Extracto
Para fines terapéuticos, el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) ha sido tradicionalmente considerado como una sola enfermedad. Sin embargo, la evidencia reciente sugiere que los dos subtipos principales de NSCLC, adenocarcinoma (AC) y el carcinoma de células escamosas (SQCC) responden de manera diferente a los dos quimioterapias generación moleculares específicas y nuevas. Por lo tanto, la identificación de las diferencias moleculares entre estos tipos de tumores puede afectar nueva estrategia de tratamiento. Se realizó el primer análisis a gran escala de 261 tumores de NSCLC primarios (169 AC y 92 SQCC), integrando el número de copias de ADN, la metilación y de expresión génica perfiles de todo el genoma para identificar alteraciones moleculares específicos de subtipo correspondiente al diseño de nuevos agentes y la elección de la terapia . Comparación de CA y SQCC paisajes genómicos y epigenómicos reveló 778 genes alterados con los cambios de expresión que se seleccionan durante el desarrollo del tumor de una manera de subtipo específico correspondiente. Análisis de & gt; 200 NSCLCs adicionales confirmaron que estos genes son responsables de conducir el desarrollo diferencial y resultante fenotipos de AC y SQCC. Es importante destacar que, identificamos vías oncogénicas clave interrumpidos en cada subtipo que probablemente sirve como la base para su biología del tumor diferencial y los resultados clínicos. Regulación a la baja de
HNF4α
genes diana era la vía más común específica para la AC, mientras que SQCC demostró interrupción de numerosas enzimas modificadoras de histonas, así como el factor de transcripción
E2F1. En silico
selección de compuestos terapéuticos candidatos utilizando componentes de la ruta subtipos específicos identificados inhibidores de HDAC y PI3K como posibles tratamientos adaptados a los pulmones SQCC. En conjunto, nuestros resultados sugieren que el AC y SQCC desarrollan a través de distintas vías patogénicas que tienen implicación significativa en nuestro enfoque de la gestión clínica de CPCNP
Visto:. Lockwood WW, Wilson IM, Coe BP, Chari R, Pikor LA , Jue KL, et al. (2012) Divergente genómicos y epigenómicos paisajes de cáncer de pulmón Los subtipos de relieve la Selección de diferentes vías oncogénicas durante el desarrollo del tumor. PLoS ONE 7 (5): e37775. doi: 10.1371 /journal.pone.0037775
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 8 de noviembre de 2011; Aceptado: April 27, 2012; Publicado: 21 May, 2012
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) (RP-86731, RP-77903, RP-110949 ), Sociedad canadiense del cáncer (CCS20485), NCI Red de Investigación de Detección temprana y el Departamento de Defensa (CDMRP W81XWH-10-1-0634). W.W.L., I.M.W., B.P.C., R. C., K.L.T. y L.A.P. fueron apoyados por becas de CIHR y NSERC (Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación), y W.W.L. por un CIHR Jean-Francois Saint Denis Fellowship en Investigación del Cáncer, R. C. Banting por una beca posdoctoral, K.L.T. y L.A.P. por Vanier Canadá Becas de Postgrado. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo ya pesar de los tratamientos actuales, el pronóstico sigue siendo pobre, con una supervivencia de cinco años de & lt; 18% [1], [2], [3]. el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) son los dos principales grupos histológicos. SCLC se presenta principalmente en las vías respiratorias centrales, mientras NSCLC puede ocurrir en el centro o en la periferia. La patología diferentes de los dos tipos se refleja en su manejo clínico.
