Extracto
carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo. β-catenina, el Orchestrator central de la vía Wnt canónica y un oncogén conocido es de suma importancia en HCC patogénesis. La administración de fenobarbital (PB) que contiene agua (0,05% w /v) como promotor de tumores siguiente diethylnitrosamine inyección inicial intraperitoneal inyectado (IP) (DEN) (5 mg /g de peso corporal) como un inductor de tumor se utiliza comúnmente modelo para estudiar HCC en ratones. En este documento, nueve de quince días los ratones machos β-catenina knockout (KO) y quince controles de camada de tipo salvaje (WT) se sometieron a un tratamiento DEN /PB y se examinaron para la tumorigénesis hepática a los ocho meses. Paradójicamente, se observó una significativamente más alta carga tumoral en KO (p & lt; 0,05). Los tumores en KO eran β-catenina y la glutamina sintetasa negativo y HGF /Met, EGFR & amp; señalización RFIG no tenía nada especial. Se observó un aumento significativo en el PDGFRa y su ligando PDGF-CC que conduce a un aumento de fosfotirosina-720-PDGFRa en ratones KO portadores de tumores (p & lt; 0,05). Al mismo tiempo, estos hígados muestran un aumento de la muerte celular, la activación de las células estrelladas, fibrosis hepática y la proliferación celular. Además, PDGF-CC indujo significativamente la proliferación celular de hepatoma especialmente después de la supresión de β-catenina. Nuestros estudios también demuestran que el protocolo /PB DEN utilizado en la /6 ratones WT C57BL no seleccionó para mutaciones del gen β-catenina durante hepatocarcinogénesis. Por lo tanto, DEN /PB mejorada HCC en ratones que carecen de β-catenina en el hígado puede ser debido a su ineptitud en la regulación de la supervivencia celular, que conduce a fibrosis mejorada y la regeneración a través de la activación de PDGFR. β-catenina regulación a la baja también hizo células de hepatoma más sensibles a los receptores tirosina quinasas y por lo tanto pueden ser explotados para la terapéutica
Visto:. Awuah PK, Rhieu BH, Singh S, A Misse, Monga MSF (2012) β-catenina pérdida de hepatocitos promueve el cáncer hepatocelular después diethylnitrosamine y Fenobarbital administración a ratones. PLoS ONE 7 (6): e39771. doi: 10.1371 /journal.pone.0039771
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 27, 2012; Aceptado: 30-may de 2012; Publicado: 25 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Awuah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud subvenciones 1R01DK62277 (Instituto Nacional de Enfermedades digestivas y del riñón) y 1R01CA124414 (Instituto Nacional del cáncer) a SPSM y por el Fondo de Rango para la mejora de Investigación de Patología. P.K.A. fue financiado en parte por T32 EB001026 (Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común y la tercera causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. Hay una fuerte necesidad de delimitar las alteraciones moleculares responsables de la iniciación y la exacerbación de la enfermedad. Con el fin de estudiar las perturbaciones celulares y molécula en HCC, muchas estrategias preclínicos emplean el uso de modelos genéticos y químicos de la carcinogénesis. La administración de dietilnitrosamina (DEN) solo o en conjunto con fenobarbital (PB) en ratones se utiliza con frecuencia para inducir la HCC en ratones.
Una vía de importancia crítica en HCC es la señalización /β-catenina Wnt. β-catenina es el efector central de la señalización canónica de Wnt, que es una vía muy conservadas regulación de procesos celulares críticos, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y la auto-renovación [2], [3], [4], [5]. En ausencia de Wnt, β-catenina es fosforilada en la serina amino-terminal y los residuos de treonina y dirigido para la ubiquitinación [6]. Tras la unión de la proteína Wnt a su receptor de la superficie celular Frizzled y co-receptor lipoproteína de baja densidad proteína relacionada 5/6 (LRP5 /6), una señal es transducida a través despeinado que permite la inactivación del complejo de degradación de compuesto de glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3), poliposis adenomatosa producto del gen coli (APC) y la caseína quinasa Iα, que permite β-catenina se disocie y se translocan al núcleo para unirse al factor de célula linfoide potenciador de unión del factor /T familia (LEF /TCF) de las proteínas a transactivate genes diana. La vía /β-catenina Wnt se ha implicado en un subconjunto de HCC donde la activación de mutaciones en el gen de β-catenina (
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) se han reportado en 20% -40% de los pacientes [7], [8 ]. Desmontables de β-catenina en células de hepatoma conduce a la disminución del crecimiento y la supervivencia. Por las razones antes mencionadas, β-catenina es un oncogén bien reconocida y considerada como una diana terapéutica valiosa.
