Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más prevalentes a nivel mundial y es uno de los principales causas de muerte por cáncer debido a la resistencia a la terapia y la metástasis. La comprensión del mecanismo subyacente a la carcinogénesis colorrectal es esencial para el diagnóstico y tratamiento de CRC. microARN (miARN) puede actuar ya sea como oncogenes o supresores tumorales en muchos tipos de cáncer. Una función supresora de tumores de miR-27b Recientemente se ha informado en el neuroblastoma, mientras que no hay información sobre el miR-27b en el CCR está disponible. En este estudio, hemos demostrado que la expresión de miR-27b se reduce en la mayoría de los tejidos de CRC y determinamos que la sobreexpresión de miR-27b reprime la proliferación celular CRC, la formación de colonias y el crecimiento tumoral
in vitro
y
in vivo
. Se identificaron el factor de crecimiento endotelial vascular C (VEGFC) como un nuevo gen objetivo de miR-27b y determinamos que miR-27b funciona como un inhibidor de la progresión tumoral y la angiogénesis a través de la orientación VEGFC en CRC. Se determinó además que la hipermetilación del ADN de las islas miR-27b CpG disminuye la expresión de miR-27b. En resumen, un papel antitumoral de miR-27b y su novela VEGFC
diana in vivo
podrían conducir a la necrosis del tumor y proporcionar un fundamento para el desarrollo de miR-27b como agente terapéutico.
cita: Vosotros J, Wu X, Wu D, Wu P, Ni C, Zhang Z, et al. (2013) Objetivos miARN-27b de crecimiento endotelial vascular Factor C de inhibir la progresión del tumor y la angiogénesis en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (4): e60687. doi: 10.1371 /journal.pone.0060687
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Noviembre 2012; Aceptado: March 1, 2013; Publicado: 12 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 de Ye et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 91019005), la Fundación Provincial de Zhejiang de Ciencias Naturales de China (Nº Y2110034), el Proyecto Talento 151 de la provincia de Zhejiang (HJ) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la provincia de Zhejiang (No. 2011C37004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más frecuente en todo el mundo. A pesar de la aplicación clínica de numerosas estrategias terapéuticas, sigue siendo una de las principales causas de muerte por cáncer debido a la resistencia a la terapia y la metástasis [1] - [3]. Por lo tanto, la comprensión del mecanismo de la carcinogénesis colorrectal subyacente es esencial para el diagnóstico y tratamiento de la CRC. Las interacciones entre los tumores y el estroma se reconocen como componentes críticos de la progresión del tumor en [4] CRC. Más recientemente, la evidencia que indica que las quimiocinas producidas dentro del microambiente del tumor tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) juegan un papel crucial en la patogénesis de la CRC está aumentando [5], [6].
microRNAs (miRNAs) son una clase de pequeña, endógeno, que no codifica ARN, que juegan un papel importante en la regulación de genes diana por el emparejamiento complementario en el ARNm 3 'no traducida región (3'UTR) que conduce a la represión de la traducción o degradación de ARNm [7]. miRNAs son conocidos por funcionar en diversos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo, la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la iniciación del cáncer o progresión [8], [9]. En el cáncer, los miRNAs pueden actuar ya sea como un oncogén o un supresor de tumores, como se evidencia por el miR-130b promoción de las células madre del cáncer de hígado crecimiento (CSC) y la auto-renovación a través de la orientación TP53INP1 [10], el miR-34a inhibir la metástasis del cáncer de próstata en directo reprimir CD44 [11], y miR-7 inhibir el crecimiento tumoral y la metástasis al afectar la la phosphoinositoide-3 quinasa (PI3K) /Akt en el carcinoma hepatocelular [12]. Estos resultados sugieren que es de importancia fundamental para aclarar las funciones de los genes miARN y circuitos de regulación para formular estrategias terapéuticas.
