Extracto
La exposición al humo del cigarrillo compromete claramente la capacidad del sistema inmunitario para proteger contra los patógenos invasores y la tumorigénesis. La nicotina es un componente psicoactivo de productos de tabaco que actúa como lo hace el neurotransmisor natural, la acetilcolina, sobre los receptores nicotínicos (nAChRs). Aquí demostramos que las células asesinas naturales (NK) expresan fuertemente nAChR β2. exposición a la nicotina altera la capacidad de las células NK para matar células diana y la liberación de citoquinas, un proceso que está en gran parte abrogada por la deficiencia de β2 nAChR. Además, la supresión nicotínico de la actividad transcripcional inducida por NF-kB en las células NK depende de nAChR β2. Este subtipo nAChR también juega un papel importante en el control mediada por células NK de metástasis de melanoma de pulmón, en un modelo de metástasis de pulmón murino expuesto a la nicotina. Nuestros hallazgos sugieren β2 nAChR como una vía importante para la nicotina inducida por el deterioro de las funciones de las células NK, lo que contribuye a la aparición de patologías relacionadas con el tabaquismo
Visto:. Hao J, Shi FD, Abdelwahab M, Shi SX, Simard Un , Whiteaker P, et al. (2013) los receptores nicotínicos β2 Determina NK metástasis de las células-dependiente en un modelo murino de cáncer de pulmón metastásico. PLoS ONE 8 (2): e57495. doi: 10.1371 /journal.pone.0057495
Editor: Fabricio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italia |
Recibido: 28 Octubre, 2012; Aceptado: January 21, 2013; Publicado: 28 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Hao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio está apoyado en parte por el Proyecto Internacional de Ciencias de China Cooperativa de 2006DFB32330 a QXHYR; Programa Nacional de Investigación Básica China 2013CB966900 al FDS; Programa para el Nuevo Siglo talentos excelentes en la Universidad de China (111.067 NCET a JWH); CNSA 2010CB529405 a QXHYR, 81100887 y 81273287 de JWH; el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos (R01AI083294 al FDS); Proyecto Llave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Tianjin 12JCZDJC24200 a JWH, y el Proyecto Clave del Ministerio de Educación de China (212005 a JWH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción trastornos
relacionadas con el tabaco, como la infección y la tumorigénesis se han relacionado con las funciones comprometidas del sistema inmune en los fumadores [1], [2]. Entre los múltiples componentes modificadores inmunes del humo del tabaco, la nicotina se ha demostrado que tiene un impacto profundo en un número de receptor de acetilcolina nicotínico (nAChR) llevando los leucocitos de ambos sistemas inmune innata y adaptativa. Expresión de nAChR α7 en los macrófagos y monocitos, y su capacidad para inhibir la respuesta inmune durante la inflamación sistémica y en las enfermedades específicas de órganos han sido relativamente bien descritos [3], [4], [5], [6], [7] , [8]. Los resultados sugieren que la nicotina regula la intensidad de la endotoxemia y la sepsis [3], [4], [5], y atenúa las respuestas autoinmunes específicos de de una manera dependiente de α7 nAChR [6], [7], [8]. Por otro lado, recientemente se ha demostrado que otros subtipos de nAChR pueden jugar un papel en los efectos anti-inflamatorios de la nicotina [3], [4], [5], [6], [7], [8]. En este contexto, el perfil de expresión de nAChR adicionales en los leucocitos y su papel en la enfermedad son relativamente menos explorado.
Células
NK son linfocitos granulares grandes, que operan a través de la actividad citolítica y la secreción de citoquinas. Estas dos funciones de la autonomía de las células NK en la defensa innata del huésped contra ciertos agentes microbianos y las células sometidas a la transformación maligna. Varios estudios han demostrado que los números y las actividades de las células NK están disminuidos en los fumadores en comparación con los no fumadores [1], [2]. La exposición al humo del cigarrillo atenúa la actividad citotóxica y la producción de citoquinas de las células NK en los seres humanos y ratones [9], [10], [11], vinculando así defectos de células NK a un aumento de la infección y el cáncer. El tabaquismo se ha asociado particularmente con el cáncer de pulmón de células pequeñas altamente maligno. Incluso después de la extirpación quirúrgica en una etapa temprana, casi la mitad de los pacientes mueren de una metástasis de tumores secundarios. Se postula que esto se debe en parte a la vigilancia inmune mediada por células NK defectuosa porque la función aberrante de las células NK en los fumadores aumenta la reaparición de la metástasis del cáncer de cuello de útero [12].
