Extracto
Onco-miR-182-5p ha sido informado de que sobre-expresan en el cáncer de vejiga (BC) tejidos sin embargo un análisis funcional detallado de miR-182-5p no se ha llevado a cabo en BC. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue: 1. Llevar a cabo un análisis funcional de miR-182-5p en el cáncer de vejiga, 2. evaluar su utilidad como marcador tumoral, 3. Identificar los genes diana de miR-182-5p en BC. Inicialmente, se encontró que la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en el cáncer de vejiga en comparación con los tejidos normales y alta expresión de miR-182-5p se asoció con menor supervivencia global en pacientes con CM. Para estudiar el significado funcional de miR-182-5p, nos expresamos sobre-MIR-MIR-182-5p con 182-5p precursor y observamos que las capacidades de proliferación celular, la migración y la invasión se incrementaron en las células BC. Sin embargo apoptosis de las células fue inhibida por el miR-182-5p. También se identificaron
Smad4
y
RECK
como posibles genes diana de miR-182-5p utilizando varios algoritmos. la actividad luciferasa 3'UTR de estos genes diana se redujo significativamente y expresión de proteínas de estos genes diana fue significativamente hasta reguladas en las células del cáncer de vejiga transfectadas inhibidor de miR-182-5p. MIR-182-5p también aumentó la expresión de beta-catenina nuclear y Smad4 mientras reprime la expresión de beta-catenina nuclear. En conclusión, nuestros datos sugieren que el miR-182-5p juega un papel importante como un oncogén derribando RECK y Smad4, lo que resulta en la activación de la vía de señalización de Wnt-beta-catenina en cáncer de vejiga
Cita.: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et al. (2012) Objetivos Oncogénicos miARN-182-5p Smad4 y RECK en cáncer de vejiga humana. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10.1371 /journal.pone.0051056
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Septiembre, 2012; Aceptado: 29 de octubre de 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
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Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación de los Estados Institutos Nacionales de Salud Unidas a través de la Subvención Número RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA subsidios para la revisión de mérito, y Proyecto de Programa VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga (BC) es la tercera causa principal de muerte entre los tumores urológicos y el tipo histológico más común de cáncer de vejiga es el carcinoma urotelial (CU), anteriormente conocido como carcinoma de células transicionales (TCC) [1]. Aproximadamente el 75% de los pacientes son "no músculo invasivo de la UC (PTA, pTis, pT1) y tienen una tasa de supervivencia a 5 años de entre el 88-98% [2]. El tratamiento común para estos pacientes es la resección endoscópica [1], [3]. Los pacientes con UC músculo invasivo generalmente se tratan con cistectomía radical o la radioterapia quimioterapia [1], [4]. Sin embargo la mitad de los pacientes con CU musculares invasivos desarrollar la enfermedad metastásica subsiguiente después del primer tratamiento agresivo [1], [5]. Estudios previos han identificado varios biomarcadores moleculares potenciales para el cáncer de vejiga [6], [7]. La inactivación de los genes supresores de tumores
TP53
y
Rb
y
Ras
activación de oncogenes han sido considerados como importantes actores clave en la carcinogénesis del cáncer de vejiga [6].
activación de la señalización de Wnt-beta-catenina también se ha estudiado e informó de que se asocia con la progresión del cáncer y de mal pronóstico en el cáncer de vejiga [8], [9]. Factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) desempeña un papel crucial en el desarrollo embrionario y la patogénesis de varias enfermedades y el cáncer [10]. Evidencia de la diafonía entre TGF-beta y otras vías de señalización, incluyendo la señalización de Wnt se ha informado [10]. Smad4 es un componente de transducción de señales intracelulares central del TGF-beta y estudios recientes han demostrado que Smad4 coopera con la beta-catenina en varios Caners [11] - [14]
RECK es represor crucial de las metaloproteinasas de matriz (MMP. ) y estudios previos han demostrado que la expresión RECK es significativamente menor en los tejidos de cáncer de vejiga en comparación a los tejidos uroteliales normales [15] - [17]
hasta el momento se han identificado y notificado a ser importante en varios tipos de cáncer muchos microARN. [18]. MicroARNs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes, aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, que son capaces de regular la expresión génica, tanto en la transcripción y traducción niveles [19]. MiRNAs se unen a la 3'UTR del ARNm diana y reprimir la traducción del ARNm a la proteína o inducir la escisión del ARNm y por lo tanto regular la expresión de genes diana [20].
