
a fin de determinar el papel de la activación de caspasas en β, β-dimethylacrylshikonin- la apoptosis inducida, se trataron las células SGC-7901 con pan-inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK (10 mmol /L) antes de β, β-tratamiento dimethylacrylshikonin. El pan-inhibidor de caspasas Z-VAD-FMK pretratamiento disminuyó la expresión de la caspasa-3 escindida, PARP escindida y β reducida, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin (Figura 3F & amp;. G). Estos datos mostraron que la vía de la cascada de caspasas-mitocondrial mediada juega un papel muy importante en β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin
β, β-Dimethylacrylshikonin induce la activación de ERK sostenido. En las células SGC-7901
se ha demostrado que MAPK señalización implicadas en varios eventos de tensiones y estímulos celulares inducidos apoptosis de las células [24], [25]. tanto, nuestro estudio de la activación de ERK, JNK y p38 después de β, β-tratamiento dimethylacrylshikonin. Como se muestra en la Fig. 4A & amp; B, los niveles de fosforilación de ERK y JNK fueron aparentemente aumentó en respuesta a la β, β-tratamiento dimethylacrylshikonin durante 2 h, y los niveles de fosforilación exhibió una manera dependiente de la dosis. Además, los niveles de fosforilación de ERK últimas veinticuatro horas. Sin embargo, no se observaron cambios significativos de los niveles de fosforilación de p38 después de la β, β-tratamiento dimethylacrylshikonin (Fig. 4C). Estos resultados sugieren que la activación sostenida de la ERK está implicada en β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin en células SGC-7901.
células SGC-7901 fueron tratados con el β indicada, la concentración de β-dimethylacrylshikonin o el indicaron intervalo, los extractos celulares totales se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de las formas fosforiladas de ERK (a), JNK (B) y p38 (C). Las membranas se volvieron a sondar con anticuerpos contra total ERK, JNK y p38 para la normalización.
La vía de señalización de ERK está implicada en β, β-apoptosis inducida en células dimethylacrylshikonin SGC-7901
examinó a continuación si la β, β-dimethylacrylshikonin inducida por la activación sostenida de la vía de señalización de ERK juega un papel en la apoptosis. Como se muestra en la Fig. 5A & amp; B, ensayo de transferencia Western reveló que U0126 (un inhibidor de MEK específica) inhibió la activación de ERK sostenido y la escisión de la caspasa-3, PARP en β, el tratamiento β-dimethylacrylshikonin mientras que el inhibidor pan-caspasa Z-VAD-FMK no tuvo efecto sobre β, activación de ERK (Fig. 5D) β-dimethylacrylshikonin inducida. Además, U0126 reduce apoptosis β, β-inducida por dimethylacrylshikonin en células SGC-7901 (Fig. 5C). Estos resultados mostraron que β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin en células SGC-7901 están mediadas por la activación sostenida de la vía de señalización de ERK
.
(A) células SGC-7901 fueron pretratados o no pretratados con U0126 ( 10 mmol /L), entonces añadido con DMSO (vehículo) o β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 2 h, 24 h, respectivamente. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de ERK fosforilado. Los niveles de proteínas totales de ERK también se miden como controles. (B) células SGC-7901 fueron pretratados o no pretratados con U0126 (10 mmol /L), entonces añadido con DMSO (vehículo) o β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 24 h. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western usando anticuerpo contra la caspasa-3 escindida, PARP escindida. Los niveles de proteína de la actina también se midieron como controles. las células (C) SGC-7901 fueron tratados con β, β-dimethylacrylshikonin en presencia o ausencia de U0126 (10 mmol /L) durante 24 h. El estado de apoptosis se determinó por Anexina V-FITC ensayo de unión. La parte inferior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
-) fue considerado como la etapa temprana de las células apoptóticas y parte superior derecha (Anexina V-FITC
+ /PI
+) se consideró como la fase crónica de células apoptóticas. La parte izquierda inferior (Anexina V-FITC
- /PI
-) se consideró como células viables y la parte superior izquierda (Anexina V-FITC
- /PI
+) se consideró como necrótico Células. (D) células SGC-7901 se trataron previamente con o sin Z-VAD-FMK (10 mmol /L) se incubaron adicionalmente con β, β-dimethylacrylshikonin (10 mmol /L) durante 24 h. Los extractos de proteína se prepararon y se sometieron a ensayo de transferencia de Western para medir los niveles de ERK fosforilado. Los niveles de proteína de ERK también se midieron como controles.