A continuación, se analizó exhaustivamente el celular y efectos moleculares de la nicotina como uno de los componentes del humo del cigarrillo en las células NK. Estamos perfiladas expresión de nAChR en las células NK y β2 nAChR identificado como un factor determinante para el deterioro de la nicotina mediada por células NK de funciones. Además, demostramos que la inhibición nicotínico de las funciones de las células NK a través del nAChR beta 2 aumenta significativamente la metástasis de melanoma en un modelo de xenotrasplante.
Materiales y Métodos
Animales
Mujer C57BL /6 ratones (6-8 semanas de edad), RAG2
- /-, RAG2
- /- γ
c
- /-, todo sobre un fondo C57BL 6 /, fueron adquiridos de Taconic Farms. α7 y ratones KO beta 2 [13], también se acercó a C57BL /6 antecedentes, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Allan C. Collins. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos. El Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Tianjin y el Hospital de San José y el Centro Médico aprobó todos los experimentos descritos en este estudio.
Purificación de ARNm y la transcripción inversa-PCR
ARNm se purificó de nuevo de forma aguda -isolated células (~ 1,5 × 10
6 células por muestra) utilizando el kit de aislamiento de ARNm μMACS (Miltenyi Biotec), según el protocolo suministrado. La transcripción inversa se realizó con el kit Superscript III Primera Strand cDNA Synthesis (Invitrogen, EE.UU.) siguiendo el protocolo suministrado. secuencias de oligo-dT se utilizaron para cebar la transcriptasa inversa. PCR fue entonces lleva a cabo siguiendo los protocolos establecidos, usando una variedad de cebadores que son específicos para cada ARNm diana (Tabla 1). Los pares de cebadores fueron diseñados con el uso de la herramienta "Primer-explosión" de PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Para cada par, hacia adelante y hacia atrás primers fueron específicos a diferentes exones, por lo que una posible contaminación de ADN se puede descartar. PCR se realizó usando el kit de PCR RedTaq (Sigma, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo suministrado. Primers siempre se ensayaron con ADNc de cerebro total (control positivo), y se determinó la temperatura de hibridación óptima (Tm) empíricamente (con el uso de un termociclador de gradiente de temperatura), mientras que el mantenimiento de condiciones de alta rigurosidad. Un control negativo (sin molde de ADNc), fue incluido en cada conjunto de reacciones. Los productos de PCR para cada par de cebadores de los controles positivos se secuenciaron con el fin de garantizar la exactitud de los resultados.
nAChR general Expresión Evaluado por la saturación de radioligando La unión
epibatidina, que es selectivo para β2- y nAChR que contiene beta 4-(que pueden montar con α4, α5, α6 y subunidades beta 3), se utilizó para evaluar la cantidad de nAChR que contiene ß2-, como se ha hecho anteriormente [14], [15]. Con el fin de maximizar la sensibilidad del ensayo, se utilizó una alta actividad específica [
125I] epibatidina (I-Epi; 2200 Ci mmol
-1; PE Life Sciences, Waltham, MA). Con este fin, se utilizaron células NK purificadas inmediatamente después del aislamiento. Las células se resuspendieron en tampón de unión isotónico (mM: NaCl, 144; KCl, 2; CaCl
2, 2; MgSO
4, 1; HEPES 20; pH = 7,5), suplementado con albúmina de suero bovino (0,1% (Virginia Occidental)). Las incubaciones se realizaron a 22 ° C durante 2 h en placas de 96 pocillos. Las muestras se incubaron con una serie de ocho concentraciones (6,25 a 800 pM) de I-Epi en un volumen total de 30 l de tampón de unión suplementado isotónica. Total (sin péptido añadido) y la unión no específica (definida usando carbamycholine 100 mM) se midieron en cada concentración, por triplicado. Para diferenciar β2- de nAChR que contiene beta 4-, 10 nM A85380 se añadió en conjuncton con 200 pM I-Epi [14]. Las reacciones de unión se terminaron y se lavaron por filtración usando un colector de 96 unidades. fracciones de partículas se recogieron en capas individuales de Inotech 0,75 micras filtros de fibra de vidrio de retención empapados en polietilenimina al 0,5%. radioligando unido se cuantificó usando un contador de placas Microbeta (PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA).