Con este telón de fondo, la hipótesis de que la falta de β-catenina en los hepatocitos podrían proteger contra la carcinogénesis inducida químicamente especialmente en un modelo en el HCC se concibe a través de la inducción de tumores por DEN y la promoción del tumor a través de la utilización continua de PB [9], [10]. Utilizamos ratones machos condicional específico de hepatocitos β-catenina knockout (KO) y los controles de la misma camada de tipo salvaje sexo similar (WT) para estudiar la tumorigénesis en respuesta a DEN /PB. Se presenta un aumento paradójico en la tumorigénesis hepática en ausencia de β-catenina, que se atribuyó a una lesión mayor, la fibrosis y la consiguiente regeneración, que parece estar impulsado por un lugar no clásica epitelial del receptor tirosina quinasa del receptor PDGFR. También demuestran que el uso del protocolo /PB DEN comúnmente empleado en ratones C57BL /6, la tumorigénesis no se produce a través de mutaciones β-catenina como se observa en ratones C3H. Por último, β-catenina inhibición conducir a la activación PDGFRa y por lo tanto puede hacer que las células de hepatoma más susceptibles a los receptores de tirosina quinasas de inhibición para las terapias.
Resultados
hepatocarcinogénesis
pérdida de β-catenina en los hepatocitos que engendra una mejora en ratones en respuesta a DEN /PB
WT y ratones machos KO (C57BL /6) se les dio una sola dosis (5 mg /gramo) de inyección de DEN en el día postnatal 14 días y dos semanas más tarde permitió
ad libitum
acceso a PB que contiene el agua potable durante 8 meses en la que se examinaron los ratones de tiempo para los tumores del hígado (fig. 1A). Curiosamente, los ratones que carecen de β-catenina en los hepatocitos que se muestran mejorado significativamente la tumorigénesis que los ratones WT que era extremadamente sensible como números más grandes y mayores de tumores (fig. 1B). Se empleó la tinción de E también para determinar los focos microscópicos de tumores en ambos grupos de animales; H & amp (figura 1C.). El número total de focos se contaron en las secciones representativas de cuatro lóbulos de la KO y WT, que muestran de manera significativa más tumores en KO en comparación con el WT (p & lt; 0,05) (Fig. 1D).
estrategia Experimental resumiendo el tratamiento DEN /PB en ratones KO y WT. A. fotografías representativas de los hígados portadores de tumores en DEN /PB trataron a ratones KO y WT en el momento de la cosecha a los 8 meses de edad. B. DEN /PB inducida focos tumorales microscópicos (esbozado por puntas de flecha) se visualizó por H & amp; E en WT y KO hígados a los 8 meses de edad. C. Un aumento significativo en focos tumorales microscópicas en KO en comparación con WT (p & lt; 0,05). Los tumores se cuentan a partir de H & amp; E manchadas secciones que representan 4 lóbulos del hígado de cada KO y WT animales en el protocolo /PB DEN
hígados β-catenina KO después de la función de tratamiento DEN /PB aumentó la muerte celular, estrelladas. activación de las células y la fibrosis y proliferación tumoral
a continuación, se abordan los mecanismos celulares que pueden ser la base de la tumorigénesis mejorado en KO. Identificamos un mayor número de hepatocitos TUNEL-positivas en KO a los 8 meses después de DEN /PB en comparación con WT tratados de manera similar, lo que sugiere una mayor muerte celular (Fig. 2A). Hubo un aumento de acompañamiento en la proliferación celular del parénquima hepático en KO que superó a la de WT (Fig. 2A). Además, los ratones KO mostraron un aumento dramático en el número de actina de músculo liso α-, que identifica activa las células estrelladas que son responsables de la deposición de colágeno y la fibrosis (Fig. 2A). Concomitante a la activación de células estrelladas, se observó fibrosis mejorada por tinción con tricrómico de Masson en el KO en comparación con el WT (Fig. 2B). De hecho, sólo uno de los 15 animales WT después de la exposición DEN /PB mostró fibrosis, que era comparable a la fibrosis en el KO. En conjunto, nuestros resultados sugieren que una mayor tumorigénesis en los hígados KO se asoció significativamente con una mayor muerte celular y la proliferación (Fig. 2C), y la fibrosis hepática así.