Nuestra hipótesis es que las diferencias moleculares entre las células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas pueden identificar una molécula clave en el crecimiento tumoral y la progresión, y en este estudio, se investigaron las diferencias en la expresión de los genes miARN entre células madre cancerosas y las células diferenciadas CRC utilizando microarrays miARN. Hemos encontrado que la expresión de miR-27b se reduce sustancialmente en las células CSC-como en los tejidos y CRC. miR-27b se encuentra en el cromosoma 9 y se ha demostrado para funcionar como un supresor de tumores en el neuroblastoma a través de la orientación de los γ peroxisoma proliferador activado del receptor (PPAR) [13]. También se ha informado de que miR-27b puede actuar como un cambio angiogénico mediante la promoción de destino de las células endoteliales y la brotación punta [14], [15]. Sin embargo, las funciones específicas y los posibles objetivos de miR-27b en células CRC están sin explorar. Se confirmó que vascular factor de crecimiento endotelial C (VEGFC), que desempeña un papel en la progresión tumoral, es una nueva diana de miR-27b. Un gran número de estudios clínicos han demostrado que el aumento de expresión de VEGFC en tumores primarios se correlacionaron con una mayor difusión de las células tumorales a los ganglios linfáticos regionales en una variedad de carcinomas humanos [16] - [18]. Recientemente, el papel regulador de VEGFC en la iniciación y la potenciación de neo-angiogénesis se había descubierto [19]. Descubrimos que el miR-27b podría bloquear la proliferación celular CRC, la formación de colonias y el crecimiento del tumor y que funciona como un inhibidor de la angiogénesis por la orientación VEGFC y abajo de la regulación hipermetilación del ADN. La comprensión de los mecanismos por los que el miR-27b inhibe el crecimiento del tumor y la angiogénesis establece una sólida justificación para su desarrollo como agente antitumoral terapéutica.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Esta investigación fue aprobado por las juntas de revisión institucional de Segundo hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang. Todos los participantes dieron su consentimiento de su información que se almacena en la base de datos del hospital y se utiliza para la investigación escrita
.
Todas las obras animal había sido llevado a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes. Esta investigación fue aprobado por las juntas de revisión institucional de Segundo Hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang.
Líneas Celulares
El cáncer colorrectal líneas celulares humanas, SW620, SW480, RKO, HT29 y 293T fueron adquiridos de banco de células en la Academia china de Ciencias Médicas (República Popular china). células SW620 y SW480 se cultivaron en medio Leibovitz L15 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco). RKO, HT29 y las células 293T se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% FBS. Se mantuvieron todas las células a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera.
Análisis de microarrays de expresión de miRNA
El ARN total se aisló de CD133
+ y CD133
- CRC células usando el reactivo TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad y la calidad del ARN se evaluó utilizando un NanoDrop (Thermo Scientific, Worcester, MA, EE.UU.). El perfil de expresión de miRNA de cada muestra se evaluó a través de una matriz de Affymetrix miARN (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.).
Análisis Cuantitativo PCR
El ARN total de líneas celulares, tejidos frescos o CRC tejidos de xenoinjerto se aisló usando el reactivo TRIzol® (Invitrogen). El ARN total de tejidos embebidos en parafina se aisló por RecoverAll ™ total de ácidos nucleicos kit de aislamiento (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y se trató con RNasa libre de DNasa I (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante . La cantidad y la calidad del ARN se evaluaron mediante un espectrofotómetro Nanodrop. TaqMan miARN expresión ensayos (Applied Biosystems) se utilizaron para cuantificar la expresión de los genes miARN utilizando el sistema de StepOnePlus ™ (Applied Biosystems). Todas las muestras se realizaron por triplicado, y los niveles de miR-27b en cada muestra se normalizaron a la de U6.
Ensayo de proliferación de
Las células se sembraron a una densidad de 3 x 10
3 células por pocillo en una placa de 96 pocillos que contenía medio Leibovitz L15 0,2 ml con 10% de FBS. MTS (3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] 5- [3-carboximetoxifenil] 2- [4-sulfofenilo] sal 2H-tetrazolio) reactivo (Promega, Madison, WI, EE.UU.) (20 l ) se añadió a cada pocillo y se incubaron las células a 37 ° C durante 4 h. Los valores de absorbancia se midió a 490 nm en un lector de microplacas (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y se evalúan de forma continua durante 7 días.