El tratamiento de nicotina in vivo e in vitro
Para la administración in vivo, una solución de 100 mg /ml que contenía (-) bitartrato de nicotina (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución de PBS solo estaba recién preparado de 24 h antes de la implantación de la bomba y se carga en minibombas osmóticas Alzet® (modelo 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA, EE.UU.). Las bombas se implantaron subcutáneamente en el lado derecho de la parte posterior del ratón y continuamente entregados PBS o sal de nicotina a 3,6 l /d durante 6 semanas, y luego se retiraron las bombas. Esto equipara a la entrega de 0,39 mg de base libre de nicotina por ratón por día. Para un ~ 30 gm de ratón, que es en el extremo superior de peso de los animales utilizados en el estudio, esto equivale a ~13 mg de nicotina base libre /kg /d o ~0.54 mg de nicotina base libre /kg /hr. los niveles de nicotina en plasma en ratones se ~100-200 ng /ml (~0.6-1.2 mM) después de la infusión de ~2-4 mg /kg /hr de drogas y ~ 45 ng /ml (~280 nm) después de la infusión a ~ 0,5 mg /kg /hr. Para la comparación, los fumadores humanos tienen niveles de nicotina en plasma máximas de 10-50 ng /ml (~60-310 nM). Por lo tanto, los niveles de nicotina en el plasma (extrapolarse a ser ~49 ng /ml o ~ 300 nM) de los ratones utilizados en los estudios son comparables a los del plasma de los fumadores humanos. Algunos ratones de control recibieron PBS a través de inyecciones directas en lugar de a través de minibombas, pero de cualquier forma de entrega produjeron resultados similares. Para los experimentos in vitro, se añadieron 0,1-100 micras /ml de nicotina a los cultivos celulares.
B16 Melanoma línea celular y tumoral Challenge
B16-F10-luc2 (B16) es una luciferasa que expresan la línea celular de melanoma de ratón (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, EE.UU.). Los ratones de los genotipos indicados fueron desafiados por vía i.v. con células B16 en 0,2 ml de PBS a través de la vena de la cola. El número de células utilizadas y los tiempos de sacrificio se hace referencia a los protocolos previamente establecidos [9], [15], [16] y se especifican en la sección de resultados. Los animales fueron anestesiados y sacrificados mediante exanguinación mediante punción de la vena abdominal. Los pulmones se retiraron y se colocaron en PBS. nódulos tumorales se contaron usando un microscopio de disección por un investigador ciego a los grupos de tratamiento. En algunos casos, los pulmones se sumergieron en una etanol 67%, 9% de formaldehído, y la solución de acético glacial 4% de ácido y el número de focos tumorales se enumeran 24-48 h más tarde.
Aislamiento de células mononucleares de pulmón
se aislaron células mononucleares de pulmón como se describe anteriormente [17]. En pocas palabras, los pulmones fueron perfundidos con HBSS precalentado desde el ventrículo derecho. Las suspensiones celulares de los órganos extirpados fueron generados por digestión con colagenasa y seguidas por picado mecánico. Los restos celulares se eliminaron por que pasa a través de malla de nylon. Las células se lavaron y se resuspendieron en HBSS. Las células no parenquimatosas se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad con Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories).
