Extracto
Población secundarios han sido reportados células (SP) que tienen propiedades de células madre, como el cáncer (CSC) en el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), sin embargo, sus características moleculares no han sido completamente aclarada. Aquí nos muestran que, las células NSCLC-SP fueron enriquecidos en G
0 /G
1 fase del ciclo celular, tenía mayor actividad aldehído deshidrogenasa, así como una mayor capacidad clonogénico y auto-renovación en comparación con la población principal (MP) Células. Curiosamente, las células SP también fueron capaces de diferenciarse en trans-angiogénicos túbulos
in vitro Opiniones y eran altamente tumorigénicas en comparación con células MP. SP tumores derivados demostraron la heterogeneidad intratumoral que comprende tanto las células SP y MP, lo que sugiere la auto-renovación y capacidad de diferenciación de células SP se manifiestan
in vivo
también. βArrestin-1 (βArr1) está implicada en la progresión de diversos cánceres incluyendo NSCLC y encontramos que el agotamiento de βArr1 bloqueado significativamente el fenotipo SP; mientras que el agotamiento de βArr2 tenido efectos relativamente menores. La expresión ectópica de βArr1 dio lugar a una mayor expresión de frecuencia SP y ABCG2, mientras que la abrogación de la expresión βArr1 suprimió el crecimiento auto-renovación y expansión de las células A549. proteína anti-apoptótica de Mcl-1 es conocido por ser uno de los reguladores clave de la auto-renovación de las células madre de tejidos y se cree que contribuyen a la supervivencia de células de NSCLC. Nuestros experimentos muestran que los niveles más altos de MCL-1 se expresaron en células SP en comparación con las células MP, tanto a nivel de transcripción y traducción. Además, Obatoclax, un inhibidor farmacológico de MCL-1, podría prevenir eficazmente la auto-renovación de las dos células de NSCLC sensibles y resistentes EGFR-inhibidor. En conclusión, nuestros resultados sugieren que βArr1 y MCL-1 están implicados en la auto-renovación y expansión de las células madre cancerosas y NSCLC son objetivos potenciales para la terapia contra el cáncer
Visto:. Singh S, Bora-N Singhal , J Kroeger, Laklai H, Chellappan SP (2013) βArrestin-1 y MCL-1 modulan la auto-renovación crecimiento del cáncer de células madre como lado en la población de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (2): e55982. doi: 10.1371 /journal.pone.0055982
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 10, 2012; Aceptado: January 4, 2013; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el CA127725 subvención del Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Srikumar P. Chellappan es un editor académico de PLOS ONE; esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
A pesar de los avances terapéuticos significativos, cáncer de pulmón hace que el máximo número de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1 ], [2]. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer de pulmón hará que alrededor de 2,5 millones de muertes por año en el año 2030 [3]. En los Estados Unidos, aproximadamente el 85% de los pacientes diagnosticados con NSCLC, mueren de esta enfermedad dentro de los cinco años [4], [5]. Estos hechos ponen de relieve la necesidad de una mejor comprensión de los eventos celulares y moleculares que subyacen a la génesis de esta enfermedad para el desarrollo de terapias más eficaces. Cáncer de células madre ha surgido como una explicación viable para la iniciación y progresión de los cánceres agresivos como el NSCLC y son potenciales dianas terapéuticas [6], [7], [8], [9], [10].