Soft-agar Colonia Ensayo
Las células fueron sembradas a una densidad de 300 por pocillo en la capa superior de 0,3% de agarosa de bajo punto de fusión (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) en placas de 12 pocillos con una capa inferior de agarosa al 0,5% en Leibovitz L15 medio que contiene 10% de SFB. Después de la incubación a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO
2 ambiente durante 2 semanas, las colonias que contienen 20 células se visualizaron en un microscopio invertido y se contaron.
Tumorigénesis Ensayo
Las células se suspendieron en medio Leibovitz L15 100-l fueron implantados en la parte trasera de 4 semanas de edad ratones desnudos hembra para evaluar su capacidad para iniciar xenoinjertos tumorales. Los tumores se midieron semanalmente y se calculó su volumen como la longitud x anchura x ancho /2.
Terapia de miR-27b
células SW620 (5 × 10
6) se inyectaron en la parte trasera de 4 semanas de edad, hembra NOD /ratones SCID, todos los cuales desarrollaron tumores en 1 semana con un volumen de ~ 200 mm
3. Cinco ratones fueron asignados aleatoriamente a cada uno de el control negativo (NC) y los grupos de miR-27b. Todos los ratones fueron inyectados por vía intratumoral con imitadores de colesterol conjugado (1 OD imita /hora /ratón) (GenePharma Tech, Shanghai, China) dos veces por semana y los tumores se mide cada 4 días. Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical 5 semanas después de la décima inyección, y se aislaron y evaluaron tumores trasplantables.
ensayo de inmunofluorescencia
Todos los tejidos de xenoinjerto se fijado con formalina y embebidos en parafina-para seccionar en un microtomo Leica. secciones de cuatro micras fueron preparadas y recuperación de antígeno realizaron hirviendo las muestras durante 15 minutos a 100 ° C en citrato de sodio /l 10 mmol. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con 0,3% de peroxidasa de hidrógeno durante 20 min, y las muestras se bloquearon con PBS que contiene 1% de FBS. policlonal de conejo anti-ratón CD31 IgG (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) se diluyó 1:200 y se agrega como el anticuerpo primario; las muestras se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche. Las muestras fueron incubadas con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Multisciences Biotech, Hangzhou, China).
ensayo de luciferasa
El vector de expresión pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target (Promega ) contenían el ARNm VEGFC 3'UTR del sitio diana de miR-27b o un sitio diana de miR-27b mutado (ver S1 archivo). Los plásmidos pRL-TK (Promega) se co-transfectaron en células 293T, ya sea con el sinóptico control negativo (5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '), imitador miR-27b (5'-UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3'), o anti-miR 27b mímica (5'-GCAGAACUUAGCCACUGUGAA-3 ') (GenePharma Tech, Shanghai, china) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). La relación de luciérnaga a
se determinó la actividad de luciferasa de Renilla
utilizando el Sistema Dual Luciferase reportero de ensayo (Promega) 48 h después de la transfección en un luminómetro.
Western Blot
La proteína total se extraído de células lisadas con la proteína de mamífero M-PER reactivo de extracción (Thermo) suplementado con el cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma). Después de bloquear con leche no grasa al 5% en solución salina con Tween-20 (TBST) Tris tamponada con de 60 min, la membrana se incubó con los anticuerpos primarios anti--VEGFC humana (tecnología de la señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.) ( 1:2000) o GAPDH anti-humano Kangchen, Shanghai, china) disuelto en 5% de albúmina de suero bovino en TBST durante la noche a 4 ° C. se recogieron (
clínica Muestra CRC Análisis
Los especímenes entre 2008.1 y 2010.12 en el Segundo hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang y confirmado patológicamente. Los tumores se clasifican empleando el sistema de estadificación del tumor Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC) (Tabla S1).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como el medio ± error estándar de la media (SEM). Los resultados qPCR de muestras clínicas emparejadas fueron analizadas por un dos colas de Student pareada
t-test
y los otros resultados por de Student no pareada de dos colas
t
alltests.