NSCLC es una enfermedad heterogénea con carcinoma de células escamosas (SQCC) y adenocarcinoma (AC) siendo los subtipos histológicos predominantes. Tradicionalmente, estos subtipos se han tratado como una entidad única enfermedad con estrategias de tratamiento determinado únicamente por estadio de la enfermedad. Sin embargo, la evidencia reciente de los ensayos clínicos se ha demostrado que los subtipos histológicos de NSCLC responden de manera diferente a los dos fármacos dirigidos y quimioterapias de nuevo desarrollo, posiblemente relacionadas con las diferencias en la obtención de células y orígenes patogénicos [3], [4], [5], [6] , [7], [8], [9]. Uno de los ejemplos más llamativos es el folato pemetrexed antimetabolito, que muestra una eficacia superior y está restringido para su uso en pacientes con no SQCC, presumiblemente debido a la más alta expresión de timidilato sintasa en tumores SQCC [9]. Del mismo modo, numerosos estudios han asociado una mayor tasa de respuesta al tratamiento de la CA con los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR gefitinib y erlotinib, lo que refleja la mayor prevalencia de
EGFR
mutaciones en este subtipo [6], [10]. Estas discrepancias en la biología del tumor y la respuesta clínica ponen de relieve la necesidad de determinar los factores genéticos, epigenéticos y metabólicas similitudes subyacentes, así como las diferencias entre los subtipos de NSCLC con el fin de definir las vías más adecuadas para la intervención terapéutica.
inicial de perfiles de expresión génica los estudios fueron capaces de segregar a los tumores de CA y SQCC en sus respectivos grupos histológicos basados en modelos de múltiples genes; Sin embargo, los eventos críticos en la tumorigénesis pueden estar enmascarados por cambios reactivos al examinar los perfiles de expresión por sí sola [11], [12], [13]. Por el contrario, la copia de ADN o número de metilación del ADN cambios correspondientes con cambios de expresión génica son a menudo considerados como evidencia de la causalidad. Tales cambios en el nivel de ADN son eventos críticos de desregulación progresión y otros fenotipos de cáncer [14], [15], [16] de conducción. Puesto que se cree que SQCC y de CA a desarrollarse a partir de linajes celulares distintos en diferentes regiones del pulmón, la gama de alteraciones genéticas necesarias para la iniciación del tumor se puede producir de una manera linaje restringido. Por ejemplo, la amplificación de los oncogenes de supervivencia linaje
Sox2
y
TITF1 /NKX2-1
se han identificado recientemente como eventos clave específicas para el desarrollo de los pulmones SQCC y AC, respectivamente [17] , [18]. Sin embargo, estos genes por sí solos son insuficientes para explicar la diversidad fenotípica de los subtipos, lo que sugiere que la gran mayoría de los genes responsables de su desarrollo diferencial siguen siendo desconocidos. Aunque se han descrito las diferencias genéticas y epigenéticas entre SQCC y AC, la baja cobertura del genoma y /o tamaños de muestra pequeños han sido limitante [19], [20], [21], [22], [23], [24].
En este estudio, hemos realizado el primer análisis a gran escala de los tumores de NSCLC primario (261 -169 total de CA y 92 SQCC), la integración de perfiles de alta resolución del número de copias de ADN, la metilación y de expresión génica para identificar el subtipo específico crítica características moleculares. La caracterización de los paisajes genómicos y epigenómicos de CA y SQCC reveló un asombroso número de diferencias a nivel de ADN con posteriores cambios de expresión génica que se seleccionan para el desarrollo de tumores de pulmón durante el subtipo específico. Es importante destacar que, identificamos vías oncogénicas clave interrumpidos por estas alteraciones que probablemente sirven como base para los comportamientos diferenciales en la biología del tumor y los resultados clínicos. Por último, a través del análisis de pronóstico y
in silico
selección de compuestos terapéuticos candidatos utilizando componentes de la ruta subtipo específico, se muestra cómo estos nuevos hallazgos pueden influir en nuestro enfoque para el manejo clínico de NSCLC.