En este estudio, encontramos que el miR-182- 5p fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer de vejiga en comparación a los tejidos uroteliales normales y la expresión de miR-182-5p alta se asoció significativamente con la supervivencia general más corta. Hasta el momento no ha habido ningún informe sobre la función de miR-182-5p en el cáncer de vejiga. Por lo tanto, nos centramos en el miR-182-5p, se realizaron análisis funcionales, identificado varios genes diana de miR-182-5p utilizando varios algoritmos e identificó
Smad4
y
RECK
como genes diana. Por último, se sobre-expresado estos genes diana (
Smad4
y
RECK
) en células de cáncer de la vejiga para examinar el mecanismo de la función de miR-182-5p.
Resultados
expresión miARN-182-5p es significativamente mayor en cáncer de vejiga y tejidos asociados con la supervivencia global más corto
Se compararon los genes miARN-182-5p niveles de expresión en tejidos de cáncer de vejiga (n = 18) y normal tejidos uroteliales (n = 6) por PCR en tiempo real. La expresión miR-182-5p fue significativamente mayor en tejidos de cáncer de vejiga (Fig 1A). Hemos investigado la asociación de miR-182-5p y varios parámetros clínicos como se muestra en la figura 1-B y observó que la expresión de miR-182-5p alta se asoció significativamente con la supervivencia general más corta.
A. la expresión de miR-182-5p en muestras clínicas y líneas celulares de cáncer de vejiga, B. Asociación de miR-182-5p con los parámetros clínico-patológica, parcelas C. Kaplan Meier de la supervivencia global.
Con respecto a varios otros parámetros clínicos, se observó una relación significativa. Dividimos a los pacientes con cáncer de vejiga 18 en dos categorías en función del valor de la mediana y gráficos de Kaplan-Meier mostró que la supervivencia global fue más corto en la parte alta de miR-182-5p expresar grupo (valor p = 0,0349, prueba de log-rank) (Figura 1- C).
miARN-182-5p expresión es significativamente mayor en líneas celulares de cáncer de vejiga
se comparó la expresión de miR-182-5p en varias líneas celulares de cáncer de vejiga y su expresión en T24 y UM -uc-3 células estaba en el intervalo de que, en tejidos de cáncer de vejiga. Por lo tanto utilizamos estas dos líneas celulares de cáncer de vejiga para más experimentos en este estudio (Figura 1).
Efecto de microARN-182-5p El exceso de expresión en la viabilidad celular y migración en líneas celulares de cáncer de vejiga
Para confirmar la función de miR-182-5p, transfectadas precursor de miR-182-5p en líneas celulares de cáncer de vejiga (T24 y UM-UC-3). A las 24 horas después de la transfección de miR-NC o precursor de miR-182-5p en células de cáncer de vejiga, el nivel de expresión de miR-182-5p se verificó mediante PCR en tiempo real (doble cambio, 4545, 5920, respectivamente, la figura 2-A). . A continuación, se realizaron varios análisis funcionales. Se observó el aumento significativamente la proliferación celular (Fig. 2-B), la invasión (Fig. 2-C) y la migración (Fig. 2-D) en las células transfectadas miARN-182-5p comparación con las células transfectadas miR-NC. Además, el miR-182-5p disminuyó significativamente la apoptosis celular (Fig. 2-E).
Dos líneas celulares de cáncer de vejiga (T24 y UM-UC-3) fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de miR-182-5p precursor o de control (miR-NC). A. expresión de miR-182-5p relativa, B. ensayo de viabilidad celular, ensayo de invasión C., D. Heridas ensayo de curación (24 horas), el análisis de citometría de flujo E. de la apoptosis en el miR-NC o transfectadas miR-182-5p BC las células.
3'-UTR de luciferasa-Ensayo y Target expresión de la proteína en el miR-182-5p transfectantes
RECK ARNm tiene una mientras Smad4 tiene dos potencial sitio de unión de cortesía con miR 182-5p dentro de su 3 'UTR (Fig. 3-A). Sobre la base de estos resultados, se realizaron ensayos de luciferasa 3'UTR y encontramos que las actividades relativas de luciferasa con estos sitios se redujo significativamente en el miR-182-5p transfectadas las células de cáncer de vejiga (T24, UM-UC-3) (Fig. 3-B ). Estos resultados sugieren que RECK y Smad4 ARNm son posibles genes diana de miR-182-5p. El análisis de Western confirmó que RECK y Smad4 expresión de la proteína fue significativamente mayor en el miR-182-5p inhibidor de las células transfectadas (Fig. 3-C).