Discusión derivados
shikonin son los componentes activos aislados de los chinos a base de hierbas Lithospermum erythrorhizon [5]. Estos compuestos son prometedores candidatos a fármacos, ya que se ha informado que tienen múltiples efectos anticancerígenos in vivo e in vitro [5], [26]. Entre los componentes de Lithospermum erythrorhizon, β, β-Dimethylaerylshikonin tiene importantes efectos anti-tumorales en comparación con otros ingredientes activos [27]. En lo que respecta a la actividad anti-cáncer, la apoptosis de células shikonin-renderizados través de la activación de la vía dependiente de caspasa se encuentra en muchos tumores malignos. En este estudio, se investigó el efecto de β, β-dimethylacrylshikonin sobre las células SGC-7901 de cáncer gástrico humano. Nuestros resultados indican que el tratamiento de células SGC-7901 con β, β-dimethylacrylshikonin mostró un efecto citotóxico significativo contra las células SGC-7901 en una dosis y manera dependiente del tiempo, y β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin en células SGC-7901 se evidenció por un aumento de las células apoptóticas (principios de Anexina V
+ /PI
-). y las células apoptóticas (finales de Anexina V
+ /PI
+)
La relación de anti-y la expresión de proteínas pro-apoptóticos, tales como Bcl-2 /Bax, es crucial para la inducción de la apoptosis, y que decida que la susceptibilidad de las células a experimentar apoptosis [28]. Las mitocondrias juegan un papel importante en la transducción de la señal de la apoptosis [29]. El translocalization de proteínas apoptóticas desde el citosol a las mitocondrias conduce a la liberación de citocromo c y segundo activador mitocondrias derivadas de las caspasas por una disminución en el potencial de membrana mitocondrial [30], [31]. Shiconina se ha informado de inducir apoptosis a través de vía de las mitocondrias en las células HepG2 [32]. En el presente estudio, hemos demostrado que β, β-dimethylacrylshikonin el regulado la expresión de XIAP, CIAP-2 y Bcl-2 y regulado hasta la expresión de Bak y Bax, y causó la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la liberación de citocromo c en las células SGC-7901, de acuerdo con la apoptosis dependiente de la mitocondria. La observación de β, β-dimethylacrylshikonin la activación de la caspasa-9, caspasa-3, y la posterior escisión de PARP, así como el resultado mediada que el pan-caspasa inhibidor Z-VAD-FMK reducida β, apoptosis β-dimethylacrylshikonin inducida en las células SGC-7901, lo que sugiere que la cascada de caspasas vía mitocondrial mediada juega un papel clave en β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que β, β-dimethylacrylshikonin regula los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis, provoca la liberación del citocromo c y TRIGS celular muerte por apoptosis dependiente de caspasa.
proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK) regulan diversos programas celulares, incluyendo la embriogénesis, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [33]. Las proteínas de la familia MAPK se componen de tres proteínas quinasas: ERK1 /2 (quinasas extracelulares reguladas por señales 1 y 2), JNK (cinasa c-Jun N-terminal) y p38 [34], [35]. En general, la activación de ERK transitoria conduce a la proliferación celular, pero la activación sostenida de ERK se assoctiated con la diferenciación [36]. Nuevas evidencias sugieren que la activación de ERK contribuye a la apoptosis. Jeong et al. mostró que kaempferol causada celular de cáncer de someterse a la apoptosis a través de una vía de ERK-dependiente [21], [37], [38]. Recientemente, se ha informado de que icaritin induce la inhibición del crecimiento y la apoptosis en PSMCs humanos a través de la vía de señalización de ERK [39]. Li et al. demostró que la activación de la vía de señalización /MEK /ERK RAF desempeña un papel fundamental en la apoptosis inducida por calcio de células epiteliales del cristalino [40]. Aquí también encontramos que la activación sostenida de ERK está implicada en β, la inhibición del crecimiento inducida por β-dimethylacrylshikonin y la apoptosis en células SGC-7901. U0126, un inhibidor específico de MEK (MAPK /ERK quinasa), β efectivamente bloqueado, β-dimethylacrylshikonin inducida por la activación de ERK y β atenuada, la apoptosis β-dimethylacrylshikonin inducida, lo que sugiere los efectos pro-apoptóticos de β, β-dimethylacrylshikonin en células SGC-7901 están mediados por la activación sostenida de la vía ERK1 /2 señalización.
en conclusión, se encontró que β, β-dimethylacrylshikonin inhibió el crecimiento celular y la apoptosis inducida en células SGC-7901. También estudiamos los mecanismos subyacentes implicados en β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin. Nuestros resultados indican que β, apoptosis β-dimethylacrylshikonin inducida implica en la reducción de XIAP, CIAP-2, y Bcl-2 expresión de la proteína y la inducción de la expresión de la proteína Bak y Bax, y causaron la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y liberación de citocromo c en las células SGC-7901. Nuestros resultados también demostraron que β, β-apoptosis inducida dimethylacrylshikonin implica la activación de la caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9 y la escisión de PARP. Además, ERK vía de señalización también participó en β, la apoptosis inducida por β-dimethylacrylshikonin. Nuestros resultados indican que β, β-dimethylacrylshikonin podría ser desarrollado como un agente anticancerígeno potencial contra el cáncer gástrico humano.
Reconocimientos
Nos gustaría agradecer a H-BW para su asistencia técnica y también gracias X -QM y J-HC útil para los comentarios sobre este artículo.