Resultados
Evaluación de la inestabilidad genómica global en CA y SQCC
los carcinomas de todos los tipos son conocidos por albergar muchas alteraciones a nivel de ADN vinculados, en parte, a la exposición cancerígeno [25]. De hecho, el humo del tabaco se ha relacionado con la inducción de mutaciones en el ADN no sólo, sino también amplia inestabilidad cromosómica [26]. Sobre la base de la exposición a agentes carcinógenos diferentes de tabaco de las células en la central (SQCC) y periférico (AC) de las vías respiratorias, hemos tratado primero para determinar si la inestabilidad genómica global fue más prevalente en cualquiera de los dos subtipos. Hemos generado y compararon los perfiles de número de copias de todo el genoma de 261 NSCLC Tumores 169 AC y 92 SQCC - enlosando resolución de la gama de hibridación genómica comparada (CGH) (Juego de muestra#1, el cuadro S1) [27], [28], [29] , [30]. Después de la hibridación, la eliminación estándar de las desviaciones sistemáticas, y la segmentación computacional para identificar regiones de ganancia y la pérdida, el número de ganado, perdido, y las sondas neutros se evaluó para cada tumor. La inestabilidad genómica relativa observada en los grupos CA y SQCC luego se comparó (Figura 1a). Se comparó el número medio de intentos alterados (por muestra) entre los grupos utilizando la prueba U de Mann-Whitney. No se encontraron diferencias significativas entre los dos subtipos, en consonancia con el trabajo previo que mostró que el contenido de ADN similar en todos los subtipos [31]. Este análisis demuestra que ni el subtipo tiene una proclividad a la ganancia o pérdida de ADN. Por lo tanto, las diferencias observadas en la frecuencia de alteración en un locus dado se pueden atribuir a subtipo selección específica de los genes incluidos dentro de las regiones alterados y que no a diferentes grados de inestabilidad genómica aleatorio asociado con el desarrollo de tumores
.
(a) Porcentaje de clones de cada estado en ambos subtipos. Los diagramas de caja indican el porcentaje de clones con el estado -1 (pérdida /deleción), 0 (neutro) y 1 (ganancia /amplificación) en cada uno de los subtipos. Los porcentajes se calcularon para cada muestra y para cada estado. Estas parcelas demuestran la similitud en porcentajes totales de alteración del genoma entre los tumores de CA y SQCC y sugieren que las regiones recurrentemente alterados de genoma son el resultado de la selección en lugar de una frecuencia más alta de la ganancia o pérdida de ADN en cualquier subtipo. (B) las frecuencias de modificarlo, en 169 AC (rojo) y los tumores SQCC 92 (azul) se muestran a través de todo el genoma humano. líneas negras verticales continuas representan los límites de cromosomas, mientras que las líneas negras discontinuas representan los límites de los brazos cromosómicos. La frecuencia de la ganancia del número de copias se denota en el panel superior. Tenga en cuenta la alta frecuencia de ganancia de 3q en el subtipo SQCC, en consonancia con los informes anteriores. regiones adicionales de diferencia, el número de copias también son claras, tales como la ganancia más común del cromosoma 2p en AC. El segundo panel (medio) muestra la frecuencia de la pérdida de número de copias. loci de genes supresores de tumores comunes, tales como el cromosoma 3p son comunes entre AC y SQCC, pero existen grandes diferencias en regiones como el cromosoma 4q. La importancia del número de copias disparidad (inversa p-valor corregido para comparaciones múltiples) entre los subtipos de CA y SQCC se representa en el tercer panel (parte inferior). las líneas negras representan regiones consideradas estadísticamente diferentes (p≤0.01) mientras que las líneas grises no lo son.
paisajes genómicas dispares caracterizan SQCC pulmón y AC Hotel
A pesar de que los subtipos de NSCLC presentan niveles similares de la inestabilidad genómica, si vías genéticas específicas están implicadas en su desarrollo diferencial, las diferencias en las alteraciones genómicas seleccionadas durante la tumorigénesis debe estar presente. Para determinar si existen alteraciones genéticas únicas para cada subtipo de NSCLC, buscamos regiones no aleatorias recurrentes de la aberración en cada grupo. Las muestras se agrupan por subtipo y sondas fueron agregados en regiones basadas en el estado número de copias similares. Se determinó la frecuencia de alteración a través de autosomas y se comparó entre los subtipos utilizando la prueba exacta de Fisher y los resultantes
P
-valores fueron corregidos para comparaciones múltiples con un punto de corte de ≤0.01 consideró significativo. Además, requerimos regiones que ser alterados en & gt; 20% de las muestras de un grupo de subtipos y una diferencia entre los grupos de & gt; 10% para ser considerados "de interés". La figura 1b muestra los paisajes genómicas resultantes de CA y SQCC en base a la frecuencia de la ganancia y la pérdida de todo el genoma, y pone de relieve las regiones correspondientes de diferencia entre los subtipos que se identificaron.