A. Representante portadores de tumores hígados KO muestran un aumento de la muerte de células de parénquima (TUNEL), una mayor activación de las células estrelladas (α-SMA) y la proliferación de células de parénquima aumentado (PCNA) en comparación con WT. B. Aumento de la fibrosis hepática (azul) en portadores de tumores hígados KO es evidente por tinción de Masson Trichrome comparado con el control. C. PCNA- y células TUNEL positivas fueron contados en 4 secciones aleatorias representativas de 5 KO y WT hígados. Un aumento significativo tanto en las células del parénquima positiva TUNEL PCNA y fue evidente en los hígados KO en comparación con WT después del tratamiento DEN /PB.
Los tumores en el hígado después de KO DEN /PB no están compuestos de β-catenina hepatocitos -positivos
Dado que no ha habido informes de nuestro laboratorio y otros que en respuesta a lesiones específicas, hay una presión sobre los hepatocitos que pueden haber escapado a su eliminación cre-mediada, nuestro primer objetivo era determinar si los hígados expuestos a DEN /PB del grupo KO mostró ninguna reaparición de β-catenina, especialmente cuando se comparan con el WT. Un representante del Banco Mundial mostró que todos los hígados de los ratones KO de DEN /PB expuesta expresaron niveles mucho más bajos de β-catenina en comparación con WT mediante transferencias Western (Fig. 3A). Esto también se verificó mediante un análisis inmunohistoquímico detallada incluido en una próxima sección (Tabla 1 y Fig. 4). El bajo nivel de β-catenina en hígados KO representa su presencia en las células no parenquimatosas del hígado que no muestran la albúmina recombinación cre-mediada. Del mismo modo análisis que se presenta a partir de hígados representativos KO y WT también mostró ausencia de glutamina sintetasa, un gen diana sustituta de la señalización de β-catenina en el KO (Fig. 3A). Ciclina D1, otro objetivo importante de β-catenina en el hígado y en otros lugares se incrementó en la mayoría de WT, mientras que 8/9 KO mostró muy baja o ausente de ciclina D1 en respuesta a DEN /PB (Fig. 3A y no se muestra). C-Myc, otro objetivo de β-catenina, era irónicamente mayor en KO en comparación con ratones WT después de la exposición DEN /PB como se muestra en una transferencia de Western representativa (Fig. 3A). Por lo tanto hígados KO después DEN /PB siguen siendo negativos para β-catenina después de 8 meses.
A. Representante de Western blot de 5 WT y 4 hígados portadores de tumores KO muestra bajos niveles de β-catenina, GS ausentes y dramáticamente más baja de ciclina D1 en KO, mientras que se incrementaron los niveles de c-myc. Actina verifica la igualdad de carga. B. Examen de RTK en los mismos grupos de animales muestra notablemente inferiores fosfo-Met y fosfo-IGFR y sólo marginalmente inferior fosfo-EGFR, en KO que WT hígados mediante transferencias Western. GAPDH verifica la carga comparable.
Los tumores en el documento WT fueron heterogéneos y eran ya sea positiva tanto para β-catenina y PDGFRa, o para ninguno de ellos. En KO, casi todos los tumores carecían de β-catenina y mostraron una intensa PDGFR-positividad.
Los tumores en el hígado después de KO DEN /PB no están asociados con la activación de HCC tradicionales asociados receptores de tirosina quinasas.
debido a un aumento paradójico en la tumorigénesis inducida por PB DEN /en KO, el próximo exploraron posibles mecanismos moleculares. Tanto el factor de crecimiento epidérmico (EGF) de señalización y señalización del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) son jugadores críticos en el desarrollo y exacerbación de HCC [11]. Exploramos el estado total y fosforilada tanto de los receptores de estos receptores tirosina quinasas (RTK) en los hígados de los ratones KO y WT DEN /tratados con PB. Curiosamente hemos observado una disminución en los niveles totales y fosforiladas de c-Met, el receptor de HGF en los animales KO en comparación con WT (Fig. 3B). Ambos niveles totales y fosforiladas de EGFR entre los animales WT y KO permanecen inalterados (Fig. 3B). También se examinó la insulina como factor de crecimiento, otra vía de señalización implicados en HCC [11]. Hemos observado niveles más altos de su fosforilación en el WT en comparación con KO (Fig. 3B). Por lo tanto, los RTK clásicos no parecen ser responsables de HCC mejorado en KO, pero p-Met y P-IGFR son inducidos prominente en ratones WT teniendo indicando su importante papel en CHC tumor.