P
valores. & Lt; 0,05 indica significación estadística
Otros métodos, incluyendo
La clasificación de células, la construcción del plásmido, el establecimiento de miR-27b, anti-miR-27b, o VEGFC desmontables (VEGFC-shRNA anti-miR-27b células SW620 estables), ELISA, hematoxilina y eosina (HE) tinción, y reacciones en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP), se describen en S1 archivo.
resultados
Niveles de miR-27b disminuir tanto en células madre cancerosas de colon y la mayoría de los tejidos del cáncer
Los CCC desempeñan un papel crucial en la carcinogénesis y están asociados con la recurrencia, metástasis y la resistencia a la terapia [20] - [22]. Un número de marcadores de la superficie se puede utilizar para las CSC de clasificación, incluyendo CD24, CD44, CD166 y CD133 [22]. De estos, CD133 es un marcador buenas CSC de CCR [5], [22] - [25]. Hemos observado propiedades CSC en CD133
+ SW620 células (Figura S1) y los perfiles de expresión de los genes miARN evaluados en CD133
+ y CD133
- células para identificar miRNAs implicados en la progresión tumoral. el análisis de microarrays detectado cuatro hasta reguladas (MIR-1308, miR-720, miR-132 y miR-estrella-181 estrellas) y 14 abajo reguladas (miR-27b, miR-193b, miR-595, miR-27a- estrella, miR-1307, miR-502-3p, miR-652, miR-200b, miR-31, miR-1247, miR-200a, miR-200b-estrella, miR-362-5p, miR-210) miRNAs en CD133
+ células (Figura 1A). Cuando estos resultados se combinaron con los datos de microarrays miARN anteriores (datos no mostrados), única expresión miR-27b difería. Esto fue confirmado por qPCR, lo que demuestra un cambio de 2,77 veces en la expresión de miR-27b en CD133
+
frente
CD133
-. Células (Figura 1B)
(A ) diferencialmente expresado en miARN CD133
+ y CD133
- células. El rojo denota alta y verde indica bajos niveles de expresión. (B) la expresión de miR-27b en CD133
+ y CD133
- las células se evaluó por qPCR. El eje Y indica el cambio veces. (C) la expresión de miR-27b evaluada por qPCR en los tejidos de CRC fresco en comparación con los tejidos normales adyacentes de seis pacientes. El eje Y indica el cambio veces. (D) la expresión de miR-27b evaluado por qPCR en 80 pares de CRC incluido en parafina y tejidos normales adyacentes. los niveles de miR-27b se normalizaron a U6 y se expresan en términos del ciclo umbral (C
t) relación. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & lt; 0,01
También medimos la expresión de miR-27b en muestras de tejidos de CRC. En el número limitado de muestras de tejidos frescos disponibles (n = 6), la expresión de miR-27b se había reducido regulado 1,5-5,5 veces en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales adyacentes (Figura 1C). En un gran número de tejidos embebidos en parafina pareadas, las proporciones de valor del miR-27b al ciclo umbral U6 (C
t) fueron significativamente mayores en los tejidos tumorales, lo que indica una menor expresión de miR-27b en el CCR (Figura 1D). En realidad, los datos de qPCR de 80 pares de CRC incluido en parafina y los tejidos normales adyacentes mostraron que la expresión de miR-27b disminuye en 60% CRC en comparación con 15% elevada. miR-27b Recientemente se ha informado de que un supresor de tumores en el neuroblastoma; por tanto, nos hemos centrado el resto de nuestros estudios sobre la determinación de las funciones biológicas y mecanismos de regulación de miR-27b en el CCR.
miR-27b inhibe el crecimiento tumoral y la angiogénesis en el CCR
establece tanto miR 27b y SW620 líneas celulares estables anti-miR-27b (véase S1 archivo) para estudiar las funciones biológicas de miR-27b (Figura 2 a) mediante la determinación de la formación y la proliferación de colonias
in vitro
y la tumorigénesis
in vivo
. Se encontró que la sobreexpresión de miR-27b reprimió la proliferación celular, mientras que la inhibición de miR-27b a través de la expresión estable de una proliferación celular promovida anti-miR-27b esponja (Figura 2B). Un ensayo de colonias en agar blando indicó que el aumento de expresión de miR-27b prohibido significativamente la formación de colonias, conocido como auto-renovación, mientras que las células anti-miR-27b forman los números más grandes y mayores de esferas que el control negativo (Figura 2C y D). Más importante aún, en un ensayo de tumorogénesis iniciado por inyección subcutánea de 1 x 10
6 células CRC, se encontró que el miR-27b podría fuerte crecimiento del tumor reprimir, mientras anti-miR-27b promovió el crecimiento (Figura 2 E y F).