Este análisis reveló 294 regiones de la copia número disparidad entre SQCC y AC, de los cuales 205 eran SQCC-específica, mientras que 89 eran específicas de CA (Tabla S2). Aunque algunas regiones se solapaban, el carácter de la alteración (es decir, ganancia en función de la pérdida) era específico para un grupo individual. Dado que el estado de alteración entre los subtipos difieren fuertemente, nos clasificamos estos como alteraciones del número de copias subtipo específico. En total, estas alteraciones cubrieron aproximadamente 550 Mbp del genoma, que varían en tamaño desde grandes segmentos en los brazos cromosómicos (64,8 MBP en el 4Q) a picos discretos única kilobases de tamaño (0,05 Mbp en varios lugares).
Curiosamente , el número de copias de perfiles, de 20 de carcinoma de pulmón de pre-invasiva
las lesiones in situ
, los precursores supone que los tumores de pulmón SQCC, revelaron que la gran mayoría (186/204, ~92%) de alteraciones SQCC-específicas están presentes en este etapa del desarrollo del tumor, lo que sugiere que estos eventos pueden comenzar temprano en la tumorigénesis SQCC (Tabla S3). Las alteraciones restantes que están presentes en los tumores SQCC y que no se encuentra en el carcinoma de
las lesiones in situ
pueden representar potenciales conductores de SQCC progresión (Tabla S3, con posibles genes diana de estas regiones identificadas en la Tabla S4, discuten a continuación ). En conjunto, estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que los subtipos se desarrollan a través de diferentes vías genéticas.
Gene interrupciones se seleccionan de manera específica subtipo durante el desarrollo NSCLC
El descubrimiento de las diferencias de número de copias de ADN entre los subtipos de NSCLC sugiere que los genes dentro de estas áreas podrían ser preferentemente seleccionados durante la tumorigénesis y, por tanto, responsable del desarrollo diferencial y las características patológicas de los subtipos. Para identificar los posibles genes diana de estas alteraciones, hemos integrado el ADN el número de copias de genes y los niveles de expresión [32]. Perfiles de expresión génica fueron generados para un subconjunto de tumores que fueron analizados por CGH array (20 SQCC y 29 tumores de corriente alterna, la Muestra Set#2, el cuadro S1). La hipótesis de que los genes dirigidos por alteraciones subtipos específicos serían diferentes a nivel de ADN con las diferencias que emparejan a nivel de la expresión génica. Además, también se analizó el tejido pulmonar normal para asegurar que sólo los genes expresados diferencialmente en los tejidos tumorales (relativos a la normalidad) se mantuvieron como candidatos, una característica consistente con un papel en el desarrollo de tumores.
Los genes situados dentro de cada subtipo-específica se identificó el número de copias y la alteración de los niveles de expresión comparación entre las muestras SQCC y AC para determinar aquellos que son expresados diferencialmente (p & lt; 0,001, después de múltiples pruebas de corrección). Para SQCC, 4669 genes únicos asignan a las alteraciones del número de copias subtipo específico (~ 23 genes por región), y 797 (17%) de ellos fueron expresados diferencialmente entre los subtipos en la dirección prevista. En CA, 2050 genes únicos se encuentran en las alteraciones del número de copias subtipo específico (~ 23 por región) y 171 (8%) fueron expresados diferencialmente entre los subtipos en la dirección prevista.
A pesar de que algunos genes se superponen, su interrupción patrones eran específicos para el tipo de cáncer individual, sugestivo de roles (oncogénicos vs supresor del tumor) en función del contexto celular opuestas. Por lo tanto, estos genes también se considera que los objetivos específicos de subtipo. Cuando se combinan, los candidatos SQCC y AC-número de copias subtipo específico regulados representaron 968 genes únicos y mostraron una clara distinción en los niveles de expresión entre los dos subtipos.
