Extracto
Antecedentes
G-receptores acoplados a proteínas (GPCRs) son los principales candidatos para la prevención del cáncer y la novela estrategias de tratamiento. Se realizaron búsquedas de los GPCR expresados diferencialmente en los carcinomas gástricos ganglios positivos.
Metodología /Principales conclusiones
La expresión diferencial de los GPCRs en tres nodos positivos vs. tres nodos de tipo intestinal negativo carcinomas gástricos se analizó mediante conjunto de genes tecnología. El genes candidatos CXCL12 y su receptor CXCR4 fueron validados por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real en un conjunto independiente de 37 carcinomas gástricos. La traducción se estudió mediante inmunohistoquímica en 347 carcinomas gástricos utilizando microarrays de tejidos, así como en 61 que coinciden con metástasis en los ganglios linfáticos. La expresión de proteínas se correlacionó con las características del paciente clínico-patológicos y supervivencia. 52 GPCRs y los genes relacionados con el GPCR eran hacia arriba o hacia abajo-regulada en el cáncer gástrico ganglios positivos, incluyendo CXCL12. Expresión diferencial de CXCL12 fue confirmada por RT-PCR y se correlaciona con el crecimiento tumoral local. immunopositivity CXCL12 se asoció negativamente con metástasis a distancia y el grado del tumor. Sólo el 17% de los carcinomas gástricos mostró células tumorales immunopositive CXCR4, que se asoció con una mayor extensión local del tumor. 29% de los carcinomas gástricos mostró CXCR4 microvasos tumorales positivas. la expresión de CXCR4 vascular se asoció significativamente con una mayor extensión del tumor local, así como mayores UICC-etapas. Cuando se expresa tanto, CXCL12 en células tumorales y CXCR4 en microvasos tumorales, estos tumores también fueron muy significativamente asociados con una mayor T y UICC-etapas. Tres metástasis en los ganglios linfáticos reveló la expresión de CXCR4 vascular mientras que las células tumorales por completo carecían de CXCR4 en todos los casos. La expresión de CXCL12 y CXCR4 no tuvo impacto en la supervivencia del paciente.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados corroboran la importancia de los GPCRs en la biología de los carcinomas gástricos y proporcionan evidencia de que la vía de CXCL12-CXCR4 podría ser una diana muy prometedor antiangiogénico para el tratamiento de carcinomas gástricos
Visto:. Ingold B, E Simon, Ungethüm T, RJ Kuban, Müller BM, Lupp a, et al. (2010) Vascular CXCR4 expresión - una novela antiangiogénico de destino en el cáncer gástrico? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10.1371 /journal.pone.0010087
Editor: Irene Oi Lin Ng, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: septiembre 22, 2009; Aceptado: March 16, 2010; Publicado: 8 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Ingold y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Berliner Krebshilfe (Berlín Canceraid). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo, ocupando el cuarto lugar en frecuencia general y la contabilidad de más de 650.000 muertes al año [1]. La mortalidad de cáncer gástrico es sólo superado por el cáncer de pulmón. cáncer gástrico temprano a menudo no produce síntomas específicos. La falta de síntomas tempranos retrasa el diagnóstico. En consecuencia, el 80-90% de los pacientes occidentales con cáncer gástrico se presentan con tumores avanzados, cuando las metástasis locales o distantes ya se había producido [1]. El estado de los ganglios linfáticos, especialmente la relación de los ganglios linfáticos de metástasis-positivo /negativo metástasis, es el factor pronóstico más fuerte de cáncer gástrico [2]. La tasa de supervivencia a 5 años para los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos 1-6 es del 44% y terminando con sólo el 11% en pacientes con más de 15 ganglios linfáticos positivos. La gastrectomía parcial o total, combinado con radioterapia adyuvante y /o quimioterapia, como se indica, promete la curación completa sólo en los pacientes con enfermedad en estadio temprano. En la enfermedad metastásica, que actualmente se utilizan regímenes quimioterapéuticos y radioterapéuticos tienen escasa eficacia y la enfermedad resistente al tratamiento progresión conduce a la muerte dentro de unos meses [3]. Hasta la fecha, no existe un marcador predictivo específico, como en carcinoma de mama HER2, EGFR en carcinoma de pulmón de células no pequeñas o K-RAS en el carcinoma colorrectal, lo que permite una estrategia terapéutica más individualizada. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques terapéuticos moleculares dirigidas.
