Extracto
Antecedentes
El cáncer de próstata es una enfermedad común y heterogéneo, donde la señalización del receptor de andrógenos (AR) desempeña un papel fundamental en el desarrollo y progresión. El tratamiento inicial para cáncer de próstata avanzado es la supresión de la señalización de andrógenos. Más tarde, esencialmente todos los pacientes desarrollan una etapa independiente de andrógenos que no responde a tratamiento anti hormonal. Por lo tanto, se requieren estrategias alternativas dirigidas a nuevos mecanismos moleculares. β-TrCP es una ligasa E3 que se dirige a diversos sustratos esenciales para muchos aspectos de la tumorigénesis.
Metodología /Principales conclusiones
Aquí nos muestran que β-TrCP agotamiento suprime el cáncer de próstata y de identificar a un crecimiento relevante mecanismo de control. shRNA dirigido contra β-TrCP redujo el crecimiento de células de cáncer de próstata y cooperó con la ablación de andrógenos
in vitro
y
in vivo
. Se encontró que la inhibición de β-TrCP conduce a la regulación positiva del receptor de aril hidrocarburos (AHR) la mediación del efecto terapéutico. Este fenómeno podría ser ligando independiente, como el ligando de AhR 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) no alteró el crecimiento de células de cáncer de próstata. Se detectó la expresión de Ahr alta y la activación de células basales y células epiteliales de cáncer atróficas teniendo próstatas humanas. expresión Ahr y la activación es también significativamente mayor en las células tumorales en comparación con el epitelio glandular benigno.
Conclusiones /Importancia
En conjunto, estas observaciones sugieren que la activación de AhR puede ser un mecanismo cáncer de contrarrestar en la próstata. Mantenemos que la combinación de la inhibición de β-TrCP con la ablación de andrógenos podría beneficiar a los pacientes con cáncer de próstata avanzado
Visto:. Gluschnaider T, G Hidas, Cojocaru G, Yutkin V, Ben-Neriah Y, Pikarsky E (2010) β- la inhibición de próstata Reduce TrCP crecimiento de células cancerígenas a través de la regulación al alza de los receptores de hidrocarburos arilo. PLoS ONE 5 (2): E9060. doi: 10.1371 /journal.pone.0009060
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 21 Octubre, 2009; Aceptado 16 de enero de 2010; Publicado: 5 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Gluschnaider et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la doctora Miriam y Fundación de Investigación médica Sheldon G. Adelson, Prostate Cancer Foundation - la Fundación de Investigación del cáncer de próstata Israel y. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el sexto cáncer más común en el mundo y la tercera causa más común de cáncer en hombres. En los países desarrollados, el cáncer de próstata se desarrolla en uno de cada nueve hombres mayores de 65 años. Esta es una enfermedad heterogénea en cuanto a su evolución clínica y el resultado, pero la señalización de andrógenos parece ser una característica común en su desarrollo y progresión [1]. AR señalización es conocido para regular las células de próstata normales, benignas y cancerosas en diversos procesos de diferenciación y proliferación (por ejemplo). Además, existen observaciones que indican que la expresión de AR es oncogénica en el epitelio de la próstata y promueve la progresión a la independencia de andrógenos [2] - [8]. El tratamiento inicial de la etapa avanzada y el cáncer de próstata metastásico es la supresión de la producción de andrógenos por las drogas específicas o la castración quirúrgica. Más tarde, esencialmente todos los pacientes desarrollan una etapa independiente de andrógenos que no responde a tratamiento anti hormonal. La última fase es siempre letal; por lo tanto, se requieren estrategias alternativas dirigidas a nuevos mecanismos moleculares.
El sistema de la ubiquitina-proteasoma es un determinante crucial de casi todos los procesos biológicos en los eucariotas. En esta vía, las proteínas son objeto de degradación por la ligadura covalente de ubiquitina, una pequeña proteína altamente conservada. ubiquitinación de proteínas implica la acción concertada de la enzima E1 ubiquitina-activación, una enzima ubiquitina-E2 conjugación de ubiquitina y una proteína ligasa E3, la última de las cuales ofrece múltiples moléculas de ubiquitina a la proteína diana [9] - [11]. La inhibición de toda la vía ubiquitina proteasoma tiene valor terapéutico en el cáncer (por ejemplo bortezomib, [12]). Sin embargo, ya que los inhibidores del proteasoma tienen efectos pleiotrópicos, la inhibición de una sola E3 clave puede ofrecer una opción más específica tratamiento con menos efectos secundarios.
Beta-transducina repeticiones que contienen proteínas (β-TrCP) sirven como el reconocimiento de sustrato subunidades de la SCF
β-TrCP ubiquitina ligasas E3. Estos sustratos fosforilados ligasas ubiquitinate específica y juegan un papel fundamental en la regulación de la división celular y diversas vías de transducción de señales, que a su vez, son esenciales para muchos aspectos de la tumorigénesis [13]. Hay dos genes β-TRCP en los genomas de mamíferos que codifican para las dos proteínas altamente redundantes ß-TRCP1 y β-TrCP2. En los últimos años, diversos sustratos? -TrCP Que participan en diferentes vías normales y malignas fueron descubiertos [14] - [23]. Dos bien caracterizadas
de buena fe
sustratos son beta-catenina y I? B. La degradación de este último libera NF-kappa B para entrar en el núcleo e inducen la transcripción [11], [24] - [27]. Por otra parte, β-catenina es fosforilada, directamente reconocido por β-TrCP y degradada por el proteasoma [24]. Por lo tanto, β-TrCP tiene efectos sobre dos vías oncogénicas clave opuestas. Si bien el papel de β-catenina en el cáncer de próstata es controvertido [28], [29], existe evidencia que sugiere que NF-kB juega un papel pro-tumorigénicos en el cáncer de próstata [30] - [32]. El efecto opuesto en estas dos proteínas oncogénicas ejemplifica la versatilidad de esta ligasa E3 particular. Por otra parte, β-TrCP está directamente implicado en varios tipos de cáncer [33] - [36], por lo que es plausible para investigar aún más su papel en el cáncer de próstata
En este trabajo, nos muestran que la inhibición β-TrCP. inhibe el crecimiento del cáncer de próstata que muestra el efecto aditivo con la ablación de andrógenos,
in vitro
y
in vivo
. Este efecto está mediado en gran parte a través de la activación del receptor de aril hidrocarburos (AHR) como derribando esta proteína suprime el efecto de la inhibición de β-TrCP.
Resultados
NF-kB de activación se correlaciona con el cáncer de próstata Resultado de los pacientes
β-TrCP es un importante ligasa E3 conocido para regular muchos sustratos diferentes. NF-kappa B es un factor de transcripción bien caracterizado regulada negativamente por I? B, por tanto, indirectamente modula positivamente por β-TrCP. La participación de NF-kB en el cáncer de próstata es bien investigado y estudios anteriores mostraron su papel tumorigénico en la próstata. También hay reciente indicación para la participación de NF-kappa B en la progresión del cáncer de próstata a la etapa independiente de andrógenos [37]. Con el fin de corroborar la relevancia de este factor a la progresión del cáncer de próstata, hemos probado su estado de activación en las muestras de cáncer de próstata humanos primarios usando tinción inmunohistoquímica con anticuerpos contra p65 (Figura 1A). Se analizaron 131 muestras de cáncer de próstata, manchado en una sola diapositiva de microarrays de tejidos de pacientes con diferentes grados de Gleason. 39% de las muestras mostró al menos algunos p65 núcleos positivos (Figura 1B). También se analizaron 14 metástasis de cáncer de próstata, el 64% de los cuales fueron positivos (Figura 1A, B). Nos propusimos evaluar la correlación entre la puntuación de Gleason cáncer de próstata y la activación de NF-kB. De hecho, hemos observado una asociación entre los dos (p = 0,014, prueba exacta de Fisher). Al parecer, NF-kB tinción nuclear fue más fuerte en los pacientes con mayor grado de Gleason o en las metástasis que plantea la posibilidad de que la activación de NF-kB podría correlacionarse con el pronóstico. Para probar esta posibilidad, se immunstained 80 tumores primarios de p65, a partir de pacientes que fueron sometidos a prostatectomía radical y para los que tuvimos el seguimiento clínico. El 77% de los pacientes cuyas muestras de tumor primario con tinción negativa para p65 nuclear, no mostró recurrencia de hasta 8 años de prostatectomía radical posterior. En contraste, la enfermedad recurrió en el 65% de los pacientes positivos NF-KB (Figura 1C). Otro sustrato β-TrCP pro-oncogénica importante es β-catenina. Dado que la inhibición β-TrCP mejoraría la estabilidad de β-catenina y promover la tumorigénesis, era necesario controlar también correlación β-catening con el resultado de cáncer de próstata pacientes. localización nuclear de β-catenina activación no se correlacionó con la gravedad de la enfermedad en la misma cohorte de pacientes (Figura S1). En conjunto, estos resultados implican una ventaja clínica para la inhibición de β-TrCP en el cáncer de próstata. Sin embargo, la multitud de sustratos? -TrCP (37, con posiblemente más para ser identificado) se opone a un análisis exhaustivo de todos ellos de la misma manera, y hace necesario un enfoque directo para estudiar la utilidad de la inhibición de β-TrCP en el cáncer de próstata.
secciones de cáncer de próstata se immunostained utilizando anticuerpos p65. A. microfotografías representativas de un tumor primario (izquierda) y la metástasis de los ganglios linfáticos (derecha) del mismo paciente. B. Porcentaje de casos negativos, positivos y fuertemente positivas descubierto en un microarray de tejido de las puntuaciones de Gleason indicados (p = 0,0014, prueba exacta de Fisher). Los tumores primarios de próstata C. (n = 131) fueron immunostained para p65 y evaluados para la actividad de NF-kB. De Kaplan-Meier parcela reveló una correlación entre el estado de NF-kB y el riesgo de recurrencia de la enfermedad. Azul, muestras fuertemente manchados; muestras de color rojo, débilmente manchados; , muestras negativas verdes teñidas (p = 0,02).
β-TrCP inhibición reduce el cáncer de próstata el crecimiento celular
A continuación examinó el efecto de la inhibición de β-TrCP sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata . Con este fin, se construyó un vector lentiviral inducible shRNA doxiciclina específicamente tanto β-β-TRCP1 y TrCP2 con la que transduced las dos líneas humanos sensibles a los andrógenos cáncer de próstata, células LNCaP y LAPC4. doxiciclina tratamiento de las células LNCaP trasnduced resultó en golpe eficaz hacia abajo de ambos genes? -TrCP (85% y 75% para β-TRCP1 y β-TrCP2, respectivamente) como se determina utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT PCR - Figura 2A). Esto fue acompañado por la estabilización de I? B? Tanto antes como después de la estimulación TNF, lo que demuestra la inducción eficiente de la proteína en la regulación (Figura 2B). Para evaluar la consecuencia de β-TrCP llamas en las células del cáncer de próstata, que supervisó las células tratados con doxiciclina y LNCaP no tratadas durante nueve días y el crecimiento celular medido
in vitro
. La figura 2C muestra el crecimiento celular disminuida después de que cualquiera de inhibición de β-TrCP o de tratamiento de ablación de andrógenos (paneles inferiores izquierda y superior derecha, respectivamente). Por otra parte, la combinación de la inhibición de β-TrCP con la ablación de andrógenos muestra un efecto aditivo (Figura 2C panel inferior derecho y la Figura 2D). A continuación se cuantificó el crecimiento celular usando el método XTT y confirmamos nuestro análisis morfológico (Figura 2D). Se obtuvieron resultados similares con células LAPC4 (Figura S2).
células LNCaP fueron infectadas con un vector lentiviral que lleva una doxiciclina inducible dependiente de β-TrCP shRNA. A. Las células se trataron durante 72 horas con 1 mg de doxiciclina /ml y los niveles de ARN de β-TRCP1 y β-TrCP2 se midieron usando QRT PCR. El análisis de transferencia Western B. de extractos de proteínas de las células tratadas con TNF, doxiciclina o MG-132 se immunoblotted, ya sea con o I? B tubulina. microfotografía C. Representante de las células tratadas como se indica y se tiñeron con hematoxilina y eosina. ensayo XTT D. utiliza para cuantificar el crecimiento de células a diferentes puntos de tiempo. DOX, doxiciclina; NT, no tratamiento; FCS, medio acondicionado que contiene suero de ternera fetal; CSS, que contiene medio acondicionado de andrógenos suero agotado (carbón suero depurado). Las barras de error, Dakota del Sur. * Significativamente diferente de las células no tratadas y el uno del otro, p-valor. & Lt; 0,01, prueba t
Para descartar shRNA desactivar los efectos de destino, se utilizó un constructo dominante negativo anteriormente descrito β-TrCP que carece de la F-caja de dominio [33]. Esta variante se estabiliza sustratos β-TRCP ya que se une a los objetivos fosforilados, pero no para reclutar los componentes adicionales del complejo SCF que son críticos para la actividad catalítica E3 ligasa. Los β-TRCP efectos de inhibición utilizando la forma negativa dominante, eran esencialmente similares a los resultados shRNA (Figura S3 A y B).
β-TrCP inhibición coopera con ablación de andrógenos
En Vivo
a fin de analizar el efecto de la inhibición de β-TrCP sobre el crecimiento tumoral del cáncer de próstata humano, se utilizó un modelo de xenoinjerto. Inyectamos células LNCaP que lleva una inducible β-TrCP shRNA construir en el tejido subcutáneo de 39 inmunosuprimidos
Balb /c Rag1
- /- ratones machos. 25 de los ratones (64%) desarrollaron tumores visibles y medibles después de la inyección de 30 días. Dado que el desarrollo del tumor inicial fue algo heterogéneo en el tamaño y la cinética, se dividió aleatoriamente estos 25 ratones en cuatro grupos de tratamiento: 1. ratones Intacto sin tratar (NT, n = 4; el volumen del tumor 123,1 ± 70,7 media); 2. Los ratones que recibieron la tetraciclina en el agua potable resulta en la inhibición β-TrCP (Tet, n = 5; volumen del tumor 80,3 ± 98,2 media); 3. Los ratones castrados resultantes en la ablación de andrógenos (Cast, n = 7; el volumen del tumor 121,6 ± 95,0 media); 4. La castración más tetraciclina (Tet moldeada +, n = 8, con una media del volumen del tumor 180,3 ± 143,9). No hubo diferencia significativa en el tamaño medio del tumor al inicio del tratamiento entre los cuatro grupos. Hemos supervisado el crecimiento del tumor una vez por semana, y se sacrificaron los ratones 30 días después del tratamiento inicial. ARN extraído de los tumores de los ratones tratados mostraron Tet β-TrCP derribar que van desde 50% a 80% (Figura 3A). Similar a nuestros
in vitro
hallazgos en, la inhibición de β-TrCP redujo el crecimiento del tumor con o sin ablación de andrógenos (Figura 3B). Análisis de la proliferación tumoral usando BrdU inmunotinción reveló que los ratones tratados tanto con la ablación de andrógenos y la inhibición β-TrCP mostró las tasas de proliferación más bajas (Figura 3C y la figura S4). la supresión del crecimiento del tumor no pudo ser explicada a través de la apoptosis, ya que contra exfoliados caspasa-3 inmunotinción no reveló diferencias entre los grupos de tratamiento (Figura 3D). Se obtuvieron resultados similares con células de cáncer de próstata de rata AT2.1 transfectadas de forma estable con un transgén β-TrCP negativo dominante inducible (Figura S2B). En conclusión, nuestros resultados indican que la inhibición de β-TrCP suprime el crecimiento del cáncer de próstata, tanto
in vitro
y
in vivo
y muestra un efecto aditivo con la ablación de andrógenos.
células LNCaP que lleva un constructo β-inducida TrCP shRNA tetraciclina se inyectaron por vía subcutánea a inmunosuprimidos
Rag1
- /- ratones. Los ratones (n≥4 en cada grupo) se dejaron sin tratar (NT), tratados con tetraciclina en el agua de bebida (Tet), castrados físicamente (fundido) o ambos (Cast + Tet) durante 30 días. Los volúmenes tumorales se midieron semanalmente. (UN). QRT PCR para ambas isoformas? -TrCP se realizó en ARN extraído de los tumores recogidos en el día 30. cinética (B) el crecimiento tumoral. Las secciones de tejido se tiñeron para BrdU (C) o activado caspasa 3 (D) y las puntuaciones de proliferación y apoptosis, respectivamente, se determinaron para cada tumor. Mostrados son la media ± desviación estándar (A) o ± E.E.M (B, C y D) * valor de p. & Lt; 0,05, ** p-valor = 0,0002, prueba t; p-valor de C se refiere a la prueba t.
Hidrocarburo de Aril receptor (AHR) está regulada positivamente en β-TrCP inhibición y la ablación de andrógenos
Para dilucidar las vías moleculares que son responsables para el efecto inhibidor del crecimiento de agotamiento de β-TrCP en combinación con la ablación de andrógenos se realizó una amplia gama de análisis de microarrays. células LAPC4 infectadas con el vector lentiviral shβ-TrCP, se dejaron sin tratar o tratadas durante 72 horas con doxiciclina, suero tratado con carbón vegetal o ambos. cDNA muestras se sometieron a análisis de microarrays de Affymetrix se U133 el uso de chips de sondeo ~30,000 sonda fija. Luego trató de identificar los genes que están afectados por cooperativamente tanto ablación de andrógenos y la inhibición de β-TrCP. Entre los genes upregulated, eran posibles genes anti inflamatorios (por ejemplo ANXA1) y entre los genes específicos prominente downregulated fueron la próstata (por ejemplo KLK2). Sin embargo, el aumento más espectacular fue la expresión del receptor de aril hidrocarburos (dioxina) (AHR). Este gen se reguló a la inhibición ya sea ablación androgénica o β-TrCP y fue el gen más a grandes cambios, debido al tratamiento combinado (Figura 4). Podríamos atribuir Ahr regulación al alza de nivel? -TrCP Agotamiento, ya que la doxiciclina por sí sola no alteró ARNm del receptor (Figura S5).
A. células infectadas con LAPC4 inducible β-TrCP shRNA fueron tratados durante 72 horas con el tratamiento indicado, se somete a la extracción de RNA y análisis de microarrays de ADNc (Affymetrix). Después de la normalización de datos, los perfiles de expresión de genes se compararon entre el tratamiento y las muestras de control sin tratar. A. El calor mapa dendrograma que muestra los diez más altamente arriba (rojo) y hacia abajo (verde) regulan los genes debido al tratamiento combinado. Doble cambio se refiere a las sondas de tratamiento combinado valores relativos de controlar. Expresión de las isoformas? -TrCP Se presenta a continuación. células B. LAPC4 infectadas con el mismo vector lentiviral y se tratan como se indica fueron sometidos a extracción de ARN y análisis de QRT PCR con los cebadores enumerados. CSS, carbón despojado suero; DOX, doxiciclina; Las barras de error, Dakota del Sur.
El Ahr es un ligando activado factor de transcripción implicado en la organogénesis, en la detoxificación de xenobióticos y endo y en la mediación de diversas respuestas tóxicas órgano-específicas de las dioxinas. Este receptor pertenece a la helix- bucle-hélice (bHLH) /PAS (receptor de hidrocarburos Período-arilo-mente individual translocador nuclear) de la familia de los reguladores de la transcripción heterodiméricos. proteínas bHLH /PAS están involucrados en el control de diversos procesos fisiológicos tales como los ritmos circadianos, el desarrollo de órganos, la neurogénesis, el metabolismo y la respuesta al estrés a la hipoxia [38] - [40]. Estudios recientes revelaron una conexión entre la vía y el cáncer de próstata Ahr tanto
in vitro
y
in vivo
, lo que demuestra que la Ahr interactúa e inhibe la AR. Por otra parte, la Ahr actúa como una ligasa E3 de la AR [41] y Ahr
TRAMP ratones nulos
muestran incremento tumorigénesis de próstata [42]. Utilizamos QRT PCR para validar el análisis de cDNA array. Se encontró que mientras que cada tratamiento solo aumentó los niveles de ARN Ahr más de 2 pliegues, el tratamiento combinado resultó en más de 4 veces en la regulación por incremento tanto LAPC4 (Figura 4B) y las células LNCaP (Figura S6). Para probar la actividad funcional de la vía Ahr medimos los niveles de mRNA de su objetivo canónica 1A1 del citocromo P450 (CYP1A1). Nuestros análisis muestran que los niveles de CYP1A1 se incrementaron en correlación con los niveles de AhR en los 4 grupos de tratamiento (Figura 4B). Cabe señalar que esta regulación al alza se produjo sin adición de un ligando de AhR exógeno. La adición de la potente ligando de AhR TCDD upregulation CYP1A1 aumentada aún más (Figura 5C y datos no presentados).
células LNCaP infectadas con un vector lentiviral inducible para shahr solo (A) o junto con shβ-TrCP (B) eran tratadas durante 72 horas con los tratamientos y el crecimiento celular indicado se midió mediante el ensayo XTT. C. QRT-PCR confirmó β Ahr TrCP y eficiente derriban. D. Las transferencias Western que muestra la estabilización de β-catenina-β después de la inhibición TrCP y que confirman la elevación nivel de proteína AHR o derribar a causa de shRNAs pertinentes. DOX, doxiciclina; FCS, suero de ternero fetal; CSS, tratado con carbón vegetal suero. Las barras de error, Dakota del Sur.
El efecto de suprimir el crecimiento de β-TrCP La inhibición es mediada a través de la regulación al alza de Hidrocarburo de Aril receptor
Para investigar la importancia de la activación de la vía Ahr siguiente β- TrCP agotamiento, primero se infectaron células LNCaP con inducible shRNA Ahr. Mientras que el tratamiento doxiciclina dio como resultado niveles de mRNA Ahr reducidos no hemos podido detectar ningún efecto sobre el crecimiento celular (Figura 5A). A continuación las células LNCaP que llevan inducible β-TrCP shRNA con el vector inducible shRNA Ahr coinfectados. La adición de doxiciclina al medio de desmontables células dobles resultó en la reducción de los niveles de β-TrCP de ARNm, similares a los desmontables células individuales; sin embargo, como era de esperar, en estas células Ahr niveles se redujeron más que aumentaron tanto en los niveles de ARNm y proteínas (Figura 5C, D). Por lo tanto, las células dobles desmontables se nos permite analizar si el efecto inhibidor del crecimiento de la modulación β-TrCP está mediada a través de la regulación positiva Ahr. De hecho, en las células LNCaP desmontables dobles, el agotamiento de β-TrCP no pudo reducir el crecimiento celular, ya sea con o sin ablación de andrógenos (Figura 5B). Se obtuvieron resultados similares con un diferente shRNA dirigido contra la AHR (datos no mostrados). Curiosamente, la adición de ligando exógeno potente TCDD no redujo el crecimiento celular solo; ni había un efecto con cualquiera de los diferentes tratamientos (Figura S7). Esto sugiere que este efecto es Ahr ligando independiente. Western blot confirmó la estabilización de β-catenina y la regulación al alza Ahr ARNm de la inhibición β-TrCP (Figura 5C). Por lo tanto, los resultados dobles desmontables indican que la mayor parte del efecto de la β-TrCP caída está mediado por la regulación positiva de la AHR.
Ahr expresión en cáncer de próstata Los pacientes
Observación de Ahr upregulation en β-TrCP inhibición en células de cáncer de próstata nos llevó a inspeccionar el estado de Ahr en varias etapas de cáncer de próstata. Para abordar este objetivo, se recogieron 39 muestras de tumores de cáncer de próstata primarios del Centro Médico Hadassah. Fuera de esta cohorte, 17 pacientes sufrieron de recurrencia de la enfermedad. Se realizó tinción immunohitochemical contra Ahr Ahr y monitoreados expresión citoplasmática y nuclear. En primer lugar, se detectó alta Ahr en las células basales, situados en el perímetro de la glándula benigna (Figura 6A). Curiosamente, atrofia proliferativa inflamatoria (PIA), considerado como una lesión precursora del cáncer de próstata mostró muy fuerte citoplásmica y tinción nuclear (Figura 6B). Se utilizó una puntuación subjetiva de 0 a 3 para cuantificar la intensidad de tinción en las células epiteliales normales y malignos en cada muestra. Nuestro análisis demuestra la regulación positiva de Ahr, tanto en los lugares citoplásmicos y nucleares en el epitelio maligno (Figura 6C, D, P & lt; 0,001, prueba de Mann-Whitney). Sin embargo, no se observó una correlación entre la expresión de Ahr en las células tumorales y recurrencia de la enfermedad (datos no mostrados).
secciones de próstata se immunostained con un anticuerpo Ahr. Las microfotografías muestran una expresión fuerte Ahr en las células basales (flechas en A) y atrofia inflamatoria proliferativa (B). C. expresión Ahr superior se observó en las glándulas malignas (t) en comparación con las glándulas normales (N). D. normal y glándulas malignas fue evaluado utilizando una escala de 0-3. Los valores medios ± E.E.M. se muestra (valor de p & lt; 0,001, prueba de Mann-Whitney).
Discusión
El cáncer de próstata es una enfermedad heterogénea que comprende muchas características genéticas y fenotípicas. Un sello distintivo importante de cáncer de próstata es la progresión a una fase independiente de andrógenos (AI) después del tratamiento hormonal. Las causas de esta transición no se entienden completamente y se requieren tratamientos adyuvantes fortificantes manipulación hormonal. Un factor que a menudo está implicada en la progresión del tumor en muchos tipos de cáncer es NF-kB. Aquí se confirma que NF-kB se activa con frecuencia en pacientes con cáncer de próstata avanzado (Figura 1). Por otra parte, la activación de NF-kB se correlaciona con la recurrencia del cáncer de próstata (Figura 1C). Uno de los principales reguladores de NF-kB es la ubiquitina ligasa E3 SCF
β-TrCP, que se dirige a I? B, así como muchos otros sustratos para la ubiquitinación y degradación, [27]. ? -TrCP se cree que desempeñan un papel pro-tumorigénicos en ciertos tipos de cáncer [43]. Sobre la base de la regulación positiva observada de NF-kappa B, que era importante seguir otra β-TrCP sustrato, β-catenina pro-oncogénica común, que también estuvo implicado en el cáncer de próstata [28], [29], [44]. Sin embargo, no hemos podido detectar una correlación entre la activación de β-catenina y la recurrencia del cáncer de próstata (Figura S1), lo que sugiere que los objetivos sólo algunos? -TrCP Son de relevancia para el avance de la enfermedad. Para evaluar el alcance completo de los efectos? -TrCP, Nos dispusimos a inhibir β-TrCP en células de cáncer de próstata y para vigilar su efecto sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata. Nuestro
in vitro
y
in vivo
estudios revelaron que en el crecimiento de células de cáncer de próstata inhibición de β-TrCP se reduce. También pudimos detectar un efecto aditivo cuando se combinan la inhibición de β-TrCP con ablación de andrógenos (Figura 2 y 3). Para dilucidar los mecanismos de supresión del crecimiento por la inhibición de β-TrCP, se realizó un análisis de cDNA array y observamos una regulación al alza aditivo de la AHR (Figura 4). Ahr fue demostrado previamente para actuar como una ligasa E3 de la AR [41], que nos proporciona una posible relación con la señalización AR. Además, hemos observado que la expresión de Ahr es superior al combinar la ablación de andrógenos y la inhibición de β-TrCP. Por lo tanto, la hipótesis de que la regulación al alza de la AHR podría ser la mediación del efecto inhibidor del crecimiento de la caída β-TrCP en células de cáncer de próstata. Esta idea fue apoyada por los informes previos que demuestran un papel inhibidor de la vía de Ahr en el cáncer de próstata. Morrow
et al
mostró una inhibición del crecimiento dependiente de ligando de AhR en células LNCaP. Del mismo modo, otros estudios también han implicado el receptor de andrógenos en la inhibición del crecimiento Ahr [45], [46]. En nuestro estudio, derribando la AHR
per se
en las células LNCaP no alteró el crecimiento de células de cáncer de próstata (Figura 5A), lo que sugiere que los niveles basales de Ahr no ejercen un efecto inhibitorio a menos estimulada por ligando. Por otro lado aumentar la expresión de AhR a través de agotamiento de β-TrCP se asoció con supresión del crecimiento independiente de ligando considerable. Ahr agotamiento revirtió el efecto de supresión del crecimiento de β-TrCP caída, incluso en la ablación de andrógenos, lo que demuestra que Ahr regulación al alza, que también hemos señalado en otras condiciones de estrés (por ejemplo, la atrofia, la inflamación y la ablación de andrógenos) representa el efecto inhibidor β-TrCP (Figura 5). Curiosamente, la administración ligando no afectó el crecimiento celular a pesar de que hizo regular positivamente la expresión del CYP1A1 objetivo Ahr vía clásica. Estos resultados implican un ligando y vía de Ahr independiente CYP1A1 en células de cáncer de próstata.
Chesire
et al
identificó la AHR como un objetivo β-catenina putativo en las células LNCaP [47]. Como se muestra que β-TrCP agotamiento estabiliza β-catenina junto con la regulación al alza de Ahr (Figura 5D), es posible que la causa de la elevación Ahr tras el agotamiento β-TrCP es la estabilización β-catenina.
Nuestra Los estudios indican un nuevo ligando estrategia independiente de impulsar Ahr expresión como medios para suprimir el crecimiento del cáncer de próstata. Esta estrategia también puede ser eco en la historia natural del cáncer de próstata. Se encontró que Ahr normalmente se expresa en niveles bajos en el epitelio prostático células basales (citoplásmica y tinción nuclear, la Figura 6A) y es upregulated sustancialmente en las zonas de atrofia inflamatoria proliferativa (PIA), considerado una lesión precursora del cáncer (Figura 6B). Ahr activación en las células basales y atróficas puede por lo tanto ser considerado como un mecanismo contra el cáncer. Es posible que las señales microambientales inflamatoria son responsables de tal señalización inducida por estrés. Una mutación en un alelo de β-TRCP1 se identificó en un tumor de próstata humano en una pantalla sistemática de mutaciones de la vía de Wnt [48]. Sin embargo esta mutación es poco probable que tenga un efecto sobre la vía de NF-kappa B como el otro alelo y posiblemente ambos alelos β-TrCP2 eran de tipo salvaje. Del mismo modo, a nuestro conocimiento, se informó de que hasta ahora no la activación de mutaciones en la vía de NF-kappa B en los tumores de próstata humanos. Sin embargo, NF-kB conocido para mediar en la transformación maligna es upregulated constitutivamente en este tipo de tumor a través de múltiples mecanismos. Llegamos a la conclusión que las diferentes señales de estrés, incluyendo la inflamación, atrofia y la ablación de andrógenos regulan al alza la expresión de Ahr tanto en células normales y malignas de la próstata y llevar a cabo un mecanismo de protección. La inhibición de β-TrCP en etapas avanzadas de la enfermedad puede ser relevante en el desarrollo de estrategias para mejorar la eficacia de los tratamientos contra el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Los experimentos con tejidos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional, hebrea de Hadassah University Medical Center. Debido a la naturaleza retrospectiva de este estudio y de acuerdo con la declaración de Helsinki, los participantes fueron informados que no se obtiene constantemente. Además, nuestra IRB renunciado a la necesidad de consentimiento informado por escrito. Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el IACUC.
dominante negativo β-TrCP (WD)
dominante negativo β-TrCP (WD)
se clonó utilizando E3RS excluidos de pCDNA3 plásmidos -EE-hE3RS con los cebadores 5 'a 3' hacia adelante: GCGGCCGCTATGGACCC-GGCCGAG (con
NotI
sitio en su extremo 5 '); Reverso: TTATCTGGAGATGTAGGTGT; el producto se clonó en el vector TA (Invitrogen). El último vector se cortó con
AvrII /Asp718
, rellenado y romo se ligó. El fragmento relevante fue cortado y se insertó en el vector de expresión pFLAG-CMV ™ -2 (Sigma-Aldrich) con
NotI /BamHI
. Este procedimiento produjo una construcción carente de WD parte de la F-box y conjugado con FLAG. El WD-FLAG se inserta bajo el promotor bidireccional teracycline que expresan GFP. El plásmido resultante se transfectó en células de cáncer de próstata de rata que expresan la AT2.1 tetraciclina trans-activador, usando el reactivo de FUGENE (Roche Applied Science). Se seleccionaron las células transfectadas usando higromicina y neomicina (Sigma-Aldrich) que contiene medios para producir un clon estable que expresa un dominante negativo β-TrCP tras la adición de tetraciclina o su derivado doxiciclina.
inducible β-TrCP y Ahr shRNA
El humano shRNA 5'GUGGAAUUUGUGGAACAUC 3 'dirigido contra β-β-TRCP1 y TrCP2 se construyó en PTER plásmido y se inserta en un vector lentiviral pRRL.sin.PPT.tetO7.MCS.PRE modificado. El vector se compone de un promotor de HI, el operador tet, la secuencia de codificación shRNA y promotor eF1α conducir el represor tet fusionado a eGFP. La producción de virus y la infección se llevaron a cabo como se describe anteriormente [49]. Para hacer referencia a la AHR se utilizaron las siguientes secuencias: 1. shRNA 5 'CAGCUGAAUUAAAUAACAU 3'; 2. 5 'CAGACAGUAGUCUGUUAUA 3'. Ambos de los cuales resultó ser eficaz en derribar el receptor (los datos presentados representan los obtener con la última secuencia). se induce la expresión de shRNA solamente después de la administración de tetraciclina o doxiciclina (Sigma-Aldrich). El vector solo se utilizó como control. Doble derribado células LNCaP fueron diseñados por células shβ-TrCP coinfectantes con lentiviral vectores que llevan ya sea de la secuencia descrita anteriormente.
Cell Cultura y
DMEM, RPMI 1640, tripsina EDTA, penicilina solución de estreptomicina, L-glutamina, suero de ternera fetal (FCS), Carbón suero depurado (CSS) se adquirieron en Biological Industries, Beit Haemek Kibbutz, Israel.