Además de demostrar una relación entre la expresión y número de copia alteración, también se requiere un gen candidato subtipo específico que se desregulado en tejidos de cáncer con respecto al tejido normal [33]. Se analizaron los niveles de expresión de los candidatos en un panel independiente de 53 SQCC y 58 tumores de pulmón de CA y 67 muestras de células exfoliadas del bronquiales individuos sin cáncer (muestra Sets#3 y#4, el cuadro S1). En total, 655 de los 797 SQCC-específica y 143 de los 171 genes AC-específicos tenían sondas correspondientes en esta gama plataforma. Estos genes se compararon entre el respectivo subtipo de cáncer y las células bronquiales normales con el fin de determinar los que se expresó significativamente diferente (p & lt; 0,001) en la dirección predicha por la correspondiente alteración del número de copias en el que se encuentran. Este análisis reveló que 447 (68%) del SQCC-específico y 71 (49%) de los genes AC-específicos fueron desregulados en los tejidos cancerosos (492 alteraciones de genes únicos, Tabla S4). Dado que estos genes cumplen los tres criterios para definir candidato subtipo específico, el número de copias alteración objetivos regulada como se describe anteriormente, concluimos que podrían representar las alteraciones de genes críticos que impulsan el desarrollo de cada subtipo (Figura 2).
Transformado se muestran los datos de expresión absolutos para los 492 genes únicos que presentan alteración en los niveles de expresión como resultado de las diferencias de número de copias. Además, estos genes son hacia arriba o hacia abajo-regulada en el subtipo que se interrumpen en comparación con el tejido pulmonar normal (ver resultados). Una expresión de alto nivel se indica por el rojo mientras que el negro indica progresivamente los niveles más bajos de expresión. Las muestras de CA se indican mediante el resaltado de color rojo en la parte superior de cada columna, mientras que las muestras SQCC se indican mediante el resaltado de color azul. Cada gen está ordenada de acuerdo a su posición cromosómica. Hay una clara diferencia en la expresión de estos genes con indicación de su participación específica en los subtipos.
Diferentes vías oncogénicas se asocian con el desarrollo de CA y SQCC
vías y procesos celulares específicamente interrumpido en subtipos individuales pueden revelar los mecanismos oncogénicos clave que impulsan el desarrollo diferencial de CA y SQCC. Por lo tanto, después de identificar los genes responsables de las diferencias entre los subtipos, el próximo querían investigar sus funciones biológicas. Para descubrir las redes relacionadas subtipo de genes relacionados biológicamente Se realizó el análisis Ingenuity Pathway (IPA) de la CA y 71 genes diana específicos SQCC 447 (Figura 3, Tabla S5). SqCCs exhibió interrupciones en las redes de genes que funcionan en la regulación de la replicación del ADN, la recombinación y reparación, con funciones adicionales en la estructura del tejido linfoide y desarrollo (Tabla S4). Los genes implicados en la red SQCC parte superior se asociaron con la unión y la modificación de la proteína histona H4, así como la regulación del complejo NFKB (Figura 3b). Por el contrario, las redes primarias de CA muestran las funciones asociadas con la señalización de célula a célula, el desarrollo y el metabolismo de fármacos (Tabla S5). La principal red de genes AC-específica se compone principalmente de los genes regulados por el factor de transcripción HNF4α (Figura 3a), mientras que la red 2 AC contenía numerosos genes controlados por TGF y TP53. La alteración diferencial de las redes de genes en CA y SQCC era más sugestivo de mecanismos distintos de la tumorigénesis de los subtipos
.