G-receptores acoplados a proteínas (GPCRs) constituyen, con mucho, la mayor familia de moléculas de la superficie celular, que transmiten señales a través de la proteína de unión a GTP (proteína G ) -initiated segundo cascadas de mensajero en la célula [4]. Los GPCR están regulados por diversos agonistas, pero todos comparten una característica central, formado por siete transmembrana α-hélices, que están vinculados a través de tres intra y tres bucles extracelulares. Estos receptores controlan las funciones fisiológicas importantes, incluyendo la neurotransmisión, la hormona y la liberación de enzimas de las glándulas endocrinas y exocrinas, la respuesta inmune, la contracción muscular y la regulación de la presión arterial, por nombrar algunos [4].
Las células malignas a menudo secuestran el fisiológica normal funciones de los GPCR para sobrevivir, proliferar de forma autónoma y evadir el sistema inmune. Además GPCRs juegan un papel central en la angiogénesis inducida por tumor y metástasis del cáncer. Muchos tumores sólidos dependen de GPCRs para provocar una respuesta angiogénica ya sea actuando sobre los componentes endoteliales o estromales directamente o por medio de regulación de la liberación o actividad de otros mediadores angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) por estromales y células del sistema inmune [5]. Las células cancerosas se manipulan los GPCR para atraer a las células endoteliales y llevarlos a invadir la masa tumoral, formando de este modo nuevos vasos para proporcionar nutrientes y oxígeno. Muchos cánceres hacen metástasis a órganos específicos, lo que con frecuencia es causada por la expresión aberrante de los GPCR en las células cancerosas - receptores de quimioquinas en especial - concomitante con la liberación de quimiocinas de los órganos secundarios [6]
El suministro de fármacos, imágenes de tumores. y biomarcadores predecir la malignidad de las aplicaciones de GPCRs para resaltar: péptidos marcados-Radio que se unen a los GPCR pueden tener amplias aplicaciones para el diagnóstico y la terapia del cáncer [7]. Los ligandos que se unen GPCRs también se han conjugado a agentes citotóxicos para dirigirse específicamente a las células malignas que sobreexpresan estos receptores, por lo tanto, reducir los efectos secundarios [8]. Por otra parte, los GPCR pueden ser biomarcadores valiosos para el diagnóstico del cáncer como lo demuestran los estudios en cáncer de próstata [9].
Por lo tanto, el objetivo fue (i) evaluar los GPCR expresados diferencialmente en ganglionar negativo frente al tipo intestinal carcinoma gástrico positivo ganglionar por GeneChip técnica de matriz. (Ii) La transcripción de genes candidatos fue validado por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (en tiempo real RT-PCR). Se evaluó la traducción y distribución histoanatomical de la quimiocina CXCL12 y su correspondiente receptor de quimiocinas CXCR4 en una gran serie de 347 muestras de carcinoma gástrico inmunohistoquímica utilizando el microarray la tecnología de tejidos, así como en 61 que coinciden con metástasis en los ganglios linfáticos en las diapositivas convencionales (III). Se correlacionaron los patrones de expresión de traslación con un amplio conjunto de características clínico-paciente, incluyendo la supervivencia de los pacientes (iv).