A. RECK y Smad4 3'UTR posición y secuencias de miR-182-5p complementarias. ensayo de luciferasa B. 3'UTR (miR-NC y precursor de miR-182-5p), C. RECK, Smad4 y la expresión de la proteína beta-tubulina de inhibidor de miR-NC o inhibidores de las células del cáncer de vejiga 182-5p miR-transfectadas (T24, UM-UC-3).
Efectos de la sobreexpresión de la RECK y Smad4 en la célula del cáncer de vejiga (T24) función
Para observar la función de RECK y Smad4, nos sobreexpresa RECK y Smad4 en células T24 que fue confirmado mediante la medición de mRNA (Fig. 4-a) y los niveles de expresión de proteínas (Fig. 4-b). A continuación, se realizó varios análisis funcionales. Como se muestra en la Figura 4, la viabilidad celular (Fig. 4-C), la invasión (Fig. 4-D) y la migración (Fig. 4-E) se inhibió significativamente en RECK y Smad4 transfectaron células de cáncer de vejiga T24. Como se muestra en la Figura 4-F, el porcentaje de células apoptóticas fue significativamente mayor en las células RECK o Smad4 transfectadas.
A. A las 24 horas después de la transfección de cualquiera pCMV6 vacío, pCMV6-RECK o pCMV6-Smad4 en las células de cáncer de vejiga (T24), RECK y Smad4 niveles de expresión fueron verificados por el tiempo real de RT-PCR (doble cambio, 24744, 8563, respectivamente) y el análisis Western (B) de ensayo C. La viabilidad celular, ensayo de invasión D., E. herida ensayo de curación, F. Flujo análisis de citometría de apoptosis en vacío, RECK y Smad4 transfectaron células T24. Los datos son la media ± S. D. de cuatro experimentos independientes. G. expresión de beta-catenina en la fracción nuclear, CREB se utilizó como control.
Efecto de miR-182-5p y Smad4 de expresión de beta-catenina en la fracción nuclear
se muestra en la Figura 4-G, la expresión de beta-catenina en la fracción nuclear fue significativamente mayor en las células T24 transfectadas miR-182-5p. En cambio, la expresión de beta-catenina en la fracción nuclear se redujo significativamente en Smad4 transfectaron células T24.
Discusión
Una serie de microRNAs se han identificado como supresor de tumores o de oncogenes en función de su nivel de expresión en tejidos de cáncer de vejiga y /o el análisis funcional. Sin embargo, muchos estudios se han centrado en los genes miARN miRNAs supresores de tumores, incluyendo el miR-125 ter, -133a, -143, -145, -200 familia (200a, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, - 449a, -493 y -517a [21] - [29]. Se han identificado y confirmado como oncogenes en el cáncer de vejiga dos miRNAs (miR-21 y miR-129) [30], [31].
miR-182-5p También se ha informado de que un oncogén en varios tipos de cáncer [32] - [37]. Similar a nuestros resultados, un informe encontró que la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer de vejiga en comparación al epitelio urinario normal, sin embargo, no se realizó el análisis funcional en este estudio [38]. De este modo se determinó la relación entre la expresión de miR-182-5p y los parámetros clínicos incluyendo estadios patológicos y resultados de los pacientes y encontró que la expresión de miR-182-5p se correlacionó con la supervivencia general más corta después de la operación en pacientes con cáncer de vejiga. Estos resultados sugieren que el miR-182-5p puede ser un biomarcador de diagnóstico nuevo y útil en el cáncer de vejiga.
Nuestro siguiente objetivo fue determinar si las funciones de miR-182-5p como un oncogén del cáncer de vejiga. De tres vejiga líneas celulares de cáncer (T24, UM-UC-3, J82), la expresión de miR-182-5p en dos líneas celulares (T24 y UM-UC-3) estuvo en el rango de expresión observada en tejidos de cáncer de vejiga . Por lo tanto utilizamos estas dos líneas celulares de cáncer de vejiga (T24 y UM-UC-3) para los experimentos de análisis funcional. Se encontró que la sobreexpresión de miR-viabilidad 182-5p promovido significativamente celular de cáncer de la vejiga, la migración y la invasión y inhibe la apoptosis. Utilizamos varios algoritmos para buscar posibles genes diana de miR-182-5p desde microRNAs ejercen sus efectos mediante la regulación de la expresión del gen diana. Se identificaron RECK y Smad4 como posibles genes diana por ensayo de luciferasa 3'UTR y análisis Western.