Ingenuity Pathway Analysis se utilizó para identificar redes biológicamente relacionados partir de los genes específicos de subtipos desregulados por el número de copias-subtipo específico alteraciones (ver Métodos). Se muestran las redes de genes resultantes superiores para cada subtipo. a) Red de CA#1 de genes relacionados con la señalización HNF4. b) la red SQCC#1 se presentan las posibles interacciones entre múltiples genes histona regulación, tanto para a) yb), las líneas continuas denotan interacciones directas mientras que las líneas de puntos representan las interacciones indirectas entre los genes. Los componentes de red resaltados en rojo son upregulated en el subtipo correspondiente, mientras que los verdes se destacó downregulated. Los que no se utilizan resaltado por el software para mostrar las relaciones. Información adicional acerca de los genes y sus interacciones se puede encontrar en www.ingenuity.com. o dentro de la discusión. En este diagrama moléculas están representados como tales; sacacorchos representan enzimas, moléculas en forma de Y son receptores transmembrana, las moléculas en forma de dedal son transportadores, quinasas son triangulares, circulares y moléculas abarcan todos los otros productos génicos.
subtipo variaciones globales en los niveles de metilación de ADN reflejan diferencias en células de origen
a diferencia del genoma, que es idéntico para la mayoría de las células normales en el cuerpo, el epigenoma difiere entre tipos de tejidos [34], [35]. Del mismo modo, los genomas del cáncer exhiben mundial hypomethylation en diferentes grados dependiendo del tejido de origen [36]. los perfiles de metilación de ADN también se ven influidas por los perfiles mutacionales dentro de los diferentes tipos de cáncer, como se conoce también hiper- ADN y hipometilación alteraciones estar relacionado con el tejido y los antecedentes genéticos [37], así como el hábito de fumar [38]. Teniendo en cuenta las diferentes espectro mutacional de los dos subtipos de NSCLC y sus probabilidades diferentes células de origen, se determinó el nivel general de la metilación del ADN 30 CA y 13 muestras SQCC (Muestra Set#4, el cuadro S1). Para permitir la comparación de los tumores SQCC y AC de apropiarse de las células normales de la misma, los perfiles de metilación de ADN también se generaron para 30 muestras no malignas parénquima pulmonar (de referencia AC) y 18 muestras de células histológicamente normales exfoliadas bronquiales epiteliales (referencia SQCC) de pacientes con NSCLC ( Juego de muestra#1, el cuadro S1). Análisis de 27.578 CpG dinucleótidos sondas dentro de & gt; 13000 islas CpG muestra que la metilación del ADN en el epitelio bronquial y los tumores SQCC fue ligeramente menor que en el pulmón normal o tumores de corriente alterna (figura 4a). Esto se refleja y exagerada en los dinucleótidos CpG fuera de las islas CpG, lo que sugiere que las células de la vía aérea central están globalmente hypomethylated en relación con las células de las vías aéreas periféricas, ya sea canceroso o no (Figura 4b). En este caso, los dos grupos son significativamente diferentes en comparación con el uso de una prueba de Mann-Whitney (
p Hotel & lt; 0,0001).
La comparación de los niveles promedio de metilación del ADN entre tumoral CA, CA normal ( histológicamente parénquima normal de pulmón), tumor SQCC, y el epitelio bronquial. a) Los promedios de sonda isla CpG. El promedio de cada uno de los perfiles de las sondas situadas dentro de las islas CpG se representa como un componente dentro del diagrama de caja. En este panel, SQCC y muestras epiteliales bronquiales parecen tener ligeramente más bajos niveles de metilación del ADN que el tumor de CA y grupos normales de corriente alterna. b) no CpG promedios sonda isla. El promedio de cada uno de los perfiles en las sondas que no están ubicadas dentro de las islas CpG se representa como un componente dentro del diagrama de caja. En esta figura β-valor es el nivel de metilación como se define por la señal de la señal metilada /total para cada sonda. En este panel, SQCC y epitelios bronquiales son significativamente inferiores en comparación con el nivel de metilación del tumor CA o grupos normales de corriente alterna, lo que indica que, fuera de las islas CpG, donde el grueso de la metilación genómica se produce, las muestras centrales de las vías respiratorias son más hypomethylated. c) los niveles de metilación diferencial medio en las islas CpG. El diferencial medio se traza para las 30 muestras de corriente alterna y las 13 muestras SQCC. Los dos grupos son muy similares en su perfil diferencial dentro de sondas isla CpG. d) los niveles de metilación diferencial medio en los sitios CpG no ubicados dentro de las islas CpG. En esta gráfica el nivel medio de metilación diferencial se traza para sondas que no se encuentran en las islas CpG. Una vez más, los dos grupos no son significativamente diferentes de una prueba de Mann-Whitney.