Resultados
La expresión génica diferencial en el nodo positivo tejido de cáncer gástrico
negativo y el nodo
en primer lugar, se estudió la expresión diferencial de mRNA en una serie de pacientes con cáncer gástrico de tipo intestinal (6 3 con 3 y sin metástasis en los ganglios linfáticos) utilizando el Genoma humano U133 Plus 2.0 GeneChip® matriz de Affymetrix que detecta 47.000 transcritos y variantes así como 38.500 genes humanos bien caracterizados. ARNm se extrajo y se transcribe solamente a partir de muestras de tejido obtenidas a partir de los tumores primarios. Un total de 115 transcripciones se comprobó que estaban arriba y hacia 219 a ser reguladas en el cáncer gástrico ganglios positivos en comparación con los ganglios negativos cáncer gástrico (Tabla S1). A continuación se realizaron búsquedas de los GPCR expresados diferencialmente. Se identificaron 52 genes relacionados con los GPCR y GPCR, que estaban arriba o hacia abajo reguladas con un factor de cambio múltiplo de & gt;. 1.5 (tabla S2) guía
En silico análisis
a continuación, buscó el
ENTREZ
base de datos de la "
Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)
" para las entradas de los GPCR y GPCR ligandos y su supuesto papel en la biología del tumor . La importancia de la angiotensina II tipo 1-receptor en el cáncer gástrico se verificó previamente por nuestro propio grupo [10]. Varios estudios han demostrado que la expresión del receptor de quimioquinas grupo sanguíneo Duffy (DARC) correlacionada inversamente con la prevalencia y el pronóstico de cáncer de próstata [11] - [13]. En el modelo animal de cáncer de mama la expresión de EDG2 correlacionada con la incidencia de metástasis de pulmón [14]. FPRs median el efecto de anexina 1 sobre la motilidad celular y la invasión, que son importantes para el potencial metastásico de las células tumorales [15]. LGR5 se mostró recientemente a ser un marcador de células madre de las células del intestino delgado y colon y células madre pérdida específica de los resultados de APC en neoplasias que crecen progresivamente [16]. En conjunto, estos datos proporcionan evidencia de que nuestro enfoque identificado los GPCR y GPCR ligandos que pueden estar implicados en la biología del cáncer gástrico. En cuanto a los receptores de quimioquinas y quimiocinas, la expresión de la CCL2 quimiocinas CXCL12 y se incrementaron en el cáncer gástrico positivo nodal en comparación con los casos negativos nodales (Tabla S2). Dado que el eje CXCL12-CXCR4 juega un papel importante en la génesis tumoral, promoción de la angiogénesis y la migración de las células tumorales a los sitios de metástasis [17] - [19], se seleccionaron CXCL12 y su receptor CXCR4 para profundizar el análisis
Transcripción de. CXCL12 y CXCR4 en el cáncer gástrico
La expresión diferencial de CXCL12- y CXCR4 ARNm fue validado por tiempo real RT-PCR en un conjunto independiente de muestras de carcinoma gástrico tipo intestinal 37. Se comparó la mucosa no neoplásica con el tumor primario, así como los tumores primarios de ganglios negativos con tumores primarios de cáncer de ganglios positivos.
CXCL12 expresión fue significativamente mayor en el carcinoma gástrico en comparación con la mucosa no neoplásica (p = 0,033 ). Confirmando los datos de la matriz, la expresión de CXCL12 fue también hasta reguladas en el carcinoma gástrico positivo ganglionar en comparación con los casos negativos nodales. Sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación estadística (p = 0,132; figura 1a). En cuanto al crecimiento local del tumor, no hubo diferencia significativa en la expresión CXCL12 en pT1 estadio tumoral /T2 frente a tumores /T4 pT3. Pero de manera interesante, la expresión de CXCL12 mostró una asociación significativa en pT1 /pT2a frente pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; figura 1b)
Boxplots que representan la distribución general de CXCL12 en (a) ganglionar negativo frente gástrica positivo nodal. carcinomas y en (b) pT1 /T2a frente a carcinomas /T3 /T4 gástricos pT2b. En general, la distribución de CXCR4 en (c) ganglionar negativo frente a los carcinomas gástricos positivos nodales y (d) pT1 /T2a contra los carcinomas gástricos pT2b /T3 /T4. los límites de la caja: 25
º y 75
º percentiles; línea continua: la mediana; bigotes:. 10
º y 90
º percentiles