Células NK Ensayos de citotoxicidad
citotoxicidad de las células NK se evaluó mediante el ensayo de liberación de cromo utilizando
51Cr- etiquetada YAC-1 murino línea celular de linfoma [18] o las células tumorales B16. Las células NK recién purificadas se incubaron con
células diana marcadas con 51Cr (5 × 10
3) en varias relaciones /célula diana de células efectoras. Después de 4 h de incubación, los sobrenadantes se recogieron y
51Cr de liberación se midió con un γ-counter (PerkinElmer, Waltham, MA). El porcentaje de lisis específica se calculó según la siguiente fórmula: (liberación experimental - liberación espontánea) /(liberación máxima - liberación espontánea) × 100. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron por triplicado [18]
Proliferación de Células NK. ensayos
células NK fueron aisladas de el bazo de ratones que fueron tratados con nicotina o PBS. Las células se suspendieron en medio de cultivo que contiene la modificación de medio de Eagle (Gibco, Paisley, UK) suplementado con 1% (v /v) medio mínimo esencial (Gibco), glutamina 2 mM (Laboratorio Flow, Irvine, CA, EE.UU.), 50 de Dulbecco IU /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y con 10% (v /v) de FCS (todos de Gibco). 4 × 10
5 células en 200 l de medio de cultivo se colocaron en cada pocillo de 96 pocillos, placas de microtitulación de fondo redondo (Nunc, Copenhagen, Dinamarca). Para los experimentos in vitro de exposición a la nicotina en, se añadió la nicotina (0,1 a 100 mM) al medio de cultivo, además de LPS (10 mg /ml). Después de 3 días de incubación, se pulsaron las células durante 18 h con 10 ml de alícuotas que contienen 1 Ci de
3H-methylthymidine (actividad específica de 42 Ci /mmol; MP Biomedicals, Irvine, CA, EE.UU.) por pocillo. Las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y la incorporación de timidina proporcionales a continuación, se midió el grado de proliferación celular. Los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm).
Análisis FACS
Las suspensiones de células individuales (10
6 células) se prepararon a partir de bazo o ganglios linfáticos, y se tiñeron con fluorochrome- anticuerpos conjugados. Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Biosciences o eBioscience menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos se marcaron directamente con una de las siguientes etiquetas fluorescentes: FITC, PE, PerCP, aloficocianina (APC), PC5, o PC7. Se emplearon los siguientes anticuerpos anti-ratón: CD3 (145-2C11), NKG2A (20d5), NKG2D (CX5), Ly49 I (YLI-90), NK1.1 (PK136), perforina (eBioOMAK-D) y granzima B (16G6). los datos de citometría de flujo se recogieron en un FACSAria
TM citómetro de flujo (Becton Dickinson, Mountain View, MD) y se analizaron con la diva
TM software. mAb de control negativo del mismo isotipo se utilizaron para todas las manchas. Para determinar el porcentaje de células productoras de citocinas seleccionadas, los valores obtenidos con controles de isotipo se restaron de aquellos con mAb específico.
Tumor in vivo Imaging
imágenes de bioluminiscencia se obtuvieron usando un sistema de imágenes de la serie 200 IVIS (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Para
in vitro
de imágenes, las células bioluminiscentes se diluyeron en serie a partir de 10
5 células en medio completo en negro con fondo claro, placas de 24 pocillos (Costar, Acton, MA, EE.UU.). Se añadió D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA.) en 150 mg /ml en medio a cada pocillo 5 a 10 min antes de formación de imágenes. el tiempo de formación de imágenes fue de 1 min /placa. Para
in vivo
de imágenes, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina de 150 mg /kg (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Los ratones se pusieron a continuación en el escenario calentado dentro de la caja de la cámara hermética a la luz con la exposición continua al 1-2% isoflurano. los tiempos de imagen variaron de 1 a 3 s mentas. Las regiones de interés de las imágenes mostradas se identificaron alrededor de los sitios de tumor y se cuantificaron como total de recuentos de fotones o fotones /s utilizando el software de estar Image® (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
experimentos de exposición de los tumores se llevaron a cabo con melanoma B16 células que expresan la luciferasa. Para la cuantificación de la carga tumoral, a los 10 minutos después de la inyección intraperitoneal de 3 mg /ratón de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), los ratones se anestesiaron y se colocaron en la cámara hermética a la luz de un sistema de imagen 200 bioluminiscencia IVIS (Vida Caliper Ciencias, Hopkinton, MA). Los datos fueron recogidos en forma de fotones /s /cm
2 utilizando el software de estar Image® (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
La RM se realizó usando un pequeño animal 7T, de 30 cm de diámetro horizontal imán y espectrómetro de BioSpec Avance III (Bruker, Billerica, MA) con un conjunto de 116 mm de alto poder de gradiente (600 mT /m) y unos 72 mm en todo el cuerpo del ratón de transmisión /superficie reciben configuración de la bobina. Axial y coronal en T1 (MIPYME; TE 10,5 ms, TR 322 ms, cortes de 0,5 mm, matriz de 256 × 256, campo de visión (FOV) de 2,8 cm, ocho promedios, 40 cortes coronales, tiempo de exploración de 22 minutos, y 20 cortes axiales, tiempo de exploración 16 min) y supresión de la grasa turbo eco de espín ponderadas en T2 (RARO; TE1 14,5 ms, TE2 65,5 ms, TR 4500 ms, 0,5 mm de grosor de corte, la matriz de 256 × 256, FOV 2,8 cm, ocho promedios, 40 cortes coronales, tiempo de exploración de 28 minutos y 20 cortes axiales, tiempo de exploración de 28 minutos) las imágenes fueron adquiridas, que cubre el volumen del cerebro desde el bulbo olfatorio /fisura frontal del lóbulo de la médula espinal cervical. RM datos fueron analizados utilizando el paquete de software MEDx3.4.3 (Médico Numerics, Virginia, EE.UU.) en una estación de trabajo Linux.