modelo de célula madre del cáncer sugiere que un subconjunto de células denominadas como células madre, como el cáncer (CSC) dentro del tumor tiene las propiedades desregulados de las células madre normales con sostenida auto-renovación, y puede generar tumores secundarios que recapitular la heterogeneidad y la diversidad del tumor original [9], [11], [12], [13], [14], [15]. Hoechst 33342 tinte exclusión de células, denominado lado en la población de células (SP), se han descrito para tener CSC propiedades similares en una variedad de tumores, incluyendo NSCLC [16], en las que muestran una mayor tumorigenicidad cuando se trasplantan en ratones inmunocomprometidos [17], [ ,,,0],18], en comparación con la población principal (MP). fenotipo SP depende de la capacidad diferencial de las células para flujo de salida el colorante Hoechst 33342 a través de la casete de unión a ATP (ABC) de la familia de las proteínas de transporte, principalmente ABCG2 (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama, BRCP1), que se expresa específicamente en el membrana celular de las poblaciones de células madre [19]. Estudios anteriores han demostrado la existencia de células SP en ciertas líneas celulares de NSCLC humanos establecidos [16] Sin embargo, su caracterización molecular detallada, así como la capacidad funcional para generar tumores heterogéneos quedan por esclarecer. En este estudio, nos proporcionan la prueba global que SP células aisladas a partir de líneas celulares establecidas humanos de NSCLC y los tumores son altamente enriquecido con NSCLC células madre cancerosas. Además, encontramos que ALDH1, que ha sido identificado como un marcador de CSC de otros tipos de tumores, se enriquecen en células SP de NSCLC. Nuestro análisis moleculares muestran que las células madre como propiedades de las células SP se rige por lo menos en parte por el andamio de proteínas, β-arrestina-1; Además, la proteína de la supervivencia de Mcl-1 juega un papel en la auto-renovación de estas células. Así pues, parece que la orientación β-arrestina-1 o MCL1 podría ser medio viable de la inhibición de las propiedades de células madre de células SP de NSCLC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y Reactivos
El no pequeñas líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón de células, A549, H1650, H460 y H1975 se obtuvieron de ATCC y se mantuvieron en RPMI o DMEM containing10% de suero bovino fetal (FBS; Mediatech) en 5% de CO
2 a 37 ° C. A pesar de estas líneas celulares se adquirieron originalmente de la ATCC, no revalidar ellos. Fumitremorgina C (FTC) se adquirió de Sigma Inc y Obatoclax se adquirió de Selleck Químicos LLC.
RNA Preparación y Real Time Analysis qPCR
fue seguido de extracción de ARN y preparación de ADNc como anteriormente [20 descrito ], [21], [22]. PCR en tiempo real se realizó con 1 l de cDNA en un tiempo real sistema de detección por PCR MyiQ (Bio-Rad) utilizando iQ SYBR Green PCR Supermix (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante. Plegables inducciones se calcularon utilizando la fórmula 2
- (ΔΔCt) usando GAPDH como gen de control interno. Los pares de cebadores específicos de gen fueron los siguientes. CD31 (F) 5'-CCTGACAGTGTCTTGAGTGGGTG -3 ', CD31 (R) -3 AGTGATTTTGGCTAGGCGTGGT 5' '; βArr1 (F) 5 'AGAGTCTATGTGACGCTGACCTGC -3', βArr1 (R) 5 'GTTCCTGCAGCCGCGTCAG -3', MCL-1 (F) 5 'ATGCTTCGGAAACTGGACAT -3', MCL-1 (R) 5 '-3 TCCTGATGCCACCTTCTAGG ', GAPDH (F) 5'-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3', GAPDH (R) 5'-GTT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3 '.
Análisis Western Blot
lisados de SP ordenada y células MP se prepararon por lisis NP40 como se describió anteriormente [20]. En resumen, las células según se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Las células se centrifugaron a 800
g
y se lisaron usando tampón de lisis M2 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, NaCl 250 mM, EGTA 3 mM, y 3 mM de EDTA) que contiene proteasa inhibidores. Cantidades iguales de proteínas (50 g) se separaron en SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad), bloqueados por la leche en polvo desnatada al 5% en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 y se incubaron con los anticuerpos primarios apropiados. Los anticuerpos monoclonales contra ABCG2 y βArr1 se adquirieron de Millipore y anticuerpo policlonal contra E2F1 y MCL 1 fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology Inc.
Hoechst 33342 eflujo de ensayo para el análisis y la célula SP Ordenando
Las células adherentes se recogieron usando accutase reactivo (Sigma Inc). Para explantes tumorales, tejido tumoral humano primario crecido en ratones desnudos atímicos se desmenuzó, enzimáticamente digerido con 0,2% de colagenasa IV (Worthington Biochemical Corporation) preparado en el 10% de FBS medio que contiene por 60 minutos a 37 ° C. La digestión se desglosarse pasando a través de la pipeta 10 ml varias veces y se filtró a través de filtro de células 100/70-micras para obtener una suspensión de células individuales. Las células se lavaron y se resuspendieron en DMEM /F12K con 2% de FBS a 1 × 10
6 células /densidad ml y se incubaron con 4 g /ml de colorante Hoechst 33342 (Invitrogen) durante 90 minutos a 37 ° C en presencia o ausencia de 1 M FTC, como se describe por Goodell et al. [23]. Las células se incubaron con 2 g /ml de yoduro de propidio (PI; Sigma Inc) antes del análisis para visualizar y excluir las células no viables. El colorante Hoechst 33342 se excitó a 350 nm usando láser UV y su fluorescencia se analizó usando 400-500 nm filtro de BP para la emisión de color azul y 640-680 nm filtro de BP en combinación con 655 nm LP-filtro para la emisión de color rojo. Los citómetros de flujo de BD Biosciences fueron utilizados para la adquisición de datos. Los datos fueron adquiridos utilizando LSRII o FACS Vantage (DIVA), y se clasifican mediante FACS Vantage (DIVA) clasificador de células. Los análisis de datos se realizaron utilizando el software FlowJo (Árbol de la estrella).
Aldefluor Ensayo
El kit Aldefluor se utilizó para el perfil y las células separadas con alta actividad de ALDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stem Cell Technologies). Brevemente, Hoechst 33342 células teñidas se incubaron con sustrato de proteína ALDH BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA) en tampón de ensayo Aldefluor suplementado con 1 mM FTC para evitar que el flujo de salida de colorante Hoechst. Después de 45 minutos de incubación a 37 ° C, las células que podrían convertir BAAA a su producto fluorescente BODIPY-aminoacetato (BAA) se consideraron ALDH-Hi. Las puertas para el análisis de citometría de flujo se dibujan en relación con la fluorescencia de línea de base, que se determinó mediante la adición de inhibidor de ALDH diethylaminobenzaldehyde-específico (DEAB). Las muestras tratadas con DEAB solo sirvieron como control negativo.
Formación Esfera o auto-renovación de las células de ensayo
Ordenada SP o MP se sembraron en la adhesión de ultra bajo placas de 96 pocillos (Corning) a la densidad de 10.000 células /ml (1000 células /pocillo en 100 l de medio) en suero libre de DMEM /F12K (1:1) (Invitrogen), complementado con suplemento 1X-N2 (Invitrogen), 10 ng /ml de EGF y 10 ng /ml bFGF (Sigma) y se dejó crecer durante 10 días. Las imágenes de las esferas fueron tomadas con el microscopio de contraste de fase (Nikon) y el número total de esferas más de 60 micras se contaron. Para estudiar el efecto de los fármacos sobre la autorrenovación de las células SP, se añadieron los fármacos a los pocillos respectivos en el día 1 y el 5 y el tamaño (& gt; 60 micras) y se analizaron varias de las esferas en el día 10.
se utilizaron ratones SCID-amarillento femeninos
en vivo
ensayo de la formación de tumores.
5 semanas de edad para estos experimentos bajo un protocolo que fue aprobado por el Comité de uso y Cuidado de Animales institucional en la Universidad del Sur de Florida (Animal Welfare Aseguramiento Número A4100-01). SP Ordenado o células MP de la línea celular H1650 se lavaron con suero libre de DMEM-F12K y se suspendieron en una mezcla 01:01 de factor de crecimiento reducido Matrigel (BD) y HBSS a números indicados y implantado subcutáneamente. Los volúmenes tumorales se determinaron una vez por semana mediante la medición de longitud (
L
) y anchura (
W
), y el volumen calculado mediante la fórmula
V =
1/2 ×
L
×
W
2as se describe anteriormente [21], [22], [24], [25]. El estado de la salud de los ratones fue monitoreada diariamente para detectar signos de malestar, incluyendo la inactividad, hipoactividad, hiperactividad, inquietud, auto-trauma, la agresividad, el aislamiento de los compañeros de jaula, ataxia, poco profunda, respiración rápida y /o con dificultad, palidez de mucosas, cianosis , ausencia de limpieza, caquexia, ensucia el área anogenital, la falta de respuesta a los estímulos, falta de curiosidad, vocalización, ascitis, o la postura y /encorvado. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Al final del experimento, los animales se sacrificaron por la exposición a concentraciones crecientes de CO
2 en un dedicado CO cámara
2; Se utilizó gas comprimido una fuente de CO
2.
Métodos Estadísticos
Los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). Para evaluar la significación estadística de las diferencias, se realizó la prueba t
del estudiante. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Microsoft Excel. Los datos se consideraron estadísticamente significativas cuando el
p
valor era inferior a 0,05.
Resultados
SP células de NSCLC Demostrar propiedades de células madre similares a
se hicieron intentos para evaluar el porcentaje de células SP en cuatro líneas celulares de cáncer humanas diferentes, elegidos sobre la base de K-Ras o el estado de mutación del EGFR. A549 (mutantes K-Ras; tipo de amplificación de EGFR salvaje) y H460 (K-Ras mutante), así como H1650 (mutantes EGFR; Exon 20 eliminación: delE746-A750) y H1975 (mutantes EGFR; L858R y mutaciones T790M) células contenidas SP -Cells con diferentes frecuencia que va desde aproximadamente 8% (H1975) a 40% (H460). Un inhibidor específico de ABCG2 [26], Fumitremorgina C (FTC) podría bloquear la aparición de células SP (Figura 1A), lo que sugiere que este transportador particular, juega un papel específico en el mantenimiento del fenotipo SP. Estos resultados sugieren que las células SP están presentes en las líneas de NSCLC, y su prevalencia es independiente de K-Ras o estado de la mutación EGFR.
(A) FACS análisis en suspensión de células individuales de líneas de células de NSCLC humanos teñidos con Hoechst 33342 teñir mostrando células SP. SP células están encerrados dentro de la zona delimitada de color rosa. Fumitremorgina C inhibió el flujo de salida del colorante y causó la desaparición de células SP. La frecuencia de células SP está representado. (B, C) análisis del ciclo celular con el parámetro de área histograma para la emisión azul de Hoechst 33342 como se describe en el texto. El perfil se muestra en la B es el representante de todos los cuatro líneas celulares. (D) ensayo de Aldefluor a Hoechst 33342 manchada H1975 y H1650 células. La fluorescencia de línea base fue establecida mediante la inhibición de la actividad de ALDH con DEAB (Izquierda) para generar la puerta para identificar las células ALDH-Hi en total, así como el SP y células MP que no han sido incubadas con DEAB (tres paneles de la derecha). Todas las células ALDH-Hi están encerrados dentro de la zona delimitada de color rosa. La diferencia veces en la frecuencia de células ALDH-Hi entre SP y las células MP se representa.
Se ha propuesto que las células madre de tejido normal y las células iniciadoras de tumores de tallo como tienen diferentes perfiles del ciclo celular en comparación con células diferenciadas, y que progresan a través del ciclo celular más lenta [27], [28]. Teniendo en cuenta estos antecedentes, hicimos intentos de examinar si el perfil del ciclo celular de las células SP difería de la de las células diferenciadas MP. Para examinar la distribución del ciclo celular, el perfil del histograma generado a partir del parámetro de área de emisión azul de Hoechst 33342 se utilizó para examinar la distribución de fase del ciclo celular para SP y las células MP. Dado que el tratamiento FTC permite tanto SP y las células MP para retener el colorante Hoechst 33342, se utilizó esta muestra para marcar los límites de G
1 y S-G
2 /M fases, en función de su contenido de ADN. puertas similares se aplican para las muestras en las que no se añadió FTC y por lo tanto las células SP apareció como un sub-G
0 /G
1 población (Figura 1B). Tras la comparación de la distribución de las células de FTC tratados y no tratados, se encontró que 80 a 100% de las células estaban en el SP G
0 /G
1 fase del ciclo celular, dependiente de la línea celular (Figura 1C). En todos los casos, las células SP tenían más G
0 /G células
1 que las células MP de la misma línea celular, lo que sugiere que han atenuado la progresión del ciclo celular característica de las células madre similares.
se realizaron experimentos para examinar si otros marcadores de células madre de cáncer se expresan en células SP. Hacia este fin, la citometría de flujo se realizó para la actividad de aldehído deshidrogenasa (ALDH-Hi) que ha sido utilizado recientemente como un marcador potencial para identificar células madre cancerosas en NSCLC [29], [30]. Análisis utilizando el kit de ensayo de Aldefluor en líneas celulares H1650 y H1975 mostró 8 y 6 veces mayor frecuencia de células ALDH-HI de células SP en comparación con células MP, lo que sugiere que las células SP aisladas a partir de líneas celulares de NSCLC se enriquecen en tallo como las células (Figura 1D), como se ve por la expresión de un marcador diferente. En general, aproximadamente el 1,3% de las células H1650-SP y el 2% de las células H1975-SP fueron células ALDH-Hi.
Las células SP diagrama de tallo Características de las células-como
in vitro
in vitro se llevaron a cabo experimentos
para caracterizar aún más la SP y MP células. Tras la clasificación de células, las células se colocaron en placas a alta densidad (10.000 células /pocillo en placa de 96 pocillos) en medio completo y monitoreados durante 6 días por ensayo MTT. células MP H1650-SP y tenía capacidad de proliferación comparable cuando se cultiva en medio completo en condiciones adherentes (Figura 2A), lo que sugiere que tanto las fracciones de células clasificadas son igualmente saludable y Hoechst 33342 tinción de colorante para el análisis de SP y de células protocolo de clasificación no tuvo ningún efecto perjudicial sobre la estas células. Un rasgo característico de las células madre es su capacidad de auto-renovación y también para dar lugar a células más diferenciadas, a través de la división asimétrica [15]. Auto-renovación normal o cáncer de tallo como las células puede crecer esferas como no adherentes cuando se cultivan a baja densidad en suero libre, medio selectivo de células madre; células diferenciadas no crecen ni se forman las esferas en este medio [13], [31], [32]. La propiedad de auto-renovación de células SP se examinó mediante la realización de análisis de formación de la esfera usando células SP y MP aislada de células H1650. Mientras que las células SP fueron capaces de crecer como esferas, las células MP tuvieron mucho menos capacidad de crecer en condiciones similares (Figura 2B) lo que sugiere que la auto-renovación característica capacidad de las células madre se visualiza solamente por las células SP. A continuación, examinó el potencial clonogénico de células tanto MP SP y cultivando en placa las células y el cultivo a densidad clonal (1000 células en 60 mm placa) durante 21 días en FBS medios que contienen. En este panel, las células se colocaron en placas a una densidad muy baja, y se comprobó su proliferación a largo plazo y la capacidad de formación de colonias. Como se muestra en la Figura 2C, la formación de grandes colonias fue sustancialmente mayor entre las células SP de lo que era entre las células MP. La viabilidad de las células formadoras de colonias se determinó mediante el ensayo de MTT (Figura 2D), proporcionando evidencia de que colectivamente células SP pantalla aumentaron clonogenicidad.
(A) Curva de crecimiento en 10.000 células H1650-SP o MP se generaron utilizando MTT ensayo de proliferación celular en medio de crecimiento normal [22]. (B) SP o MP células de la línea celular H1650 se cultivaron en medio libre de suero suplementado con EGF y bFGF durante 10 días. El número medio (± SD) de las esferas a partir de 1000 células se representa. las células (C) H1650-SP resultó en colonias más grandes y más en comparación con las células MP cuando se siembran a una densidad de 1000 células por placa de 60 mm. viabilidad (D) de la célula se ensayó después de 21 días de chapado a través de ensayo de MTT. (E) células SP o MP se sembraron en Matrigel y se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (Lonza) durante la noche. SP células dieron lugar a angiogénicos como túbulos con eficacia. (F) en tiempo real qPCR análisis de células SP y MP realizadas por
CD31
la expresión del ARNm. (G) la expresión de CD31 en los túbulos angiogénicos como se visualiza por inmunofluorescencia.
se ha informado de ciertos tipos de tumores para demostrar mimetismo vascular, debido a la capacidad de las células tumorales para adquirir propiedades de las células endoteliales y otros celular componentes de la vasculatura [33], [34], [35]. El papel de las células madre del cáncer en este contexto ha sido examinado y, evidencias recientes sugieren que las células madre cancerosas de los gliomas podrían trans-diferenciarse en el linaje endotelial [33], [34], [35]. Teniendo en cuenta estos antecedentes, se analizó la capacidad de las células H1650 SP para formar túbulos angiogénicos
in vitro
. Las células H1650-SP chapada en Matrigel forman una red de túbulos angiogénicos tras el tratamiento con VEGF, mientras que las células MP se deterioraron significativamente en esta habilidad (Figura 2E). Se encontró que las células MP se mantuvieron relativamente desorganizada, en comparación con el túbulo organizada como estructuras formadas por las células SP. Se realizaron experimentos para evaluar si el túbulo como estructuras formadas por células SP mostrar características bioquímicas de los vasos angiogénicos. Hacia este fin, un tiempo real se llevó a cabo primero el análisis de PCR, lo que demostró una mayor expresión de específico endotelial
CD31
mRNA en células SP en comparación con células MP (Figura 2F). Además, la tinción de inmunofluorescencia de los túbulos mostró que estos túbulos formados por células SP fueron fuertemente positivas para la expresión CD31 (Figura 2G), lo que sugiere que las células SP puede alcanzar un linaje endotelial. Estos experimentos se produjo indicó que las células SP aisladas a partir de una línea celular de NSCLC pueden transdifferentiate en células similares a las endoteliales y podrían ser capaces de dar lugar a los túbulos angiogénicos en los tumores.
Las células SP están enriquecidas con células tumorigenos y demostró Auto- renovación y diferenciación de las células SP
in vivo
Teniendo en cuenta la capacidad de las células SP para auto renovarse y diferenciarse en los túbulos angiogénicos, así como células MP, el próximo examinó la capacidad de las células SP o MP para formar tumores en ratones SCID. SP y MP células de la línea celular H1650 se implantaron subcutáneamente en los flancos dorsales de ratones SCID y evaluaron semanalmente el crecimiento del tumor por mediciones de la pinza. Como se muestra en la Figura 3A, cuatro ratones (n = 5) inyectado con 10.000 células SP tumores grandes producidos (volumen ~1400 mm
3) dentro de 11 semanas de la implantación. Sin embargo, los números similares de células MP fueron significativamente afectada en su capacidad para formar tumores en el mismo período de tiempo; los tumores fueron relativamente pequeños y se mantuvo cerca del tamaño implantado (volume~100 mm
3) (Figura 3B). Además, las células SP formaron tumores incluso con 1.000 células (volumen ~471 ± 141 mm
3) después de 19 semanas de la implantación, mientras que no se pudo número similar de células MP para generar cualquier tumor (Figura 3A).
(A) Ordenada SP y MP células de la línea celular H1650 se implantaron en los costados de ratones SCID. la incidencia de tumores y el volumen medio (± error estándar) de los tumores formados dentro de la hora indicada se tabulan. cinética (B) El crecimiento de los tumores de células SP y MP, midieron semanalmente. Los puntos representan la media (± error estándar). (C) los tumores subcutáneos derivados de 10.000 células H1650-SP o 100.000 células H1650-MP se resecaron y se analizaron para fenotipo SP en presencia o ausencia de FTC. Los tumores de células SP y MP MP contenían células predominantemente diferenciadas.
Para dilucidar si los tumores generados a partir de células SP SP tenían heterogéneo y células MP, se realizó la tinción de Hoechst 33342 y SP análisis después de la disociación enzimática de tumor subcutáneo xenoinjertos. Los tumores generados a partir de 10.000 células H1650-SP estaban compuestas principalmente de células MP mientras que las células SP se mantuvieron a la frecuencia de aproximadamente 3% en el tumor (Figura 3C, panel superior). Estos resultados indican que las células SP son altamente enriquecido con células madre cancerosas que son dan lugar capaz de tumores, así como la auto-renovarse y diferenciarse a sí mismos
in vivo
. Sin embargo, los tumores generados en un ratón (de tres) tras la implantación de 100.000 células H1650-MP demostraron la desdiferenciación de células MP para generar células SP
in vivo gratis (Figura 3C, panel inferior), después de 9 semanas en estos ratones (Figura 3B). De hecho, se ha informado de que las células cancerosas diferenciadas podrían ser capaces de de-diferenciar y adquirir propiedades madre-como en ciertos casos [36], probablemente facilitando el retraso en el crecimiento de los tumores.
βArr1 Regula la auto-renovación Crecimiento de células SP
βarrestin-1 (βArr1) es una proteína de andamiaje que juega un papel importante en la desensibilización de los receptores acoplados a la proteína G [20], [37], [38], [39], [40]. Estudios recientes han demostrado que βArr1 juega un papel en la activación de quinasas Src por diversos receptores y podría facilitar la proliferación de células de cáncer de pulmón [38], [41]. Además, se encontraron niveles βArr1 a ser elevados en CPNM metastásico y otros tipos de cáncer en comparación con el tejido normal o tumores primarios [20], [39], [40], [41]. Dada la correlación de βArr1 con la progresión tumoral y la metástasis, se examinó si esta proteína juega un papel en las propiedades de células madre de células SP. En la primera serie de experimentos, los siRNA a βArr1 o los genes relacionados βArr2 se transfectaron en células H1650, H1975 y A549; un siRNA no director se utilizó como control. Se encontró que la transfección transitoria de βArr1 siRNA específico disminuyó la frecuencia de células SP en aproximadamente 40 a 70%; la reducción fue sólo del 10 al 20% cuando βArr2 siRNA se transfectó (Figura 4A); lo que sugiere un papel importante de βArr1 en la regulación de la frecuencia SP. Para aclarar aún más el papel de βArr1 en las funciones de madre, de células SP, hemos generado células A549 que sobreexpresan de forma estable rata βArr1, o aquellos que fueron transfectadas de forma estable con un shRNA a βArr1. Se encontró que las células que sobreexpresan de forma estable βArr1 tenían aproximadamente tres más células SP veces en comparación con las células control que expresaban de forma estable A549 GFP (A549-GFP). A la inversa, el agotamiento estable de βArr1 usando un shRNA específica (A549-shβArr1) resultó en una disminución significativa en la frecuencia SP en comparación con una línea celular de control que fue transfectada de forma estable con un shRNA no director (A549-Control) (Figura 4B). se llevaron a cabo en tiempo real PCR experimentos para evaluar si los cambios en la frecuencia SP correlacionados con diferentes niveles de ABCG2. Se encontró que el A549 que sobreexpresan de forma estable βArr1 tenía dos veces más mensajes ABCG2 comparación con las células transfectadas con GFP. Por el contrario, las células agotadas de βArr1 tenían significativamente más bajos en comparación con ABCG2 mensaje de control de las células que expresan shRNA (Figura 4C). Estos resultados fueron confirmados por Western Blot (Figura 4D); se encontró que células nulas βArr1 tenían menores cantidades de ABCG2, así como βArr1, pero cantidades comparables de β-actina y E2F1, que se utilizaron como controles.
(A) H1650, se transfectaron células H1975 y A549 con siRNA contra βArr1 y βArr2. Frecuencia de células SP se comparó con las células no transfectadas siRNA la orientación de control. SP células están encerrados dentro de la zona delimitada de color rosa. diagramas de barras representan la diferencia veces en la frecuencia en las células transfectadas siRNA en las líneas celulares respectivas. Se analizó (B) Frecuencia de SP y representó para las células A549 que expresan ectópica de ratas βArr1 o GFP y shRNA contra βArr1 o control no director shRNA. (C) PCR en tiempo real y (D) el análisis de Western-blot para la expresión ABCG2 se realizó para estas líneas celulares estables. Las células A549 (E, F, G) de forma estable que expresan shRNA contra βArr1 y no la orientación shRNA se sembraron para el ensayo de auto-renovación. se presentan (E) Fase imágenes de microscopía de contraste de las esferas en presencia o ausencia de las drogas. (F, G) Número medio y tamaño de las esferas generadas por pocillo de células 1000 se traza (media ± DE).
Teniendo en cuenta el papel de βArr1 en la generación de células SP, el próximo examinó si esta proteína facilita la auto-renovación también. Hacia este fin, se aislaron células SP a partir de células A549 que expresan de forma estable una shRNA contra βArr1 o un control no la orientación shRNA y la propiedad de auto-renovación evaluada mediante ensayos de formación de la esfera. Se encontró que las células que carecen βArr1 tenían marcadamente menor número de esferas (Figura 4E); Además, el tamaño de las esferas formadas por células nulas βArr1 fue marcadamente inferior que las formadas por las células SP a partir de células de control (Figura 4F, G). Estos experimentos muestran claramente que el andamio de proteínas βArr1 juega un papel en el establecimiento de células SP a través de la regulación de la expresión ABCG2 y facilita también la propiedad de auto-renovación de estas células madre similares a NSCLC.
Inhibidor de Mcl- 1 Objetivos de la auto-renovación de crecimiento de las células SP
mejorado la supervivencia celular y la resistencia a los medicamentos es una característica de las células madre del cáncer [10], [42]. La proteína anti-apoptótica MCL-1, se encuentra entre los genes amplificados con mayor frecuencia en el cáncer humano incluyendo NSCLC [22], [43], [44],. Recientemente, los estudios también han asociado la función de MCL-1 con la regulación de la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas [48], [49]. Teniendo en cuenta el papel potencial de MCL-1 en las células madre hematopoyéticas, que exploraron si la función de MCL-1 contribuye a la propiedad de auto-renovación de las células NSCLC-SP. Como primer paso, QRT-PCR se llevó a cabo en ARN aislado de células SP y MP aislada de H1650, líneas celulares A549 y H1975. MCL-1 mensaje se expresó en niveles altos en células SP de todos los tres líneas de células (Figura 5A). El nivel de proteína MCL-1 también fue elevada en células SP en comparación con las células MP en todas las tres líneas celulares, como se ve por el Western Blot (Figura 5B).
(A, B) Expresión relativa de MCL-1 fue examinado en ARNm y los niveles de proteína para las líneas celulares indicadas por RT-PCR y análisis de transferencia Western. (C) Estructura de Obataoclax y su esquema de tratamiento está representado. se clasificaron las células (D) H1650-SP y se sembraron para el ensayo de auto-renovación en presencia o ausencia de Obatoclax a la concentración indicada. Promedio del número de esferas generadas por pocillo de células 1000 se traza (media ± DE). se presentan Fase imágenes de microscopía de contraste de las esferas en presencia o ausencia de las drogas. células SP (E) se clasificaron de la línea celular H1975 resistente al erlotinib y se sembraron para el ensayo de auto-renovación en presencia o ausencia de fármacos indicados. se presentan número medio de esferas generados por pocillo a partir de 1000 células se traza (media ± SD) y (F) de microscopía de contraste de fase imágenes de las esferas en presencia o ausencia de las drogas. (G) Análisis de Western-blot de βArr1 y βArr2 en células Obatoclax tratados. La inhibición de MCL-1 no afectó a la expresión de βArr1 y βArr2 en cualquiera de las líneas celulares ensayadas.
Obatoclax es una molécula hidrófoba (Figura 5C) que fue desarrollado como un antagonista de la familia Bcl-2 incluyendo MCL-1 [50]. Obatoclax se ha demostrado para superar la resistencia a la apoptosis mediada específicamente por MCL-1 [51]. Por lo tanto, aquí se utilizó Obatoclax para explorar el papel de MCL-1 en la auto-renovación de células SP, mediante la realización de ensayos de formación de la esfera en la presencia o ausencia de Obatoclax. Como se muestra en la Figura 5C, las células se sembraron a 1 día de ensayo de formación de esfera y Obatoclax se añadió en day1 y día 5 en dosis indicada. Después de 10 días de la siembra el número de esferas se contaron y se analizaron. Como se muestra en la Figura 5D, la inhibición de la actividad de Mcl-1 por 200 nM de Obatoclax demostró una disminución pliegue 4-5 en el número de esferas; aún más el tamaño de las esferas también se redujo significativamente, como se muestra en la imagen superior de la barra (Figura 5D). Una concentración de 500 nM de Obatoclax suprimió por completo la formación de esferas (Figura 5D).
El erlotinib y gefitinib son inhibidores de EGFR que muestran una eficacia significativa en el tratamiento de pacientes con CPNM con mutaciones de EGFR [52], [53]. Al mismo tiempo, un punto de mutación secundaria en el exón 20 de EGFR (T790M) se asocia con la resistencia adquirida a los inhibidores de EGFR, incluyendo Erlotinib [52].