MMP juega un papel importante en la invasión del cáncer y la metástasis y MMP-2 de elevación en tejidos de cáncer de vejiga se ha informado que se correlaciona con el estadio tumoral y mal pronóstico en pacientes con cáncer de vejiga [39], [40]. RECK es un importante MMP-2 represor y se había informado anteriormente expresión RECK ser regulada en tejidos de cáncer de vejiga en comparación con urotelio normal [16], [17]. Además, la metilación del ADN se ha identificado como un mecanismo de silenciamiento RECK [41]. Recientemente se identificó el miR-21 como regulador de
RECK
la expresión génica en varios tipos de cáncer [42], pero hasta la fecha no ha habido ningún informe que muestra la regulación directa de RECK por miR-182-5p.
también se investigó la función de RECK en más de expresarla en una línea celular de cáncer de vejiga (T24). Como se muestra, RECK inhibe la proliferación celular, habilidades migración y la invasión en las células de cáncer de vejiga y el número de células apoptóticas se incrementó en RECK transfección.
Smad4 es un importante componente de la transducción de señales de TGF-beta y estudios recientes muestran que funciones Smad4 por cooperar con la beta-catenina en varios tipos de cáncer.
de señalización
Wnt-beta catenina es crucial para la embriogénesis y la génesis tumoral [43]. En las células cancerosas, la vía Wnt generalmente se activa haciendo que no fosforilado beta-catenina a acumularse en el citoplasma y se mueve al núcleo, donde se une a TCF /LEF y transcriptionally regula genes diana de Wnt que promueven la tumorigénesis [43]. En el cáncer de vejiga, desregulado señalización Wnt-beta-catenina desempeña un papel importante en la progresión y la metástasis. Por lo tanto miramos para ver si la expresión de beta-catenina se vio alterada por cualquiera de los genes miARN-182 o Smad4 transfección. Como hemos observado, el miR-182-5p aumento de la expresión de beta-catenina nuclear, mientras que Smad4 disminución de la expresión de beta-catenina nuclear. Por lo que sabemos, no ha habido informes sobre el miR-182 y la señalización de Wnt-beta-catenina y nuestros resultados sugieren que onco-miR-182-5p puede estar implicada en la regulación de los genes-beta-catenina vía relacionados.
En nuestro estudio, la sobreexpresión Smad4 disminución de la proliferación de células de cáncer de vejiga, la migración y la capacidad de invasión. La apoptosis también se incrementó con Smad4 sobreexpresión en células de cáncer de vejiga. Dado que la pérdida de Smad4 se ha informado a desempeñar un papel causal en la iniciación de carcinomas de células escamosas de la piel, el tracto digestivo superior así como adenocarcinoma del tracto gastrointestinal [44], nuestros resultados pueden indicar que Smad4 juega un papel importante en el cáncer de vejiga. Como nos concentramos solamente en Smad4 en la cascada de señalización Wnt, es posible que otros genes pueden estar regulados directa o indirectamente por miR-182-5p. serán necesarios experimentos adicionales para dilucidar el papel exacto de miR-182-5p en la señalización de Wnt-beta catenina. En su conjunto, este estudio muestra que el miR-182-5p ejerce sus efectos oncogénicos en las células del cáncer de vejiga por abajo de la regulación RECK y Smad4.
Este es el primer informe que también el documento que la expresión de miR-182-5p es aumentado significativamente en los tejidos de cáncer de vejiga, donde funciona como un oncogén mediante la inhibición de RECK y Smad4 expresión y puede ser potencialmente útil como un biomarcador de pronóstico. Estos resultados también sugieren que el miR-182-5p puede tener un potencial terapéutico para el tratamiento de cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Fijado en formol, parafina incrustados muestras de cáncer (FFPE) de la vejiga se obtuvieron de los San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01).