No había ni una diferencia de expresión de CXCR4 en el carcinoma gástrico en comparación con el tejido no neoplásico (p = 0,229) ni en ganglionar negativo frente carcinoma gástrico ganglionar positiva (p = 0,22; figura 1c). Al comparar la expresión de CXCR4 con la extensión local del tumor, los niveles de ARNm de CXCR4 se incrementaron con el crecimiento local del tumor. (P = 0,079; figura 1d)
Traducción de CXCL12 en el carcinoma gástrico, correlación con los parámetros clínico-patológicos y análisis de supervivencia
La traducción y distribución histoanatomical de CXCL12 se estudió posteriormente por inmunohistoquímica en 347 muestras de carcinoma gástrico. En 291 casos, CXCL12 inmunoreactividad fue evaluable. Las células tumorales expresan CXCL12 en 244 de 291 muestras (84%). Una intensa expresión citoplasmática y membranosa se observó en 143 (49%) casos y una tinción débil en 101 (35%). 47 tumores (16%) carecían de CXCL12-inmunoreactividad. Todas las muestras tumorales mostraron una positividad CXCL12 distinta de las células endoteliales vasculares, que sirvió como un control positivo interno (Figura 2a-c). Los análisis estadísticos mostraron una correlación significativa entre la expresión de CXCL12 en las células tumorales y las metástasis distantes (p = 0,043), así como el grado del tumor (p = 0,0064). Todos los demás parámetros clínico mostraron ninguna asociación con la expresión de CXCL12 en las células tumorales (Tabla 1). Al dividir la cohorte en dos grupos, es decir, de tipo intestinal y carcinoma gástrico tipo difuso, no se encontró correlación entre la expresión de CXCL12 y cualquier parámetro clinicopathological de cualquiera de los grupos (datos no presentados). El CXCL12 expresión en las células tumorales no tuvo impacto en la supervivencia del paciente (grupo entero: p = 0,830; carcinoma de tipo intestinal: p = 0,766; difuso carcinoma de tipo: p = 0,817)
muestras de carcinoma gástrico revelando fuerte (a. ) y débil (b) inmunoreactividad CXCL12. Sólo unos pocos casos fueron negativos CXCL12 (c). Nota tinción CXCL12 positiva de los vasos sanguíneos (flecha). especímenes de carcinoma gástrico que muestran una clara inmunorreactividad citoplásmica CXCR4 y membranosas eran escasos (d). Algunas muestras revelaron un débil (e) la tinción de CXCR4 mientras que la mayoría de los tumores carecía de expresión CXCR4 (f). Los leucocitos sirvieron como control positivo interno (flechas). Barra de escala: a-f: 50 micras
Traducción de CXCR4 en el carcinoma gástrico, correlación con los parámetros clínico-patológicos y análisis de supervivencia
Traducción de CXCR4 también se estudió mediante inmunohistoquímica.. La inmunorreactividad en las células tumorales era evaluable en 293 muestras de tumores, de los cuales sólo 6 (2%) mostraron una tinción membranosa inequívoca (categoría 2 +; figura 2d). La mayoría de las muestras tumorales positivas CXCR4 sólo se reveló una inmunorreactividad citoplásmica débil CXCR4 (categoría 1 +, 44 casos, 15%; Figura 2E). Nuclear CXCR4 inmunorreactividad no se observó en cualquier caso y cualquier tipo de célula. Un total de 83% (243 de 293) de los carcinomas gástricos eran immunonegative para CXCR4, la mayoría de ellos mostrando leucocitos positivos CXCR4 concomitantes como un control positivo interno (figura 2f). Curiosamente, como ya se observó en carcinomas colorrectales, 86 de 293 carcinomas gástricos (29%) mostraron CXCR4 microvasos positivos en el estroma del tumor con una fuerte inmunorreactividad CXCR4 de las células endoteliales (Figura 3A). La naturaleza vascular de estas delicadas estructuras fue confirmado por una inmunotinción CD34 (figura 3b).
muestras de carcinoma gástrico que muestra una fuerte inmunorreactividad CXCR4 vascular o que carecen de expresión CXCR4 (a, c), indicado por las flechas. estructuras vasculares fueron confirmados por una inmunotinción CD34 (b, d). Barra de escala: a-d: 50 micras
Al correlacionar la expresión de CXCR4 en las células tumorales con diferentes parámetros clínico, la expresión de CXCR4 se asoció significativamente con un mayor grado tumoral local (T-estado; p = 0,030).. Sin embargo, no hay más asociaciones de expresión CXCR4 tumoral y otras variables clinicopatológicas se encontraron (tabla 2). Al analizar el subgrupo de carcinomas gástricos de tipo intestinal, no se encontró una asociación con cualquier parámetro clínico-patológica (datos no mostrados).