Para determinar si estas tendencias fueron evidentes en las alteraciones epigenéticas específicas de tumor, (es decir, aquellas que existen dentro del subtipo de tumor cuando en comparación con una célula normal correspondiente), se compararon los perfiles de metilación diferencial de tumores de CA y SQCC. Estos perfiles se generaron restando el perfil de metilación de ADN normal medio para las referencias de cada uno de los 30 AC y 13 tumores SQCC, respectivamente. Al igual que en la evaluación global de las alteraciones del número de copias (pérdidas y ganancias), no hubo diferencias significativas entre los perfiles diferenciales de corriente alterna y los perfiles diferenciales SQCC (Figura 4c) en sondas isla CpG o sondas isla no CpG (Figura 4d). Basado en esto, de nuevo razonó que las diferencias observadas en la hipermetilación o hipometilación frecuencias entre los subtipos son probable que sea debido a la selección-subtipo específico de estas alteraciones.
Diferentes alteraciones epigenéticas están involucrados en el desarrollo de la AC y subtipos SQCC
Aunque no se observaron diferencias en los cambios globales de metilación entre los subtipos, los dos subtipos pueden tener frecuencias de alteración diferencial en loci individuales. Para determinar si los tumores de CA y SQCC poseen diferencias específicas de locus en la metilación del ADN, se analizaron las frecuencias de alteración metilación en loci de genes asociados en ambos subtipos. los niveles de metilación de ADN de los tumores se compararon con la media de los perfiles de los tejidos normales de referencia disponibles. La frecuencia de hipermetilación de la sonda y la hipometilación (tumor normal | ≥0.15) en muestras de CA y SQCC se comparó con la prueba exacta de Fisher. Después de la corrección para comparaciones múltiples, se encontraron 2708 sondas correspondientes a 2384 genes para ser metilado diferencialmente (p = 0.05). El grupo SQCC contenía marcadamente más recurrentemente hiper e hypomethylated loci que el grupo de AC, similar a la disparidad en el número de copia genes regulados por el número de subtipos específicos observados en el análisis de las alteraciones genómicas. De hecho, sólo el 8% de las sondas 2708 significativos fueron más frecuentemente alterado en la AC, el resto siendo más comúnmente hiper o hypomethylated en SQCC.
Para refinar aún más la lista de los genes diferencialmente metiladas a aquellos cuya expresión génica refleja los niveles esperados en base a su alteración epigenética, se evaluaron los 2384 genes con metilación diferencial de la expresión diferencial entre los subtipos, así como la expresión diferencial de los tejidos normales, usando un umbral de p-valor corregido de
p Hotel & lt; 0.05. 32 genes candidatos de CA y 297 genes SQCC cumplen estos criterios estrictos y se analizaron adicionalmente como genes regulados epigenetically subtipos específicos (Tabla S6).