(a) la expresión de miR-27b en el control negativo (CN), miR-27b y líneas de células SW620 anti-miR-27b se evaluaron mediante qPCR. El eje Y indica el cambio veces. tasa de proliferación (B) Cell detectado mediante la medición de la absorbancia a 490 nm en un ensayo de MTS. Los resultados de un ensayo de colonias en agar blando (C y D). Las colonias se visualizaron por microscopía después de 2 semanas de incubación. Las colonias que contienen & gt; 20 células se contaron. Barras de escala = 200 m. (E) Los resultados de un ensayo de tumorogénesis. Una imagen representativa de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos inyecta por vía subcutánea con 1 x 10
6 células CRC. (F) Comparación de la formación de xenoinjerto
in vivo
. Los volúmenes tumorales se midieron cada semana. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P
. & lt; 0,05
Además, investigó el efecto antitumoral de miR-27b
in vivo en
un modelo de ratón CRC-cojinete humano. Los ratones se asignaron aleatoriamente en el control negativo (NC) o grupos de miR-27b, con cinco ratones por grupo. Los imitadores de colesterol-conjugado NC o miR-27b se inyectaron en los tumores. Dos ratones en el grupo NC murieron después de un tratamiento de 4 semanas; Sin embargo, no se determinó la causa de la muerte. En el grupo de miR-27b, un xenoinjerto desapareció después de 4 semanas de tratamiento (Figura 3A y B), mientras que los otros cuatro xenoinjertos eran suaves al tacto y tumor necrosis severa se observó en el examen patológico (Figura 3C). ensayos de inmunofluorescencia reveló que los xenoinjertos en el grupo de miR-27b tenían menos vasos sanguíneos capilares que aquellos en el grupo NC (Figura 3D), y los resultados qPCR confirmó que los niveles de miR-27b fueron significativamente elevados en xenoinjertos de miR-27b (Figura 3E). Todos estos resultados apoyan un papel supresor tumoral para miR-27b en el CCR y sugieren su potencial como un fármaco anti-CRC.
(A y B) El cáncer colorrectal (CCR) NOD rodamiento /ratones SCID se inyectaron por vía intratumoral con el control negativo de colesterol conjugado (NC) o imita el miR-27b. Se observaron costras en cuatro tumores del grupo de miR-27b (flecha fina). Un tumor del grupo de miR-27b desapareció por completo con sólo una costra restante (flecha gruesa). (C) con hematoxilina y eosina (HE) tinción de los tejidos de xenoinjerto que muestran áreas de necrosis en el grupo de miR-27b. (D) Un ensayo de inmunofluorescencia representativo que muestra la proteína CD31 en los tejidos de xenoinjerto de NC y miR-27b (n = 3). Barras de escala = 200 m. (E) la expresión de miR-27b en xenoinjertos de Carolina del Norte e imita el miR-27b se evaluó mediante qPCR. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P
. & lt; 0,05
VEGFC es un nuevo blanco de miR-27b en el CCR
función
miRNAs principalmente como mediadores de silenciamiento de genes. Objetivos de miR-27b en el CCR se analizaron posteriormente utilizando los datos pronosticados a partir de la base de datos TargetScan (www.targetscan.org). Cientos de objetivos de miR-27b predichos fueron sometidos a un análisis más detallado de enriquecimiento de señalización celular que utilizan las vías de la Enciclopedia de Kyoto de genes y la base de datos vía Genomas (KEGG) (www.genome.jp/kegg/). Usando este enfoque, miR-27b se predijo para apuntar vías de señalización relacionadas con el cáncer, incluyendo VEGF, Wnt y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK). En última instancia, nos centramos en la señalización de Wnt y desde MAPK no se ve afectado de CRC VEGF (datos no mostrados). Se identificaron más VEGFC como objetivo abajo funcional de miR-27b. El VEGFC 3'UTR contiene sitios altamente conservada (Figura 4A) de unión de miR-27b que son sensibles a miR-27b en un ensayo de doble indicador de luciferasa. Se encontró que la actividad de un informador de luciferasa que contiene el VEGFC 3'UTR disminuyó en ~ 70% a la co-transfección con el sinóptico miR-27b, pero aumentó en ~ 100% a la co-transfección con el imitador anti-miR-27b. Por otra parte, ningún cambio se identificó a co-transfección del plásmido informador mutante con cualquiera de miR-27b o imita anti-miR-27b (Figura 4B). los niveles de proteína VEGFC eran también disminuyeron en las células y medio de cultivo después de la transfección con un imitador miR-27b, mientras que los niveles VEGFC aumentaron después de la transfección de un imitador anti-miR-27b (Figura 4C y D).