Cuantificación de citoquinas
estándar ELISA para la evaluación de la liberación de citoquinas por las células NK (IFN -γ, MIP1α, y GM-CSF) se realizaron utilizando BD OptEIA ELISA kit (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) como se describe anteriormente [18]. Los resultados se expresaron como la media de concentración de citoquinas (pg /ml) ± SEM.
Para la tinción intracelular de citoquinas, suspensiones de células individuales se prepararon y se incubaron a 37 ° C durante cuatro días en placas de fondo redondo (2 × 10
6 células /pocillo), y se estimularon con una mezcla de PMA (20 ng /ml), ionomicina (1 mg /ml), y brefeldin a (5 g /ml) durante otros 5 h a 37 ° C. Después de la cosecha, las células se tiñeron para los marcadores de superficie, se fijaron y permeabilizaron con kit Cytofix /Cytoperm (BD Biosciences), después se tiñeron con anti-IFN-γ mAb (XMG1.2) conjugado con Alexa 647. Todas las muestras se analizaron en un FACSAria
TM usando la diva
TM software.
QRT-PCR
ARN total fue extraído a partir de suspensiones celulares de médula espinal utilizando Trizol (Invitrogen). Primera línea de cDNA de cada muestra se sintetizó usando un kit de transcripción inversa (Invitrogen). RT-PCR se realizó como se ha descrito anteriormente, utilizando un sistema ABI Prism 7900 HT-secuencia (Applied Biosystems) con el kit de QuantiTect SYBR Green PCR (QIAGEN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los siguientes cebadores: NF-kB adelante, 5'-ATTTGAAACACTGGAAGCACGG-3 '; NF-kB inversa, 5'-CCGCCTTCTGCTTGTAGATAGG -3 '; IKK adelante, 5'-TGCACACCGTGCAGAGTCA -3 '; IKK inversa, 5'-TGCTTGCAGCCCAACAACT -3 '; hipoxantina-guanina (HPRT) hacia adelante, 5'-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 '; y HPRT inversa, 5'-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 '. El gen HPRT se amplificó y sirvió como control endógeno. 1 l de la primera cadena de cDNA producto se amplificó con la Taq polimerasa Platinum (Invitrogen) y pares de cebadores específicos de gen. Cada muestra se ensayó por triplicado y los experimentos se repitieron dos veces. Las cantidades relativas de ARNm se calcularon mediante el trazado de la Ct (número de ciclos), y la media de expresión relativa se determinó por el método comparativo 2
-ΔΔCt.