epigenetically genes regulados los genes del complemento genéticamente regulados
Para determinar si los genes regulados epigenetically-32 AC-específicos y 297 SQCC-específicas llevadas a cabo funciones similares a los genes específicos de subtipo descubiertas por el análisis del número de copias de ADN descrito anteriormente, se realizó el análisis de la interrupción vía. Esto reveló que la red de genes regulados epigenetically-más significativo en AC está involucrado en el ciclo celular, la muerte celular, y desarrollo celular (Tabla S7). Esto es en parte, en contraste con la red de CA parte superior de número de copia regulada genes, que de manera similar tienen funciones asociadas con el desarrollo del tejido, sino que también poseen la señalización celular y la función del sistema hematológico en común (Tabla S4). El grado global de similitud entre los genes AC-específica que son regulados genéticamente o epigenética es bastante pequeña, probablemente debido al bajo número de genes específicos identificados-AC (posibles razones para esto son examinadas más adelante). Por el contrario, las redes de genes SQCC en ambos análisis son muy similares. Por ejemplo, la replicación del ADN, la recombinación y reparación son muy funciones de los genes identificados por tanto el ADN ofrecieron número de copias y la metilación del ADN análisis de SQCC (Tablas S5 y S7, respectivamente). Además, los genes implicados en la enfermedad inmunológica y la estructura del tejido linfoide y desarrollo eran prominentes. De particular interés fue el enriquecimiento de los genes aberrantemente metilados en la vía de señalización del cáncer de pulmón de células pequeñas (compuesto por genes que se sabe desregulado en el cáncer de pulmón de células pequeñas como anotado por el ingenio) (Figura 5a). Esta fue la vía canónica enriquecido más significativamente en ninguno de subtipo que se vio afectada por las alteraciones de metilación del ADN y es de interés porque estos dos tipos de cáncer de pulmón (SCLC) y SQCC surgen en las vías respiratorias centrales con una exposición similar a los carcinógenos del humo del cigarrillo.
E2F1
se encuentra entre los genes sobreexpresados hypomethylated y representados en esta vía, y se sabe que se sobreexpresa en SCLC y para conducir la expresión de
EZH2, España que también se sobreexpresa en SCLC [39], [40]. Para explorar esta vía más, se investigó si
EZH2
fue más altamente expresado en SQCC que los tumores de corriente alterna (como consecuencia del diferencial
E2F1
expresión). Como era de esperar, se encontró que los
EZH2
se expresó a un nivel significativamente mayor en los tumores SQCC que los tumores de corriente alterna, lo que demuestra la consecuencia biológica de
interrupción E2F1 gratis (Figura 5b). La expresión diferencial de
EZH2
en los dos subtipos es significativa, debido a las numerosas diferencias en la metilación del ADN aberrante observada entre subtipos; esto podría reflejar el papel clave de EZH2 en el grupo Polycomb, un complejo de proteínas que participan en la metilación del ADN [41].
a) SCLC componentes alterados por la metilación del ADN en SQCC señalización. En este esquema de la vía de señalización SCLC, los genes que se sobreexpresan hypomethylated y se muestran en rojo, y los que se hypermethylated y underexpressed se muestran en verde. Componentes en todos los niveles de la vía se ven afectados, incluyendo el factor de transcripción
E2F1
, que impulsa la expresión del miembro del grupo Polycomb oncogénico
EZH2
. b)
EZH2
expresión en tumores AC 58 y 53 tumores SQCC.
EZH2
expresión fue evaluada en un conjunto de datos externa, y se encontró que era más alta, como se predijo, en los tumores SQCC comparación con los tumores de corriente mediante una prueba de Mann-Whitney (p & lt; 0,0001). c)
FHIT
niveles de metilación diferencial en tumores SQCC y AC.
FHIT
ha demostrado ser desregulado tanto por deleción y la hipermetilación de una manera que era específico para tumores SQCC. Mostrar aquí son los niveles de metilación del ADN diferencial de 30 tumores de CA y 13 tumores SQCC. Los tumores se SQCC hypermethylated en un grado mucho más alto que los tumores de corriente alterna, en consonancia con los resultados publicados anteriores.
número de copias de ADN y los datos de metilación del ADN son complementarias desde una perspectiva de genes específicos también. Esto se pone de relieve por los siete genes (
ATP2C1
,
PCYT1A
,
ZWILCH
,
CENTB2
,
bag4
,
PARP11
y
CSDA
, Tabla S8) que se rompe por dosis-gen en un solo subtipo de metilación de ADN y en la otra.
PARP11
es un ejemplo de la diferencia de la activación /inactivación por el número de copias de ADN y la metilación del ADN, que se discute más adelante.
disrupción genética y epigenética concertada de los genes específicos de subtipo
con el fin de determinar si tanto el número como la metilación del ADN aberraciones de copias de ADN interrumpidos simultáneamente ningún gen, se combinaron las listas de genes específicos de subtipo obtenidas utilizando los dos enfoques analíticos descritos anteriormente (Tabla S9).