A continuación, se estudió la correlación entre la expresión de CXCR4 en las células endoteliales (CXCR4 expresión vascular, vCXCR4 ) de microvasos tumorales y diversos parámetros clínico. Curiosamente, la expresión de CXCR4 en microvasos correlaciona muy significativamente con el crecimiento local del tumor (T-categoría; p = 0,0001), así como con la etapa UICC-tumor (p = 0,0059). Incluso en los subgrupos de tipo intestinal y el tipo de carcinoma gástrico difuso, la expresión vCXCR4 se asoció significativamente con la extensión del tumor local (tipo intestinal: p = 0,004; difuso Tipo: p = 0,030) y la etapa de la UICC-tumoral (tipo intestinal: p = 0,020) . Además expresión vCXCR4 se asoció significativamente con la edad del paciente (p = 0,0148) en todo el grupo (tabla 3).
El análisis de supervivencia demostró que la expresión de CXCR4 en las células tumorales de carcinoma gástrico, así como en los microvasos tumorales no tuvo ningún impacto sobre la supervivencia
concomitante CXCL12 /vCXCR4 expresión en el carcinoma gástrico
Dado que el eje CXCL12-CXCR4 se ha demostrado que participan en la progresión tumoral [17] - [19]., nos investigado la correlación de la expresión concomitante de CXCL12 y vCXCR4 con parámetros clínico. De hecho, los tumores CXCL12-vCXCR4 positivos se asociaron con mayor extensión local del tumor (p = 0,0014) y UICC etapas superiores (p = 0,017). Sin embargo, no tuvo impacto en la supervivencia del paciente, incluso en los subgrupos de carcinoma gástrico de tipo intestinal y difuso.
Patrón de expresión de CXCL12 y CXCR4 en la adecuación de las metástasis de ganglios linfáticos
El eje CXCL12-CXCR4 se ha informado para participar en los procesos metastásicos en diversas entidades tumorales. Por lo tanto examinamos CXCL12 y CXCR4 inmunorreactividad en un subconjunto de 61 coinciden con metástasis en los ganglios linfáticos. El patrón de expresión CXCL12 estaba disponible para 46 metástasis. En general, 4 metástasis ganglionares fueron CXCL12 negativo al igual que su correspondiente tumor primario. 40 metástasis de ganglios linfáticos mostraron una positividad CXCL12 claro de acuerdo con el tumor primario. La intensidad de la tinción era muy heterogénea que muestra células tumorales fuertemente positivas adyacentes a débilmente manchada grupos de células del tumor. Sin embargo, dos metástasis reveló inmunorreactividad CXCL12 aunque no la expresión de CXCL12 se ha detectado en el tumor primario.
CXCR4 inmunorreactividad se evaluó en 54 metástasis en los ganglios linfáticos. Curiosamente, ninguno de ellos mostró ninguna expresión de CXCR4. Incluso aquellos tumores (n = 6), que muestra una positividad débil CXCR4 en el tumor primario, carecían de expresión de CXCR4 en las correspondientes metástasis de ganglios linfáticos. Sin embargo, todas las metástasis de ganglios linfáticos positivos revelaron claramente linfocitos CXCR4, que sirvieron como control positivo interno. Curiosamente, en tres casos intratumoral microvasos CXCR4 positivos fueron detectables.
Discusión
receptores acoplados a proteínas G representan la mayor familia de receptores transmembrana. El cinco por ciento de todo el código de los genes humanos durante más de 800 GPCRs diferentes y aproximadamente 80 diferentes ligandos fueron identificados hasta la fecha [20]. Los GPCR son las dianas farmacológicas más comunes en la medicina, es decir, casi el 30% de todos los medicamentos están dirigidos contra los GPCR. La evidencia es cada vez mayor que los GPCR también pueden ser objetivos prometedores para la terapia del cáncer. En este estudio tuvo como objetivo encontrar los GPCR que son expresados diferencialmente en los ganglios positivos de cáncer gástrico y por lo tanto pueden ser considerados como objetivos futuros para el tratamiento del cáncer gástrico. Encontramos 52 GPCRs y los genes relacionados con GPCR que son hacia arriba o hacia abajo-regulada en nodo de tejido de cáncer gástrico primario positivo en comparación con el cáncer de ganglios negativos. Varios de los GPCRs fueron anteriormente demostrado estar involucrados en la biología del tumor, tales como AT1R, EDG2, DARC, y FPR1 [10], [11], [14], [15]. Lo más interesante, la lista también incluye LGR5 [16], que recientemente ha demostrado ser un marcador de células madre en el intestino delgado y el colon. Además, la pérdida específica de APC en LGR5 positivos resultados en las neoplasias de células que crecen progresivamente. Por lo tanto,
in silico
validación de nuestros datos apoyan la hipótesis de que los GPCR están involucrados en la biología del tumor de cáncer gástrico.