Resultados
nAChR Expresión perfil de Las células NK y confirmación por ligando Ensayos de unión
Para determinar la expresión de nAChR ARNm en las células NK, que solucionaron células NK a partir de esplenocitos agrupados de RAG2
- /- C57BL /6 ratones que carecen de células T, NKT las células y las células B. ARNm se extrajo de las células NK altamente purificados (Figura 1A) y el perfil de expresión de nAChR se determinó mediante PCR. Nuestros resultados indican que las células NK expresan nAChR α4, α5, α6, β2 y β3 pero no α3, α7, α9; ni β4. Además expresión de β2 fue particularmente fuerte (Figura 1B). Luego investigó si las proteínas nAChR capaces de atacar en la unión se montan en las células NK mediante el uso de un
marcado con 125I epibatidina (I-Epi) ensayo de unión (200 pM carbamilcolina I-Epi +/- 100 mM), como radioligando nicotínico descrito en otra parte [14], [19], [20], [21]. células NK (~ 1 millón) fueron purificados por FACS, y homogeneizado de corteza de cerebro de ratón se utilizó como control positivo. I específica Epi unión fue de 99 fmol /mg de proteína en las células NK, aproximadamente igual a los niveles de unión específicos en todo el cerebro del ratón (Figura 1C). Estos datos demuestran que las células NK expresan un número significativo de nAChR ensamblados (así como ARNm de la subunidad de nAChR como se indica anteriormente) a niveles que se pueden cuantificar con este ensayo. Desde la I-Epi se une a ambos nAChR β2- y que contiene beta 4-[14], la unión competitiva con el compuesto β2-selectivo nAChR A85380 se utilizó para discriminar entre estos dos subtipos de receptores. Se encontró que A85380 abrogada en gran medida I-Epi de unión, lo que demuestra que la gran mayoría de los nAChR presente en las células NK contienen la subunidad β2 (Figura 1C). En conjunto, nuestros resultados revelan que las células NK expresan una serie de nAChR ARNm y que la mayoría de estas subunidades se ensamblan para formar nAChR que contiene ß2. La fuerte expresión de β2 de nAChR en las células NK, tanto en el ARNm y los niveles de proteína sugiere que los nAChR que contiene ß2-son candidatos para la mediación de los efectos de la nicotina sobre la actividad de las células NK.
Spleen, o se obtuvieron suspensiones de células de nódulos linfáticos RAG2
- /- ratones, y FACS se realizó tal como se describe en el
Materiales y Métodos
sección. A. gráficos de puntos representativos de las poblaciones de células antes y después de la clasificación se muestran en los paneles izquierdo y derecho, respectivamente. La pureza de las células NK alcanzados & gt; 98% de pureza después de la clasificación. B. ARNm se purificó a partir de las células NK ordenados, y se sintetizó ADNc mediante transcripción inversa. PCR se realizó usando cebadores específicos para cada ratón nAChR subunidad. Un control positivo (+), usando ADNc de todo el cerebro de ratón, y un control negativo (-), sin cDNA, se incluyeron en cada reacción. Para cada subunidad de nAChR, bandas partir del control positivo y al menos una muestra de cada tipo de célula se secuenciaron y se confirmó que el producto de PCR correcto. C. expresión nAChR evaluada por la saturación de la unión del radioligando. Los datos representados son representativos de 2 a 3 experimentos independientes con resultados similares.
Influencia de nAChR β2 deficiencia en la expresión de receptores de células NK y el efector moléculas
funciones de las células NK están dictadas por estimuladora y los receptores inhibitorios sobre las células NK. activación de las señales se generan a través de NK grupo 2 miembro (NKG2D), que reconocen las moléculas de estrés-inducible proteínas relacionadas con la cadena de MHC de clase I (MICA y MICB) y los UL-16-vinculante proteínas 1-4 (ULBP1-4), también conocidas como proteínas Raet, o a través de receptores de citotoxicidad naturales (NCR) que reconocen hemaglutinina viral y el ligando asociado a un tumor todavía no definido. Las señales inhibidoras son generados por la unión de moléculas MHC de clase I a los receptores similares a inmunoglobulina de células killer (KIR) en seres humanos, o para Ly49 en ratones, además del heterodímero CD94 /NKG2A en ambas especies [22], [23]. Se comparó la expresión de varios de estos receptores en las células NK de bazo aisladas de ratones nicotina o PBS expuesto y se investigó la influencia, en su caso, de la deficiencia de β2 nAChR. Expresión de NKG2A receptor inhibidor no se altera significativamente en las células NK por la nicotina; mientras que la expresión de NKG2D y Ly49I fueron reducidos en los ratones que recibieron la nicotina, y tales reducciones son abrogadas en gran medida en nAChR β2
- /- ratones (Figura 2A) [13]. Se obtuvieron resultados similares con respecto a la expresión de las células NK efector molecular granzima B y perforina (Figura 2B). También hemos observado que la nicotina tiene un efecto similar sobre el perfil de los receptores de las células efectoras y moléculas NK pulmonares derivados (datos no mostrados).