Muestras Clínicas
Un total de 18 hombres pacientes con cáncer de vejiga confirmado patológicamente se inscribieron en este estudio (Veterans Affairs Medical Center en San Francisco)
Cell Cultura y
Tres líneas celulares de cáncer de vejiga (J82; ATCC número:. HTB-1, T24; número de ATCC: HTB-4, UM-UC-3; número de ATCC: CRL-1749) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Las líneas J82 y células UM-UC-3 se cultivaron en MEM de Eagle con BSS de Earle suplementado con suero bovino fetal 10%. La línea celular T24 fue cultivada en medio 5A de McCoy con suero bovino fetal al 10%.
Extracción de ARN y proteínas
ARN (ARN microARN y total) fue extraído de fijado en formol, embebido en parafina (FFPE) del cáncer de vejiga humano y los tejidos normales no cancerosas de la vejiga (células uroteliales) utilizando un kit miRNeasy FFPE (Qiagen) después de láser microdisección basado en opiniones patólogos. El ARN total se extrajo también de líneas celulares de cáncer de vejiga usando un kit miRNeasy mini (QIAGEN). Las células se lisaron con tampón RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL) que contiene inhibidores de la proteasa (Sigma, St. Louis, MO). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). La nuclear y citoplasmática reactivo de extracción NE-PER se utilizó para extraer fracciones de proteínas nucleares y citoplasmáticas de las células de cáncer de vejiga (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).
MicroARN transfección (pre-MIR Precursor y miR Inhibidor)
Pre-MIR ™ miARN precursores [control negativo (miR-NC) o HSA-mir-182-5p, Ambion] fueron transfectadas transitoriamente en las células de cáncer de vejiga mediante Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
anti-MIR ™ miARN inhibidor [control negativo (inh-NC) o un inhibidor de miR-182-5p (miR-182 inhibidor), Ambion] fueron transfectadas transitoriamente en células de cáncer de vejiga por SIPORT NeoFX agente de transfección (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la transfección, las células se incubaron a 37 ° C durante 48 horas, hasta la evaluación.
viabilidad celular, la invasión de células, se midió Curación de Heridas Ensayo
La viabilidad celular 3 días después de la transfección con MTS (CellTiter 96 Una solución acuosa Ensayo de proliferación celular, Promega). Los datos son la media ± S. D. de 6 experimentos independientes. ensayos de la invasión de células se realizaron con el 24 pocillos kit de ensayo de invasión de células CytoSelect (Cell BioLab, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se resuspendieron en medio de cultivo sin FBS y se colocaron en la cámara superior por triplicado. Después de 48 horas de incubación a 37
o C (5% de CO2), se tiñeron células que migran a través de la membrana. Los resultados se expresaron como células invadidas cuantificados a 560 nm OD. El proceso de curación de la herida comienza con la remodelación de la matriz del tejido, la migración, y la eventual cierre de la zona de la herida. Por lo tanto este ensayo se utiliza con frecuencia para la evaluación de la migración de células de cáncer. ensayo de cicatrización de la herida se realizó con el CytoSelect 24 pocillos cicatrización de la herida kit de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para generar un campo de la herida, las células transfectadas se cultivaron hasta que formaron una monocapa alrededor del inserto. Después de retirar la pieza de inserción, un campo herida abierta 0,9 mm se generó y se dejó que las células a migrar desde ambos lados de la brecha. Cierre de la herida se controló y se midió el cierre por ciento. [Tasa de cierre Porcentaje (%) = área de superficie de la célula migrado /total de x100 área de superficie)].
Los análisis de apoptosis
Las células (48 horas después de la transfección) se lavaron dos veces con 1 x PBS y se tripsinizaron. Después de la inactivación de la tripsina en medio completo, las células se resuspendieron en helado de 1x tampón (70 l) de unión. solución de Anexina V-FITC (10 l) y 7-AAD colorante viabilidad (20 l) se añadieron a 70 l de las suspensiones de células. Después de la incubación durante 15 minutos en la oscuridad, 400 l de tampón de unión 1x enfriado con hielo, se añadió. La distribución de apoptosis de las células en cada muestra se determinó usando un FACS (Cell Lab QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Los datos son la media ± S. D. de cuatro experimentos independientes.