Nuestros estudios de validación posteriores utilizando un grupo de pacientes independientes mostraron que el GPCR ligando CXCL12 se expresa en las células tumorales de la mayoría de los carcinomas gástricos. Por otra parte, la expresión de CXCL12 se asocia negativamente con metástasis a distancia y el grado del tumor. Por el contrario, sólo el 17% de los carcinomas gástricos mostró células tumorales immunopositive CXCR4, que se asoció con una mayor extensión local del tumor. Curiosamente, alrededor de un tercio de los carcinomas gástricos mostró CXCR4 microvasos tumorales positivas. la expresión de CXCR4 vascular se asoció significativamente con una mayor extensión del tumor local, así como mayores UICC-etapas. Cuando se expresa tanto, CXCL12 en las células tumorales y CXCR4 en microvasos tumorales, estos tumores también se asoció significativamente con una mayor T y la UICC-etapas, que apoya el papel del eje CXCL12-CXCR4 en la neoangiogénesis del cáncer gástrico
.
entre los GPCRs, el sistema de quimioquinas contribuye significativamente a la progresión del tumor a través de la modulación de la reacción inflamatoria local, proliferación de células tumorales, migración y supervivencia, así como la neoangiogénesis [4]. El receptor de quimiocinas CXCR4 inicialmente se encontró para regular el homing de los linfocitos en la inflamación y representa un co-receptor para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) [21]. Fisiológicamente, el eje CXCL12-CXCR4 está implicado en la migración de las células embrionarias del sistema nervioso central, médula ósea y corazón [22], [23]. Desempeña un papel crítico en los procesos metastásicos como se muestra para de mama [24], [25], de ovario [26] y el cáncer de próstata [27] y CXCL12 es altamente expresado en los órganos que son sitios frecuentes de metástasis distantes como pulmón, hígado y la linfa nodos [28]. En el carcinoma gástrico, los datos relativos a la vía de CXCL12-CXCR4 son escasos [29]. Hay algunas pruebas de que CXCR4 expresar carcinomas gástricos más probable desarrollar una propagación peritoneal del tumor y ascitis maligna contiene altas concentraciones de CXCL12 [30]
.
comparación de nuestros datos de la matriz de genes con los obtenidos por RT-PCR y inmunohistoquímica, fue interesante observar que la expresión diferencial de CXCL12 en el carcinoma gástrico positivo nodo se confirmó en la transcripción, pero no en el nivel de traducción. Aquí, la detección inmunohistoquímica de CXCL12 en las células tumorales correlacionada solamente con metástasis a distancia y el grado del tumor, pero no con la extensión nodal. Sin embargo, CXCL12 se encuentra no sólo en células tumorales, sino también en las células endoteliales y del estroma [31], y la expresión general en todo el compartimiento de tejido es más difícil de evaluar por inmunohistoquímica. Por el contrario, nuestros estudios transcripcionales utilizan homogeneizados de tejidos que se integran todos los CXCL12 células del tejido tumoral que expresa. Sin embargo, tiene que tener en cuenta que la transcripción de genes no siempre se correlaciona con la traducción del ARNm y que el efecto biológico del tumor de CXCL12 también puede depender de la presencia y distribución histoanatomical de CXCR4. En apoyo de esta afirmación, hemos sido capaces de demostrar que la expresión concomitante de CXCL12 en las células tumorales y CXCR4 en microvasos tumorales correlacionadas con el crecimiento local del tumor y el estadio de la UICC-tumoral.