In vivo
, los niveles de proteína VEGFC fueron más bajos en los xenoinjertos de miR-27b en comparación con el grupo de Carolina del Norte (Figura 4E)
.
(A) VEGFC se predice como una nueva diana de miR-27b . (B) Las células 293T fueron co-transfectadas con plásmidos vacíos pmirGLO Dual-Luciferase reportero o VEGFC 3'UTR plásmidos informadores de luciferasa de luciérnaga y plásmidos PRL-TK-luciferasa, junto con imita el miR-27b o anti-miR-27b. Después de 48 h, luciérnaga se midió la actividad de luciferasa y se normalizaron a la de la luciferasa de Renilla. células (C) CRC se transfectaron con NC, miR-27b o anti-miR-27b mímica y expresión de VEGFC se detectó por Western Blot. células (D) de CRC se transfectaron con NC, miR-27b o anti-miR-27b imita y VEGFC en medio de cultivo se detectó por ELISA. (E) VEGFC proteína en xenoinjertos de control negativo (NC) e imita el miR-27b se detectó por Western Blot. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P
. & lt; 0,05
VEGFC desempeña el papel de tumores promoviendo en el CCR
Muchos estudios han informado de que VEGFC se correlaciona con el crecimiento tumoral y la metástasis en una variedad de cánceres, incluyendo CRC [16] - [18]. Establecimos células SW620 anti-miR-27b-VEGFC desmontables través de la expresión de un inhibidor shRNA (ver S1 Archivo) (Figura 5). VEGFC-desmontables proliferación celular reprimido en comparación con las células NC (Figura 5B), significativamente inhibe la formación de colonias (Figura 5C y D) y el crecimiento tumoral reducido (Figura 5E y F). En conjunto, estas observaciones sugieren fuertemente que VEGFC juega un papel en la estimulación de la proliferación y la promoción de tumorigénesis en CRC. Aunque hay una serie de objetivos de miR-27b predichos, VEGFC como objetivo abajo funcional de miR-27b puede confirmarse plenamente en nuestros experimentos.