de tipo salvaje (β2
+ /+) o nAChR beta 2 knock-out ( β2
- /-) ratones recibieron nicotina (NIC) o PBS durante 21 días antes de ser escarificadas. suspensiones de células individuales se prepararon a partir de bazos. Frecuencia y fenotipos de las células NK en las células mononucleares se analizaron por FACS. A. La expresión de NKG2D, NKG2A y Ly49I en NK1.1 cerrada
+ CD3
- células. B. Expresión de la perforina y granzima B secretada por NK1.1 cerrada
+ CD3
- células. Los datos gráfica representa los resultados de dos experimentos separados (n = 3-4 ratones /grupo). Los valores de p, de Student
t-test
, * p & lt;. 0,05
Deficiencia nAChR β2 revierte los efectos inhibitorios de la nicotina en funciones de las células NK
Para entender la consecuencias biológicas de la alteración de la expresión del receptor de células NK inducida por la exposición a la nicotina, se investigaron los efectos de la nicotina en la célula NK la destrucción mediada por las células diana, así como la liberación de citoquinas por las células NK. células NK normales representan 5 a 10% de las células mononucleares de sangre periférica humana y en el 1-3% de los monocitos en bazo de ratón o de ganglios linfáticos. Para las células NK para llevar a cabo sus funciones, estas células deben proliferar en situaciones patológicas. Por lo tanto, se evaluó primero la influencia de la nicotina sobre la proliferación de células NK y encontramos nicotina reducido que la proliferación y el número de células NK (Figura 3A, B). nAChR β2 deficiencia restaurada en gran medida la capacidad de las células NK a proliferar y los números en la presencia de nicotina (Figura 3A, B).
Las células NK se clasifican a partir de suspensiones de esplenocitos única de células de tipo salvaje (β2
+ /+) o nAChR beta 2 knock-out (β2
- /-). A. Las células fueron cultivadas en presencia de diversas concentraciones de nicotina (0,1, 1, 10 o 100 mM), y [
3H] timidina se midió (10
3 cpm + SEM; ordenadas). el número de células B. NK se evaluaron de β2
+ /+ o β2
- /- ratones en la presencia o ausencia de la nicotina. (N = 6-8 por grupo; Estudiante de
t-test
, * p & lt; 0,05). C. célula diana labbed-51Cr
YAC-1 se incubaron con las células NK derivadas de β2
+ /+ o β2
- /- ratones en la presencia o ausencia de la nicotina, en la indicada efector /diana proporción de células. Matanza de células diana se mide mediante el ensayo de liberación
51 Cr. células D. B16 se incubaron con las células NK derivadas de β2
+ /+ o β2
- /- ratones en la presencia o ausencia de la nicotina. D-luciferina se añadió a cada pocillo y la placa fue fotografiada para obtener fotones /s por célula. Los pocillos con células solas (sin nicotina) o células (nicotina añadido) se incluyeron como controles. La muerte de las células B16 se miden a través de imágenes de bioluminiscencia. Los datos de un experimento de cada dos realizado se muestra, n = 3-4 ratones /grupo. Los valores de p, el lt
t-test
, * p & Student; 0,05. E. Producción de IFN-γ se midió mediante tinción intracelular de citoquinas. Las gráficas de puntos son representativos de dos experimentos separados (n = 6-18 ratones). F. Producción de IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, MIP-1α y MIP-β por las células NK ordenados se midió por ELISA. Los valores de p, de Student
t-test
, * p & lt;.
0,05
A continuación, se evaluó la influencia de la nicotina sobre la actividad lítica de las células NK y los roles potenciales para nAChR β2. En comparación con los ratones control que recibieron PBS, las células NK de ratones tratados con nicotina exhibido citotoxicidad reducida contra YAC-1, una célula clásico objetivo NK con una menor expresión de MHC de clase I (Figura 3C). melanoma de ratón líneas de células humanas primarias y, o, la expresión común de ligandos para receptores de citotoxicidad naturales (NCR) y DNAX accesorio molécula-1 (DNAM-1), los dos receptores de las células NK emergentes clave para el reconocimiento del cáncer [15]. Además, estas células tienen la expresión de clase I MHC baja [15]. Las células NK son por lo tanto capaces de reconocer y lisar las células de melanoma humano y el ratón in vitro e in vivo, y para prevenir la metástasis de melanoma en los experimentos de transferencia adoptiva [24]. Por ello, utilizó la línea celular B16 murino, derivado de melanoma murino espontáneo, y demostramos que las células NK matan fácilmente las células tumorales B16, y que este efecto se redujo significativamente cuando se expone a la nicotina (Figura 3C, D). Para investigar las contribuciones de los receptores β2 nAChR para mediar los efectos de la nicotina, realizamos estos experimentos usando nAChR β2
- /- células NK (Figura 3C, D). En todos los experimentos, la deficiencia de β2 nAChR abrogada significativamente los efectos de la nicotina.