Se informó que la positividad tumoral se correlaciona significativamente CXCR4 con el desarrollo de la carcinomatosis peritoneal [30]. Por otra parte, la fuerte expresión de CXCR4 se asoció significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos, la UICC etapas más altas y una tasa de supervivencia a 5 años reducida [32]. Nuestros resultados parecen diferir de estos estudios previos. Al evaluar la inmunorreactividad CXCR4 en las células tumorales, se observó una tasa de expresión bajo. Sólo el 17% de las muestras tumorales mostró una inmunorreactividad CXCR4 sobre todo débil. Además, todas las metástasis de ganglios linfáticos 61 coincidentes carecían de expresión de CXCR4. Este patrón de tinción puede explicar, por qué, por ejemplo, en carcinomas gástricos de tipo intestinal, la expresión de CXCR4 solamente se asoció significativamente con el crecimiento local del tumor (T-categoría), pero no con otros factores clinicopatológicos que se describió anteriormente. Se utilizó un anticuerpo CXCR4 a fondo caracterizado con una mayor especificidad que los anticuerpos disponibles en el mercado como se muestra por Fisher et al [33]. Esta diferencia en la especificidad podría servir para diferentes patrones de tinción. Por ejemplo, una expresión de CXCR4 nuclear, del que se informó que se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos en el cáncer colorrectal, no se observó en nuestra serie [34]. Además, nunca se detectó positividad CXCR4 en células estromales como se describe en un estudio de Saigusa y colegas [35]. Para aclarar, si la vía CXCR4-CXCL12 en última instancia contribuye a la generación de metástasis en el carcinoma gástrico, especialmente los ganglios metástasis en los ganglios, se necesitan más estudios.
Aproximadamente un tercio de los carcinomas gástricos examinados mostró CXCR4 tumour- positiva que rodea microvasos . Las células tumorales requieren un suministro adecuado de oxígeno y nutrientes para mantener la supervivencia. Incluso con anormalidades genéticas que dysregulate crecimiento y la supervivencia de las células individuales, los tumores no pueden ampliar más allá de 1-2 mm
3 sin vascularización y la muerte celular inducida por hipoxia se produce. Se ha demostrado que CXCR4 se expresa por células endoteliales y estimulación de CXCR4 por CXCL12 tiene un efecto proangiogénico [36]. Además, CXCR4 es un gen inducible por hipoxia, regulado por el factor de 1α inducida por hipoxia (HIF1α). Cuando el oxígeno es escaso como en tumores de rápido crecimiento, HIF1α aumenta la expresión de CXCR4 [37]. El aumento de la expresión de CXCR4 en las células endoteliales observada en nuestro colectiva tumor podría ser parte de una respuesta hipóxica integrada del tumor en crecimiento que permite la generación de nuevos vasos sanguíneos. En nuestro grupo de estudio, la expresión de CXCR4 vascular significativamente correlacionado con el nivel de crecimiento local del tumor. En el 8% de los tumores T1 /pT2a (4 de 52) y en el 34% de T2b /T3 /pT4 (81 de 239) CXCR4 microvasos positivos fueron detectables. T2b /T3 /T4 etapa carcinomas gástricos más probable albergan un microambiente hipóxico que los tumores /T2a etapa T1 y por lo tanto podría inducir la expresión de genes CXCR4 y la angiogénesis. La detección de CXCR4 microvasos positivos en grandes metástasis de ganglios linfáticos (& gt; 9 mm de diámetro) corroboró estas observaciones. Por otra parte, hemos demostrado resultados comparables en el carcinoma colorrectal [38]. Además, como se muestra en glioblastoma multiforme [39], las muestras de tumor que revelan ambos, células tumorales positivas CXCL12 y microvasos CXCR4 positivos se asociaron muy significativamente con un alto grado local del tumor y etapas altas UICC, apoyando además la importancia de un funcionales eje CXCL12-CXCR4 en la biología del cáncer gástrico
en resumen, se muestra que los GPCRs se expresan diferencialmente en el tejido de cáncer gástrico y pueden contribuir a la biología del tumor:. los tumores que expresan tanto, CXCL12 en las células tumorales y CXCR4 en el tumor que rodea microvasos, muestran una gran asociación significativa con el crecimiento local del tumor y la UICC etapas. Estos resultados, junto con nuestros datos previos sobre carcinoma colorrectal, corroboran el papel del eje CXCL12-CXCR4 en tumor-neoangiogénesis en tumores gastrointestinales. La vía de CXCL12-CXCR4 podría ser nueva diana antiangiogénico prometedor para el tratamiento de los carcinomas gástricos.