Caracterización inmunohistoquímica de KO y WT tumores en el hígado para β-catenina y PDGFRa
a continuación se caracteriza los tumores observados en el WT y KO mediante técnicas de inmunohistoquímica para la localización de β-catenina. Alrededor de 31% de los focos total del tumor en ratones WT mostró β-catenina nuclear (Tabla 1, Fig. 4). De los 63 focos observado en ratones KO 9, sólo dos estaban compuestos de células tumorales β-catenina-positivos que mostraron su /localización citoplasmática nuclear (datos no mostrados), mientras que otros fueron negativos (Fig. 4). Esto fundamenta las observaciones en la Fig. 3A y también demuestra que casi todos los tumores en este grupo estaban compuestos por los hepatocitos β-catenina-negativos y no puede ser debido a la expansión de las células, que puede haber retenido β-catenina debido a incompleta recombinación cre-albúmina.
a continuación se investigó PDGFRa de señalización, que ha sido implicado en HCC y está implicado en el crecimiento tumoral, la angiogénesis, y el mantenimiento de microentorno del tumor [12], [13], [14]. 54,5% del total de focos tumorales en los ratones WT mostró expresión PDGFRa citoplásmica (Tabla 1). Nos encontramos cerca del 94% de los focos tumorales en KO ser fuertemente positiva para el PDGFRa en el citoplasma de las células tumorales (Tabla 1, Fig. 4). Sólo cuatro focos fueron negativos para el PDGFRa. Los dos focos tumorales que eran β-catenina-positivas en los hígados KO eran al mismo tiempo positivo para el PDGFRa.
En un análisis adicional, 9 de los 55 tumores observados en el WT eran concomitantemente positiva tanto para el PDGFRa y β nuclear -catenina, mientras que otros fueron positivos para uno cualquiera de los dos (Tabla 1, Fig. 4). Una pequeña fracción de los tumores fueron negativos para estas dos proteínas. Los dos tumores que se componen de hepatocitos β-catenina-positivas en el KO también fueron positivos para PDGFRa señalización (Tabla 1). En general, la expresión de PDGFR fue mayor y también en un mayor número de focos tumorales en el KO en comparación con el WT 8 meses después de la exposición DEN /PB.
DEN /PB inducida por aumento de la tumorigénesis está asociada con la activación de PDGFRa señalización.
a fin de verificar el PDGFRa aumento en el KO sobre WT después DEN /PB, se utilizó el análisis de transferencias de Western. los niveles de proteína PDGFR fueron mayores en el KO que los hígados WT (Fig. 5A), y esta diferencia fue estadísticamente significativa (Fig. 5B). Hubo un modesto incremento en los niveles de PDGFRß en los hígados KO (Fig. 5A). También se identificó un notable incremento de los niveles de proteína total de ligando selectivo PDGFRa PDGF-CC, mientras que el PDGF-AA o PDGF-BB se mantuvo inalterada entre los dos grupos (Fig. 5C).
A. Western blots representativos de 8 KO y 9 en peso muestran un incremento dramático en los niveles totales de PDGFRa y modesto aumento en PDGFRß en el KO. carga actina verifica la igualdad de carga. B. promedio integrado densidad óptica (IOD) obtenido de autorradiografías escaneados que se muestran en la Fig. 5A reveló niveles significativamente más altos en PDGFRa KO (p = 0,002). blot C. Western de muestras representativas muestra un aumento dramático en PDGF-CC, un ligando para PDGFRa en KO mientras que PDGF-AA y BB se mantuvieron sin complicaciones entre los dos grupos. gráfico D. Bar representa un aumento significativo en Tyr720-PDGFRa en KO en comparación con WT (p & lt; 0,05). E. diferencias no significativas fueron evidentes en Tyr-849-PDGFRa entre el WT y KO.