Por último, se examina el impacto de la nicotina sobre la producción de citoquinas por las células NK. En comparación con los ratones de control, IFN-gamma, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1 beta y la secreción de TNF-α se redujeron en ratones recibieron nicotina (Figura 3E, F). Una vez más, estos parámetros se invirtieron en gran medida en nAChR β2
- /- ratones. En conjunto, nuestros resultados demuestran que la nicotina afecta las funciones de las células NK incluyendo la proliferación, citotoxicidad hacia YAC-1 de células y células tumorales B16, y la producción de citoquinas. Nuestros resultados también muestran que a pesar de la expresión de múltiples nAChR, β2 nAChR surgieron como un mediador clave de los efectos nicotínicos sobre las células NK, como la deficiencia de nAChR α7 no alterar de manera significativa la influencia de la nicotina en las células NK (datos no mostrados).
nicotina inhibe la transactivación de NF-kB en las células NK a través de β2
nAChR Movilización del factor de transcripción NF-kB es un paso esencial para la activación de las células NK y procede de su actividad y la producción de citoquinas cytotoxicic. Para evaluar el impacto de la nicotina sobre la actividad de NF-kB en las células NK, células NK hemos ordenado del bazo de RAG2
- /- ratones, y se cultivaron las células NK aisladas solo o con nicotina durante 24 h. Se realizó una serie de experimentos en tiempo real PCR se observan los cambios en la abundancia de transcripción, y vimos que la adición de la nicotina suprime la transcripción del gen de NF-kappa B, y IKK, un regulador alternativo de NF-kB en las células NK (Figura 4). Para determinar si β2 nAChR está involucrado, cruzamos de raza RAG2
- /- con nAChR β2
- /- ratones para generar ratones doble knockout. Cuando se utilizaron células NK derivadas de estos ratones, el efecto de la nicotina sobre NF-kappa B y la transcripción IKK se hace mínima (Figura 4). Por lo tanto, nAChR β2 media los efectos de la nicotina sobre NK genes de transcripción celular que son críticos para sus funciones
Las células NK se clasifican a partir de suspensiones de esplenocitos de células individuales de RAG2
-. /- Y RAG2
- /-β2
- /- ratones. NF-kB y el ARNm de las células NK IKK ordenados en β2
+ o β2
/+ - /- ratones recibieron nicotina (Nic) se midió mediante qRT-PCR. Los datos de un experimento de cada dos realizado se muestra, n = 3-4 ratones /grupo. Los valores de p, de Student
t-test
, * p & lt;. 0,05
exposición a la nicotina promueve la metástasis de pulmón, un proceso que depende de nAChR β2
El humo del cigarrillo ha sido demostrado experimentalmente para aumentar de pulmón metastásico carga tumoral [11]. Como múltiples sustancias químicas contenidas en el humo del cigarrillo pueden tener este efecto, hemos tratado de abordar específicamente el papel de exposición a la nicotina en este proceso. Con este fin, hemos adoptado la línea celular B16 murino derivado de melanoma murino espontáneo. Dado que las células tumorales B16 tienen un potencial alto de metástasis de pulmón y metástasis tales pueden ser inhibidas por las células NK, este modelo es ideal para abordar el papel de la nicotina y sus receptores en este proceso patológico. Para este propósito, C57BL /6 RAG2
- /- ratones fueron tratados con nicotina o PBS a través de implantación de la bomba osmótica durante 14 días y más allá. La selección de la dosificación se basa en los fumadores y justificado en detalle en la sección de métodos y en nuestras publicaciones anteriores [7], [8]. Estos ratones fueron desafiados i.v. con 1 × 10
6 B16- células de melanoma. Con base en la literatura [11], [15], [16], nos hicieron experimentos de preparación en el que las tasas de carga tumoral y la supervivencia se compararon en los ratones que recibieron 1 × 10
5, 2.5 × 10
5, 5 × 10
5, 1 × 10
6 y 2,5 × 10
6 células B16.