Materiales y Métodos
Las muestras de tumor
Las muestras de tejido de cáncer gástrico se obtuvieron quirúrgicamente en la Charité hospital de la Universidad de Berlín (1995-2008). tejido fresco congelado de 6 casos de carcinoma gástrico de tipo intestinal se utilizó para el análisis de GeneChip (ganglionar negativo: 3 pacientes; ganglionar positiva: 3 pacientes;-relación hombre-mujer: 01:02). Una serie independiente de los tejidos normales y cancerosas adyacentes tumorales pareadas de 37 de tipo intestinal carcinomas gástricos fueron examinados por tiempo real de RT-PCR (ganglionar negativo: 12 pacientes; ganglionar positiva: 25 pacientes;-macho-hembra relación: ~1:1 , para las características detalladas de los pacientes ver tabla S3). Para los análisis inmunohistoquímicos, se examinó una cohorte de pacientes de 347 pacientes consecutivos con cáncer gástrico, que comprende 194 y 122 de tipo intestinal carcinomas de tipo difuso de acuerdo con la clasificación de Lauren. 31 muestras mostraron otros subtipos histológicos (es decir, mucinoso, tubular, indiferenciada). En pocas palabras, la cohorte consistió en 220 hombres y 127 mujeres. La edad media de los pacientes en el momento del diagnóstico fue de 64 años. Los datos de supervivencia se disponía de 196 de estos pacientes. Los datos de seguimiento para los otros pacientes que faltaba ya que estos pacientes no eran residentes cerca del hospital y se perdieron durante el seguimiento. De 196 pacientes, 124 murieron durante el seguimiento. La mediana de seguimiento para aquellos pacientes que aún viven en el punto final del análisis fue de 33 meses. De 61 pacientes, el tejido de la búsqueda de metástasis ganglionares estaba disponible (27 de tipo intestinal, 26 de tipo difuso, otros 8 subtipos histológicos). Sólo los pacientes con diagnóstico histológico de cáncer gástrico y los tejidos adecuados disponibles fueron incluidos. Los pacientes con carcinoma gástrico tratados neoadyuvante o otros tumores malignos conocidos fueron excluidos del estudio. Este proyecto fue aprobado por el comité de ética local (ref. Número EA1 /06/2004).
GeneChip análisis
El ARN total se aisló con fenol-cloroformo utilizando el kit de aislamiento mirVana ™ miARN ( Ambion, Austin, EE.UU.). ADN contaminante se eliminó por tratamiento con DNasa (kit Turbo DNAfree; Ambion, Austin, EE.UU.) a 37 ° C durante 30 min. Se utilizó el GeneChip® Human Genome U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.), según el protocolo de los fabricantes para analizar los niveles de expresión de ARNm. Affymetrix GeneChip ® Software Operativo (GCOS 1.4) automatiza el control de las estaciones Técnica de fluidos GeneChip® y escáner GeneChip® 3000.
Bioinformática
Los datos en bruto se analizaron con el software operativo GeneChip Affymetrix (GCOS 1.4) . La detección valor de p de una transcripción determina la detección de llamada, que indica si la transcripción se detecta de forma fiable (p & lt; 0,05; presente) o no detectado (ausente). Para habilitar la comparación entre los datos de los chips fueron escalados a una intensidad global del 500. La Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) y GeneSpring paquete de software 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) fueron utilizados para los resultados promedio de diferentes muestras y realizar estadística análisis para comparar entre el cáncer gástrico con (N1) y sin metástasis en los ganglios (N0) ganglios. Los datos de seis arrays se normalizaron para tener en cuenta la variabilidad en la hibridación para pares de sondas y otros artefactos de hibridación. La normalización consiste en los siguientes tres pasos: en primer lugar, la transformación de datos (medidas establecidas de menos de 300,0 a 300,0); en segundo lugar, por chip (normalizar cada chip para el percentil 50 de las medidas tomadas de ese chip); y tercero, por gen (normalizar cada gen a la mediana de las mediciones para ese gen). El cambio veces se calculó para cada gen como la media aritmética de los valores de expresión normalizados de N1 dividido por la media aritmética de los valores de expresión normalizados de N0. Los datos en bruto a partir de experimentos de microarrays se han subido a la Expresión Génica Omnibus base de datos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).
Real-time reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
Para la síntesis de ADNc, 2 g de ARN total fue transcrito invertir usando el kit Omniscript RT (Qiagen). Los cebadores específicos de genes fueron diseñados por el BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlín, Alemania). Primer secuencias fueron los siguientes: CXCR4 5 'CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG;