Extracto

Antecedentes

En la actualidad, está bien establecido que el cáncer surge en el tejido inflamado crónicamente. Una serie de forma inflamosomas NOD-like receptors (NLRs), complejos multiproteicos intracelulares críticos para la generación de citoquinas pro-inflamatorias maduras (IL-1 e IL-18). A medida que la inflamación crónica de la mucosa gástrica es una consecuencia de
Helicobacter pylori
infección, se investigó el papel de los polimorfismos genéticos y la expresión de genes implicados en la vía de señalización de la NLR en
H. infección y relacionada pylori
cáncer gástrico (CG).

Materiales y Métodos

Cincuenta y un polimorfismos genéticos fueron genotipo en 310 de origen chino (87 casos GC no cardias y 223 controles con dispepsia funcional). Además, la expresión de genes de 84 moléculas implicadas en la vía de señalización NLR se evaluó en células THP-1 estimuladas con dos
H. pylori s
trenes, GC026 (GC) y 26695 (gastritis).

Resultados


CARD8
-rs11672725,
NLRP3
-rs10754558,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs199475867 y
NLRX1
-rs10790286 mostraron asociaciones significativas con GC. En el análisis multivariado,
CARD8
-rs11672725 siguió siendo un factor de riesgo (OR: 4,80; IC del 95%: 1,39 a 16,58). Además,
NLRP12-
rs2866112 aumentaba el riesgo de
H. pylori
infección (OR: 2,13 IC del 95%: 1,22 a 3,71). Los análisis estadísticos evaluar el efecto conjunto de
H. pylori
infección y los polimorfismos seleccionados reveló una fuerte asociación con GC (
CARD8
,
NLRP3
,
CASP1
y
NLRP12
polimorfismos). En los análisis de la expresión génica, cinco genes que codifican NLRs estaban regulados de manera significativa en
H. pylori
células -challenged (
NLRC4
,
NLRC5
,
NLRP9
,
NLRP12
y
NLRX1
). Curiosamente, persistente sobre regulación de
NFKB1
con baja regulación simultánea de
NLRP12
y
NLRX1
se observó en
H. pylori
células GC026-desafiado. Además, el NF-kappa B genes diana que codifican citoquinas proinflamatorias, quimiocinas y moléculas que participan en la carcinogénesis fueron marcadamente reguladas en
H. pylori
células GC026-desafiado.

Conclusiones

Novel asociaciones entre los polimorfismos en la vía de señalización NLR (
CARD8
,
NLRP3
,
NLRP12
,
NLRX1
, y
CASP1
) y GC fueron identificados en individuos chinos. Nuestros polimorfismos genéticos y genes de expresión resultados ponen de relieve la importancia de la vía de señalización de la NLR en la carcinogénesis gástrica y su estrecha interacción con NF-kB

Visto:. Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fock KM, Mitchell HM (2014) El NOD-like receptor de señalización de la vía en
Infección por Helicobacter pylori
y relacionados con el cáncer gástrico: Un Estudio de casos y controles y análisis de expresión génica. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10.1371 /journal.pone.0098899

Editor: David M. Ojcius, Universidad de California en Merced, Estados Unidos de América

Recibido: March 2, 2014; Aceptado: May 8, 2014; Publicado: 5 Junio ​​2014

Derechos de Autor © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el Consejo del cáncer de Nueva Gales del Sur, Australia (Grant No.66 /04). NO. Kaakoush es apoyado por una beca de Carrera Temprana del Consejo de Investigación Médica y Salud Nacional, Australia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

La incidencia global de cáncer gástrico (CG) varía mucho de un país. Según las estadísticas mundiales sobre el cáncer, se estima que un total de 952.000 nuevos casos de CG y 723.000 muertes relacionadas con la GC-que se han producido en el año 2012, lo que representa el 6,8% del total de casos de cáncer y el 8,8% del total de muertes relacionadas con el cáncer [1]. Más del 70% de los nuevos casos y muertes se producen en países en desarrollo, con las más altas tasas de incidencia que se informa en el Este de Asia, Europa del Este y América Central y del Sur [2].