(A) VEGFC caída en células estables anti-miR-27b fue confirmada por Western Blot. (B) la tasa de proliferación celular se determinó mediante la medición de la absorbancia a 490 nm en un ensayo de MTS. Los resultados de un ensayo de colonias en agar blando (C y D). Las colonias se visualizaron por microscopía después de 2 semanas de incubación. Las colonias que contienen & gt; 20 células se contaron. Barras de escala = 200 m. (E) Resultados de un ensayo de tumorigénesis. Una imagen representativa de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos por vía subcutánea inyectada con 1 × 10
6 células CRC. (F) Comparación de la formación de xenoinjerto
in vivo
. Los volúmenes tumorales se midieron cada semana. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P
. & lt; 0,05
ADN Hipermetilación reduce la expresión de miR-27b
Tanto las rutas de transcripción y epigenéticos regulan la expresión génica . Los mecanismos epigenéticos incluyen la metilación del ADN, la acetilación de histonas y los ARN no codificantes [26]; silenciamiento de algunos miRNAs se asocia con la isla CpG hipermetilación en una variedad de tipos de cáncer [27] - [29]. Para determinar la función de miR-27b si los mecanismos epigenéticos mediada, cultivamos células en presencia de la histona deacetilasa tricostatina inhibidor A (TSA) (Sangon Biotech, Shanghai, China) o el inhibidor de la metiltransferasa 5-aza-DC (5Aza) (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.). los niveles de miR-27b se mantuvieron sin cambios en las células cultivadas con 1 nmol /ml TSA durante 3 días. la expresión de miR-27b Sin embargo, el tratamiento con 5 nmol /ml 5Aza marcadamente elevada (Figura 6A). Estos resultados sugieren que la hipermetilación del ADN desempeña un papel importante en la regulación de miR-27b. El sitio de promotor predicho de miR-27b en el cromosoma 9 se clonó en un vector de luciferasa (ver S1 File) y verifica por medio de ensayos de luciferasa (Figura 6B). MSP resultados indicaron miR-27b isla CpG hipermetilación en varias líneas celulares de CRC (Figura 6C).
(A) los niveles de expresión de miR-27b en el cáncer colorrectal (CRC) líneas celulares se determinaron mediante qPCR después del tratamiento con 5Aza o TSA durante 3 días. (B) Los resultados de los ensayos de actividad de luciferasa después de la transfección con el promotor de miR-27b predicho normalizado a PRL-TK Renilla luciferasa. análisis (C) MSP de la isla CpG miR-27b en un conjunto de líneas celulares de CRC. Bandas de las calles de la 'M' se obtuvieron productos de PCR utilizando cebadores específicos de metilación y aquellos en los carriles de la 'U' son productos obtenidos utilizando cebadores metilados específicos.
Discusión
La los CCC hipótesis ha sido probada en una amplia variedad de tumores sólidos [20], [21], y la literatura actual está centrado en el papel de miRNAs en el cáncer humano. miRNAs se considera que tienen actividad reguladora extendida en una amplia gama de procesos de desarrollo y están implicados en diversas enfermedades, incluyendo el cáncer [8].
Hemos tratado de investigar la función de miRNAs en el CCR. La hipótesis de que las diferencias moleculares entre las células madre cancerosas y las células cancerosas diferenciadas pueden identificar la molécula clave responsable del crecimiento y progresión tumoral. Tanto
in vitro Opiniones y
in vivo
investigaciones determinaron que CD133
+ en las células CRC podrían clasificarse como células CSC-como en función de sus propiedades de células madre. Este modelo de células madre cancerosas se utilizó para rastrear e identificar 18 miRNAs diferencialmente regulados. miR-27b fue el único miARN ha señalado reiteradamente en estos experimentos; ninguna información sobre el papel de este miARN en el CCR ha sido reportado. Se encontró que el miR-27b no afectó a la diferenciación de células madre CRC mediante la alteración de la expresión de la de células madre genes asociados
Nanog, Oct4, Sox2, Bmi1
(datos no mostrados). Estudios posteriores mostraron disminución de la expresión de miR-27b en la mayoría de los tejidos de CRC.
A continuación se investigó la función de miR-27b en el CCR y demostró que podía reprimir significativamente la auto-renovación
in vitro Opiniones y tumorigenicidad
in vivo
. Por otra parte, se identificaron VEGFC como objetivo abajo funcional de miR-27b usando varios métodos. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que reporta la función específica y un objetivo funcional novela de miR-27b en el CCR. VEGFC pertenece a la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas y su expresión se correlaciona significativamente con una peor grado histológico, invasión linfática y la invasión venosa [16] - [18], [30], y la evidencia reciente sugiere que tiene un papel importante en la angiogénesis. [19], [31] Varios estudios recientes informan que la regulación autocrina de la migración de células de cáncer a través de VEGFC /VEGFR es un inductor importante de la proliferación de células tumorales, invasión y metástasis. [30] Hay evidencia emergente también el apoyo a un posible papel de miRNAs como supresores de tumores u oncogenes que podría conducir a estrategias de tratamiento dirigidas contra el cáncer [32], [33]. miR-34a tiene efectos antitumorales potentes en los tumores de próstata y puede representar un agente terapéutico para el cáncer de próstata [11]. La inyección intratumoral de imita miR-199a /b-3p de colesterol conjugado inhibe el crecimiento tumoral y los niveles de AFP de suero reducido en el carcinoma hepatocelular [34]. Las células malignas son dependientes de los genes miARN expresión aberrante; estos pequeños RNAs ofrecen oportunidades importantes para el desarrollo de terapias basadas en genes miARN futuras [30], [35], [36]. Debido a los graves efectos secundarios de la quimioterapia tradicional, la investigación sobre otros métodos para el tratamiento de CRC, como la terapia génica, es atractivo.
La angiogénesis tumoral es fundamental para el crecimiento del tumor y el mantenimiento, y muchos estudios han demostrado que la angiogénesis inhibidores pueden proporcionar una significativa ventaja terapéutica [37], [38]. Aquí mostramos que la necrosis severa se observó en xenoinjertos de imita el miR-27b, que también desarrollaron un menor número de vasos sanguíneos capilares que el grupo de Carolina del Norte, y en un xenoinjerto desapareció completamente con sólo una costra que queda. Estos datos demuestran el efecto antitumoral de miR-27b
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, lo que sugiere miR-27b para ser un objetivo prometedor para el tratamiento de CRC después de la eficacia y seguridad de la terapia génica se han determinado.
los mecanismos implicados en la regulación de la transcripción son variados, y si bien las que subyacen a la desregulación de los genes miARN en el cáncer aún no se comprenden totalmente, miARN mediada por la hipermetilación del promotor ha sido identificado en la mayoría de los tumores. Encontramos que el miR-27b silenciamiento génico mediado en el CCR es atribuible a la hipermetilación de las islas CpG reversibles y no acetilación de histonas.
El crecimiento de los vasos sanguíneos es esencial para el crecimiento del cáncer y reparación. La evidencia reciente indica que la angiogénesis tumoral podría ser inducida por células madre cancerosas debido a la expresión del factor angiogénico en el microentorno del tumor [37], [39]. La terapia de orientación anti-angiogénesis VEGF puede agotar la vasculatura del tumor y la ablación de células madre cancerosas auto-renovación [37], [40]. Nuestros datos demuestran que el miR-27b tiene su origen en células madre cancerosas de la CRC y actúa como un supresor de tumores importante y factor angiogénico por la orientación VEGFC. Continuando el estudio de células madre cancerosas o angiogénesis facilitaría el desarrollo de nuevos anticancerígenos estrategias terapéuticas. las estrategias terapéuticas basadas en miARN también pueden dar lugar a una mejor gestión de los tumores en un futuro no muy lejano [41], [42]. Estos resultados no sólo permiten una mejor comprensión de los mecanismos que regulan las células CRC sino que también facilitan el desarrollo gradual de las terapias contra el cáncer más eficaces.
Apoyo a la Información
Figura S1.
CD133 + SW620 células exhiben características de células madre cancerosas
in vitro
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in vivo
. (A) La citometría de flujo gráfico de puntos que muestra la distribución de CD133
+ células de la línea celular de CRC, SW620. (B y C) Los resultados de un ensayo de colonias en agar blando. Las colonias se visualizaron por microscopía después de 2 semanas de incubación y los que contienen & gt; 20 se contaron las células. Barras de escala = 200 m. (D) Los resultados de un ensayo de tumorogénesis. Una imagen representativa de xenoinjertos de tumores en ratones desnudos que se inyecta por vía subcutánea con 5 × 10
4 CD133
- o CD133
+ células SW620. (E) Comparación de la formación de xenoinjerto
in vivo
. Los volúmenes tumorales se midieron semanalmente. Las barras de error representan las medias ± SEM, *
P Hotel & lt; 0,05
doi:. 10.1371 /journal.pone.0060687.s001 gratis (TIF)
Archivo S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0060687.s002 gratis (DOC)
Tabla S1.
características clinicopatológicas de los pacientes con CCR
doi: 10.1371. /journal.pone.0060687.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Zhong Shi para la edición de idioma .