Construcción de plásmidos y 3'UTR-ensayo de luciferasa
Hemos construido plásmidos individuales para cada sitio de unión en el 3'UTR de ARNm de genes diana potenciales basado en microRNA.org información. Luego confirmamos miR-182-5p unión a los genes diana de ARNm 3'UTR de ensayo de luciferasa con precursor de miR-182-5p. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión se utilizó para realizar análisis de luciferasa 3'UTR (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores usados para las inserciones de plásmido se muestran en la Tabla 1. En un volumen total de 20 l, 5 l de cada uno de cebador directo 100 M y cebador inverso, 2 l de 10x tampón de hibridación (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM de EDTA) y agua 8 l se añadieron a un tubo de PCR 200 l y se incubaron a 95 ° C durante 5 minutos y luego colocados a temperatura ambiente durante 1 hr. Los oligonucleótidos se ligaron en el
I- Pme
Xba I
sitio de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión. Directa de la colonia PCR se realizó para el reconocimiento de inserción utilizando RedTaq (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: cebador directo, 5'-cgtgctggaacacggtaaaa-3 '; cebador inverso, 5 'gcagccaactcagcttcctt-3'. parámetros de PCR para los ciclos eran las siguientes: 94 ° C durante 3 minutos, 30 ciclos de PCR a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 10 minutos y 4 ° C durante 10 minutos. El producto de PCR fue digerido con NotI (Takara /Fisher Scientific,
Pittsburgh
,
PA, EE.UU.
). Los tamaños de vectores que contienen insertos fueron aproximadamente 200 pb y 100 pb por electroforesis desde la secuencia de reconocimiento de NotI fue incorporado en los cebadores. Para la transfección precursor de miR-182-5p, las células del cáncer de vejiga fueron co-transfectadas con el miR-NC y pmirGLO o miR-182-5p y pmirGLO Dual-Luciferase miARN objetivo Vectores de expresión utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La actividad de luciferasa se evaluó mediante el sistema de doble Luciferase® reportero de ensayo (Promega) (48 horas después de su transfección).
La sobreexpresión de los genes diana plásmido (RECK, Smad4) y análisis funcionales
con el fin de construir gen diana (RECK, Smad4) que expresan más de plásmidos, los genes fueron amplificados con el ARN total de tejidos humanos adultos normales del riñón (catálogo #: R1234142-50, Instituto Biochain, Newark, CA) y RWPE-1 por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Las secuencias de los cebadores para la clonación se muestran en la Tabla 1. Polimerasa productos de la reacción en cadena fueron clonados en la expresión de mamíferos pTARGET-Vector System (Promega, Madison, WI). Entonces pCMV6-RECK o pCMV6-Smad4 se obtuvo subclonando un fragmento NheI-XhoI de pTARGET-RECK /Smad4 en el sitio NheI-XhoI de pCMV6-Entrada del vector.
Inicialmente se transfectaron pCMV6-vacía y pCMV6- RECK o -Smad4 en células de cáncer de vejiga y el ARN y las proteínas se extrajeron. La sobreexpresión de RECK o Smad4 fue confirmada por tiempo real de RT-PCR y Western Blot se realizaron análisis y análisis funcionales.
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR fue realizado por triplicado con un Applied Biosystems Prism 7500 secuencia rápida sistema de detección usando TaqMan PCR Universal mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.). Las sondas TaqMan y los cebadores se compraron de Applied Biosystems. GAPDH humano y RNU48 se utilizaron como control endógeno. Los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando el Sistema Rápido 7500 SDS software de la versión 1.3.1 (Applied Biosystems).
Análisis Western
Se utilizó la proteína celular total (15-20 mg) para el Western Blot . Las muestras fueron resueltas en 4-20% geles de proteínas precisas (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Las membranas se sumergieron en 0,3% de leche desnatada en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 durante 1 hora y se sondaron durante la noche a 4 4 ° C con anticuerpo policlonal primario y anticuerpo monoclonal contra Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), beta-catenina (#9562), CREB (# 9197) y beta-tubulina (# 2128) de Señalización celular Tecnología, Beverly, MA. Las transferencias se lavaron en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 y se marcaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con secundario anti-ratón o anticuerpo anti-conejo (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Las proteínas fueron reforzadas por quimioluminiscencia (Amersham ECL plus Western Blot sistema de detección, Fairfield, CT) para la visualización. Los niveles de expresión de proteínas se expresan en relación con los niveles de beta-tubulina o CREB
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Statview. (Versión 5; SAS Institute Inc., Carolina del Norte). Un
p-valor de
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Roger Erickson por su apoyo y asistencia en la preparación del manuscrito. .