El patógeno bacteriano
Helicobacter pylori
es un factor etiológico fundamental para GC (IARC, 1994), sin embargo, los estudios anteriores sugieren que, además de
H. infección y la dieta pylori
factores, la genética del huésped contribuyen a GC [3]. polimorfismos genéticos han surgido en los últimos años como determinantes de la susceptibilidad a la enfermedad y la gravedad, lo que es particularmente cierto en tumores gastrointestinales [4]. Por lo tanto, los polimorfismos en genes implicados en la inmunidad innata y adaptativa podrían desempeñar un papel importante en la patogénesis de la
H. pylori
la infección y el desarrollo de
H. pylori
complicaciones relacionados con la PI incluyendo GC.

receptores de línea germinal codificada conocidos como receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) son parte del sistema inmune innato y son fundamentales para la detección de motivos microbianas invariantes conocido como patógeno patrones moleculares -asociado (PAMPs). PRR se han dividido en cinco subtipos genéticos y funcionales distintos: nucleótido vinculante dominio de oligomerización (NOD) -al igual que los receptores (NLRs), receptores de tipo Toll, receptores de lectina tipo C, ácido retinoico gen inducible (RIG) -I-como receptores y ausente en el melanoma 2 (AIM2) -al igual que los receptores [5] [6].

la familia NLR no sólo reconocer PAMP, sino también patrones moleculares asociados a los daños (apaga) en el citoplasma, que son ligandos endógenos producido después de la lesión de tejidos o la muerte celular [7]. La estructura característica NLRs incluye un dominio central y de oligomerización (NACHT) de unión de nucleótidos que está presente en todos los miembros de la familia de NLR, un repeticiones ricas en leucina C-terminal (LRRs) y un reclutamiento N-terminal de la caspasa (CARD) o pirina (PYD ) de dominio. Basado en el análisis filogenético de los dominios NACHT, se determinó que la familia NLR comprende tres subfamilias: 1) la familia NOD que incluye NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 y CIITA, 2) los NLRPs incluyendo NLRP1-14 (también conocido como NALPs), y 3) la subfamilia IPAF que consiste en IPAF (NLRC4) y NAIP [7]. Inflamasoma NLRP3, inflamasoma más plenamente caracterizado, consiste en la proteína de andamiaje NLRP3, la proteína asociada mota similar a la apoptosis (ASC) y la caspasa-1. NLRP3 interactúa y recluta a la ASC adaptador a través de la interacción PYD-PYD [8]. Esta interacción conduce al reclutamiento de caspasa-1, una cisteína proteasa específica aspartato intracelular, lo que conducirá posteriormente a la maduración y liberación de citocinas proinflamatorias como la IL-1β e IL-18.


MARIDO. pylori
infección, las cuatro primeras barreras físico-químicas son la capa de moco, células epiteliales gástricas, los TLRs y los NLRs. Un número limitado de estudios han evaluado la interacción entre la vía de señalización de NLR y
H. pylori
. Por ejemplo, un estudio inicial por Basak et al. [9] mostró que no sólo
H. pylori
lipopolisacárido (LPS) activa la caspasa-1, pero que esta activación de la caspasa-1 está implicada en LPS inducida por la maduración de IL-1β. Más tarde, Hitzler et al. [10] demostraron que
H. pylori
infección activa la caspasa-1, lo que lleva a la IL-1β /IL-18 y la secreción de procesamiento, tanto en las células dendríticas cultivadas (DC) y
in vivo
. Consistentemente, dos estudios recientes, utilizando líneas de células gástricas humanas, confirmó la mayor expresión de caspasa-1, IL-1β e IL-18 en
H. pylori
células infectadas [11], [12]. Además, un estudio reciente realizado por Kim et al. [13] han demostrado que la secreción de IL-1β por DCs infectadas con
H. pylori
requiere TLR2, NOD2 y inflamasoma NLRP3.

Por lo tanto, los estudios anteriores muestran claramente que, en respuesta a
H. pylori
, inflamasoma dependiente de caspasa-1 de activación es crítico para la generación de citoquinas pro-inflamatorias maduras que son cruciales para las respuestas Th1 asociados con inmunopatología gástrico. Dado que se sabe poco sobre el papel de inflamosomas y otras moléculas que participan en la NLR vía de señalización en respuesta a
H. pylori
infección, y de que los polimorfismos en los genes funcionalmente relevantes de este brazo del sistema inmune tiene el potencial de afectar a la magnitud y dirección de la respuesta del huésped contra la infección, se investigó el papel de la vía de señalización de NLR, incluyendo inflammasome- moléculas relacionadas, en
H. pylori
desarrollo GC -relacionado mediante la evaluación de 51 polimorfismos genéticos en individuos chinos, una conocida población de alto riesgo para la GC, y hacer frente a la expresión de genes de 84 moléculas implicadas en la NLR vías de señalización en una línea celular de monocitos tras la exposición a
H . pylori
.

Materiales y Métodos

El genotipado de polimorfismos involucrados en la declaración del receptor de señalización Camino

Ética NOD-similares.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética humana (HREC) de la Universidad de Nueva Gales del Sur (UNSW) (HREC 08115 y 02144 HREC). escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada individuo reclutado para el estudio.