Para determinar las consecuencias de una mayor PDGF-CC /niveles PDGFRa en KO hemos evaluado los niveles de fosforilación de PDGFR en varias tirosina específica residuos utilizando anticuerpos enumerados en métodos. Como se muestra en los análisis densitométricos, un aumento significativo en Tyr720-PDGFRa (p & lt; 0,05) (Fig. 5D), pero no en Tyr849-PDGFRa (Fig 5E.) O Tyr572 /574- y Tyr754-PDGFRa (no se muestra) se observó en el KO. Estas observaciones demuestran la activación PDGFRa en KO, que puede estar jugando un papel importante en la hepatocarcinogénesis.
PDGFRa ligando estimula la proliferación celular de hepatoma sólo de β-catenina supresión
Para determinar aún más la importancia de la señalización PDGFR en ausencia de β-catenina, hemos utilizado células de hepatoma humano. PDGF-CC era incapaz de inducir un aumento significativo en la síntesis de ADN de las células Hep3B en comparación con HCl, que se utilizó para reconstituir PDGF en cultivos de células casi confluentes (Fig. 6). β-catenina caída en comparación con control de transfección siRNA, redujo significativamente la incorporación de timidina en células Hep 3B (p & lt; 0,0005) (Fig. 6). Sólo después de silenciamiento β-catenina, era tratamiento PDGF-CC capaz de inducir la síntesis de ADN significativa en células Hep 3B, en comparación con HCl (p & lt; 0,005). Por lo tanto β-catenina supresión activar PDGF-CC para ser mitogénico para células Hep 3B.
PDGF-CC (10 ng /ml) de tratamiento no aumenta la síntesis de ADN en comparación con el tratamiento de las células Hep 3B HCl. β-catenina knockdown llevó a disminución significativa en la incorporación de timidina en comparación con el control de siRNA (p & lt; 0,0005). Sin embargo el tratamiento PDGF-CC condujo a un aumento significativo en la incorporación de timidina en β-catenina-suprimido en comparación con las células control siRNA-transfectadas (p & lt; 0,005).
Discusión
Para entender las bases moleculares y celulares de carcinoma hepatocelular en pacientes, varios modelos preclínicos están en uso, incluyendo DEN o regímenes DEN /PB en los roedores. DEN es un carcinógeno comúnmente utilizado para inducir CHC en modelos de roedores, sin embargo, tiene una alta especificidad cepa. En C57BL /129Sv × ratones C3H /He, una cepa más susceptibles a hepatocarcinogenesis, inyección DEN en alrededor de 6 semanas de edad a una dosis de 90 mg /g de peso corporal, induce HCC a través de mutaciones Ha-ras, mientras que la inclusión de PB en el agua potable agua después de 3 semanas de DEN, promueve la tumorigénesis debido a
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mutaciones. [15]. Sin embargo, otro estudio en ratones B6C3F1 machos, obtenidos por entrecruzamiento hembra C57BL /6J y los ratones machos C3H /HeJ, inyecta DEN a 10 mg /g de peso corporal a las 3 semanas de edad sin PB, mostraron HCC través de
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mutaciones [16]. Otro modelo utiliza DEN a una dosis de 5 mg cuerpo /g en ratones C57BL /6, una cepa relativamente resistentes a la HCC. Aquí, DEN induce aductos de ADN en hepatocitos sometidos a la división celular, y, finalmente, conduce al desarrollo de HCC [17], [18]. La inclusión de PB mejora la tumorigénesis a través de su capacidad promotora de tumores [9], [10]. En nuestro estudio, mostramos que a diferencia de los ratones C57BL /129Sv × C3H /He, tumores hepáticos inducidos DEN /PB en los ratones C57BL /6 no mostraron nuclear /localización citoplasmática de β-catenina y por lo tanto no causa selectivamente CHC a través de
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mutaciones. Por lo tanto la consideración cepa de ratón para el estudio de la tumorigénesis en respuesta a protocolos específicos es muy relevante.
Muchas vías clasificarse en términos generales en Ras /MAPK, PIK3CA /AKT, y la señalización /β-catenina vía, han demostrado ser de importancia en HCC [11], [19]. β-catenina, el orquestador central de la señalización de Wnt, es un oncogén conocido por sus implicaciones en una variedad de cánceres, incluyendo el 20% -40% de todos los HCC [20]. Curiosamente, sin embargo, la sobreexpresión de cualquiera de las de tipo salvaje o forma mutante de β-catenina en hígados murinos es incapaz de inducir HCC espontánea [21], [22], [23], [24]. Sin embargo, en la presencia de otro 'golpeado' en forma de un transgén o un carcinógeno químico, estos diversos ratones muestran una mayor tumorigénesis [23], [25], [26]. HCC Paradójicamente, la pérdida condicional de β-catenina en hepatocitos en ratones C57BL /6 dio lugar a una susceptibilidad inesperadamente superior a DEN inducida por [27]. Otro grupo también mostró recientemente demostró una mayor tumorigénesis en ratones KO en respuesta a DEN /PB,
aunque Hoteles en C3H /N ratones [28]. En el estudio actual, aportar pruebas de que β-catenina ratones KO en ratones C57BL /6 antecedentes sometido a DEN mediada por la inducción de tumores en P14 seguido por la promoción de tumores después de 2 semanas por PB también dio lugar a una carga tumoral mucho más altos.
DEN o DEN HCC /PB inducida en cualquier cepa de ratones no se asocia típicamente con cualquier fibrosis hepática. Sin embargo, en la β-catenina condicional ratones nulos DEN exposición /PB llevó al desarrollo de carcinoma hepatocelular, que se asoció con la fibrosis hepática y está en línea con los últimos estudios por otros y nosotros [27], [28]. También vimos un aumento en la muerte celular y el incremento resultante en la proliferación celular. De hecho hemos identificado la activación de las células estrelladas aumentado, un modesto aumento en PDGFRß y la consiguiente fibrosis hepática. Estos datos indican que la pérdida de β-catenina hace hígados más propensas a daño genotóxico y, finalmente, la tumorigénesis que imitan el escenario predominante de HCC humano donde los tumores a menudo se produce en el fondo cirrótico [29]. Papel de β-catenina en la regulación del estado redox se ha implicado en muchos estudios recientes en los que sus interacciones con HIF1α, FOXO3 y otros pueden ser críticos [30], [31]. En consecuencia, será importante entender la base de tales papeles 'supresores de tumores' de β-catenina en el CHC que pueden llegar a requerir una cuidadosa selección de los pacientes a ser tratados con terapias anti-β-catenina [32].
para determinar la base molecular del CHC en ausencia de β-catenina, que se mostraron interesados en las vías que son bien conocidos en el desarrollo y exacerbación de HCC señalización. C-Met y la fosforilación IGFR se incrementó en WT, pero no en ratones KO, mientras que la activación del EGFR se elevó sólo ligeramente en WT. Así, mientras que estos RTK pueden estar jugando un papel importante en la tumorigénesis en el WT expuesto a DEN /PB, su participación en KO es poco probable. En base a los hallazgos previos en la tumorigénesis DEN-inducida en KO [27] y los estudios independientes que muestran un papel importante de PDGFR señalización en HCC [12], [13], [14], se determinó su expresión y la activación en el foso de los estudios /PB . PDGFRa niveles fueron significativamente upregulated en KO después DEN /PB-exposición. Además, PDGF-CC un ligando selectivo de PDGFRa, cuya sobreexpresión en ratones transgénicos específico de hígado se ha demostrado que induce la cirrosis y HCC [33], también fue aumentado en KO. De hecho PDGF-CC se localizó en hepatocitos en KO expuestos a DEN /PB (datos no mostrados), sugiriendo un bucle autocrino de la señalización. Los resultados obtenidos en el ensayo de incorporación de timidina en las células Hep 3B, corrobora
in vivo
hallazgos. Si bien se observó una disminución de proliferación celular en células de hepatoma después de β-catenina knockdown [34], PDGF-CC promovido su mitogénesis más robustamente sólo después de la supresión de β-catenina que conduce a PDGFRa upregulation [27]. Esto también se verifica PDGFRa señalización como un medio para escapar de β-catenina inhibición terapéutica.
PDGFRa sobreexpresión en presencia de un aumento de PDGF-CC condujo a un aumento Tyr720-PDGFRa en portadores de tumores KO pero no hígados WT después DEN /PB. La fosforilación en tirosina 720 es conocida por activar SHP2 fosfatasa, que a su vez desfosforila Src, que conduce a su activación [35]. la activación de Src se ha demostrado que induce la c-Myc, un importante proto-oncogén [36], que fue elevado de forma concomitante en KO. Otros sitios de tirosina en el PDGFRa mostraron cambios discretos en la fosforilación entre el KO y WT y por lo tanto pueden ser de menor relevancia en el modelo de tumorigénesis actual.
Sólo alrededor del 3% de todos los tumores en el 9 nocáuts a los 8 meses después de la régimen de DEN /PB fueron tumores β-catenina-positivos que pueden deberse a 'fugas' cre-recombinasa. tumores ß-catenina-negativos también fueron negativos para GS y en su mayoría negativos para la ciclina D1-. No hemos seguido todos los animales en este estudio más allá de 8 meses. Otros han informado recientemente de una amplia repoblación espontánea en los hígados KO
si bien
a los 18-20 meses de edad [37]. Un grupo ha informado de una repoblación espontánea más robusto y adenomatosis hepática en KO, que no ha sido informado por cualquier otro grupo de trabajo con los β-catenina ratones knockout condicional [38]. Se observó que el único caso de extensa repoblación en los ratones KO en nuestra experiencia después de la administración continua de dieta que contenía 0,1% de 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihydrocollidine (DDC) durante 5 meses [39]. De hecho ratones KO han sido estudiados después de la hepatectomía parcial, dieta deficiente en metionina-colina, la dieta alcohol o DEN y han exhibido falta de repoblación hepática con hepatocitos β-catenina-positivas [27], [31], [40], [41] .
Materiales y Métodos
los estudios en animales
Todos los experimentos con animales se realizaron bajo las directrices de los Institutos nacionales de Salud y el Comité de uso y Cuidado de animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh. Los estudios realizados en el presente informe fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Pittsburgh. Los ratones con eliminación condicional de β-catenina en los hepatocitos con genotipo CTNNB1
loxp /loxp; Alb-Cre
+/- se refiere como ratones knockout (KO) y se han descrito anteriormente [41]. Camada con cualquiera de los siguientes genotypes- CTNNB1
loxp /loxp; Alb-Cre
- /-, CTNNB1
loxp /WT; Alb-Cre
+/-, CTNNB1
loxp /WT; Alb-Cre
- /- se conocen como de tipo salvaje o WT. Estos ratones son en ratones C57BL /6 de fondo.
Male KO (n = 9) y WT (n = 15) los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con DEN (Sigma-Aldrich, Inc.) a una dosis de 5 mg /gramo de peso corporal en el día postnatal 14 y de día 28 en adelante, el agua potable disponible
ad libitum
contenía fenobarbital (PB) (0,05% w /v). El agua que contiene PB fresco se preparó por semana durante la duración de los estudios. Los ratones fueron sacrificados a los 8 meses y el hígado recogieron para el análisis de la histología y la proteína
análisis de transferencia Western:.
Lisados de tejido total preparado en tampón de ensayo de radio inmuno-precipitación (RIPA) que contienen 1% de Igepal CA -630, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% SDS en 1 × PBS junto con la proteasa & amp; inhibidor de fosfato (1:100) (Thermo Scientific). Las proteínas se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio en 4-15% de geles y luego se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) en tampón de transferencia que contiene 10% de metanol. Las membranas se probaron con anticuerpos primarios (véase más adelante) en solución salina tamponada con Tris con Tween-20 que contenía 5% de leche sin grasa o BSA. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se usaron a una dilución 1:50,000 y la señal evaluados con sustrato de quimioluminiscencia Super Señal West Pico (Pierce, Rockford, IL) y autorradiografía. Las películas (Tecnología de venta Molecular, Santa Luisa, MI) fueron escaneadas para obtener densitomery óptica integrada (IOD) utilizando el software NIH Imager. El IOD promedio para una proteína se comparó entre los grupos KO y WT y se evaluó la significación estadística por el estudiante de
t
prueba y p & lt;.. 0,05 fue considerado significativo
Los anticuerpos
Los anticuerpos primarios utilizados para el Western Blot incluyen: c-Met (1:500), fosfo-Met Tyr1234 /1235 (1:1000), EGFR (1:1000), fosfo-PDGFRa Tyr849 (1:1000), fosfo-IGFR (1:1000) todos de Cell Signaling Technology; β-catenina (1:1000) de BD Biosciences; PDGFRa (1:180), PDGFRß (1:500), fosfo-EGFR (1:500), fosfo-PDGFRa Tyr720 (1:200), c-myc (1:200), PDGFA (1:200), PDGFB (1:200), PDGFC (1:200), fosfo-PDGFRa Tyr754 (1:200), glutamina sintetasa (1:200), y GAPDH (1:1000) todos de Santa Cruz Biotechnology; fosfo-PDGFRa Tyr572 /574 (1:800, Invitrogen); Ciclina D1 (1:200, Neomarkers); alfa actina de músculo liso (1:300, Abcam); y β-actina (1:2000, Millipore).
Histología e inmunohistoquímica
secciones de cuatro micras de los tejidos del hígado incluidas en parafina se usaron para histología y tinción inmunohistoquímica. Se empleó tinción para identificar focos tumorales; hematoxilina y eosina (H & amp E). Típicamente cuatro lóbulos representativos de cada ratón se incluyeron en cada diapositiva. focos tumorales fueron identificados sobre la base de los atributos característicos como citoplasma basófilo y figuras de mitosis. Para la comparación, se contó el número total de nódulos microscópicos y los números de la media en comparación estadística significativa para los estudiantes por
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prueba con p. & Lt; 0,05 consideró significativo
Para la inmunohistoquímica, la recuperación de antígenos se logró tanto por el vapor cocinar o hirviendo los portaobjetos en un microondas en tampón de citrato durante 20 minutos o 10 minutos, respectivamente. Las secciones se inactivaron para el peróxido endógeno, bloquearon y se incubaron con anticuerpo primario durante la noche a temperatura ambiente o durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con biotina apropiado durante 30 minutos. Las secciones se lavaron, se incubaron con reactivo ABC, se lavaron y se incubaron con DAB. Las secciones se counterstained junto con una solución de Shandon hematoxilina (Sigma) y la cubierta se coló usando XYL Cytoseal (Richard Allen Scientific, Kalamazoo, MI). Para el control negativo, el anticuerpo primario se omitió en el protocolo. Los portaobjetos se observan bajo un 40 (Zeiss) microscopio de investigación en posición vertical Axioskop y las imágenes digitales obtenidas. Collages se prepararon utilizando el software Adobe Photoshop CS4. Para PCNA y TUNEL, el número de células positivas se contaron en cuatro azar 400 × campos en cinco hígados representante de cada grupo y los promedios de comparación para la significación entre grupos por el estudiante
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prueba. valor de p menor de 0,05 fue considerado significativo. Para el análisis cuantitativo de la β-catenin- y PDGFR-positividad en tumores, se evaluaron todos los focos microscópicos en KO y WT hígados. Cualquier focos tumorales que muestra la tinción de β-catenina citoplasmática y /o nucleares fueron etiquetados como β-catenina-positivo y cualquier foco que muestra tinción citoplásmica para PDGFRa en comparación con las zonas no tumorales circundantes fueron etiquetados como PDGFR-positivo. Esto nos permitió calcular el porcentaje de β-catenina y /o tumores PDGFR-positivos en cada grupo después del tratamiento DEN /PB.
cultivo de células y el tratamiento
Hep3B células (ATCC) se cultivaron hasta 100% de confluencia en un 10% de FBS y EMEM. Las células se trataron con tripsina y se sembraron en placas de 6 pocillos que contenían 2 ml de 10% de medio FBS EMEM y privadas de suero durante la noche. La transfección se realizó utilizando pre-validado β-catenina y control siRNA (Ambion) usando lipofectamina como se describe anteriormente [34]. 24 horas después de la transfección, las células fueron tratadas con 10 ng /ml de PDGF-CC recombinante (R & amp; D Systems) o HCl (utilizados para reconstituir PDGF-CC) en los medios 4% que contiene timidina tritiada. Después de 24 horas, el medio se desechó y se añadió 1 ml de ácido tricloroacético al 5% (TCA) a cada placas de pocillos y se colocan en 4 ° C durante 15 minutos. Las células se lavaron, se secaron y se suspendieron en 1 ml de NaOH 0,33 M durante 20 minutos, y 300 l de mezcla total de cada pocillo se añadió a 3 ml de líquido de centelleo y luego se coloca en un contador de centelleo.