Los sujetos del estudio.

Los sujetos eran individuos de origen chino que fueron sometidos a endoscopia digestiva alta en el Hospital General de Changi (Singapur) y el Hospital Universitario de Malasia (Kuala Lumpur), entre enero de 2004 y abril de 2007. los pacientes que se sabe están infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana o que habían sido prescritos fármacos no esteroides anti-inflamatorios, agentes anti-microbianos o supresores del ácido en el plazo de dos meses fueron excluidos antes de la contratación.

Ochenta y siete pacientes con diagnóstico reciente de una primaria no cardias GC (Clasificación Internacional de Enfermedades, 9
ª revisión, código 151) en base a la confirmación histológica fueron invitados a participar en el estudio. El grupo de control compuesto por 223 personas con diagnóstico de dispepsia funcional (DF), que se definió como síntomas persistentes o recurrentes (dolor o molestia centrada en el abdomen superior) en ausencia de enfermedad orgánica (incluyendo en la endoscopia superior), de conformidad con Roma II sistema de clasificación [14].


Helicobacter pylori
detección.


H. pylori
anticuerpos IgG en estos individuos chinos fueron determinados utilizando un ligado a enzimas en el local de ensayo inmunoabsorbente [15] y de inmunotransferencia (MPD Helico Blot 2.1, MP Biomedicals, Australia).

Selección de polimorfismos.

bases de datos electrónicas (PubMed, Scopus, Science Direct, Ovid, Biosis Previews, bases de datos Scirus, CINAHL, IMBIOMED, ​​Scielo y LILACS) se realizaron búsquedas hasta febrero de 2013 para los polimorfismos implicados en la ruta de señalización NLR que se asocian con el cáncer, enfermedad infecciosa o eran funcionalmente relevante. Cincuenta y un 6 polimorfismos en los genes, los cuales fueron reportados con una frecuencia & gt; alelo menor. 1% en el Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI) dbSNP, fueron seleccionados para el análisis (Tabla S1 en las Tablas S1)

técnicas de genotipificación.

Para la genotipificación de los 51 polimorfismos seleccionados en la vía de señalización NLR de cada individuo incluidos en el estudio, el ADN genómico se extrajo de periféricos muestras de sangre entera utilizando el QIAamp DNA Blood Mini Kit como se describe por el fabricante (Qiagen; Chadstone, Australia). ADN fue rehidratado en agua estéril y normalizado a 10 ng /l para el genotipado SNP personalizada a través de la aplicación de ionización asistida por matriz de desorción de láser de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas, la Sequenom MassARRAY IPLEX? Ensayo (San Diego, CA , EE.UU.) [16], [17] en el Australian Genome Research Facility Ltd, Santa Lucía, Universidad de Queensland, Australia.

Un polimorfismo que no pudieron ser incluidos en el ensayo de Sequenom IPLEX MassARRAY, conocido como
NLRP3-
42 pb-VNTR, se genotipo mediante PCR estándar. Los cebadores se diseñaron con el análisis de cebador oligo software versión 6.71 (Molecular Biology Insights, Inc; Colorado Springs, EE.UU.). Los experimentos se realizaron utilizando el ciclador térmico 2720 (Applied Biosystems; Foster City, EE.UU.). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y se visualizaron mediante transiluminación UV utilizando el sistema Gel Doc 2000 (Bio-Rad; Hercules, EE.UU.). El primer secuencias y condiciones de ciclos térmicos para el genotipado de este polimorfismo se describen en la Tabla S2 en en las Tablas S1.

cuatro polimorfismos (
CARD8
-rs2043211,
CARD8
-rs6509368 ,
CARD8
-rs12984929 y
NLRP3
-rs10754558) genotipo por MALDI-TOF espectrometría de masas fueron seleccionados al azar para la confirmación de los resultados usando PCR en tiempo real. El primer secuencias y condiciones de ciclado térmico se resumen en la Tabla S2 en las Tablas S1. Como una validación de la metodología implementada para el genotipado de
NLRP3-
42 pb-VNTR, análisis de secuenciación se realizaron en el 10% de las muestras de estudio seleccionadas al azar, en el Centro Ramaciotti, UNSW, Australia.

análisis estadístico.

El Student no pareada
t-test
se utilizó para analizar las características clínicas. El método de conteo directo se utilizó para estimar las frecuencias alélicas y genotípicas. La desviación de Hardy-Weinberg (HWE) se puso a prueba mediante la prueba de chi-cuadrado de bondad de ajuste (χ
2). Determinación de desequilibrio de ligamiento (LD) se basó en una prueba de relación de probabilidad en la que el significado de la relación de probabilidad observada se encuentra mediante el cálculo de la distribución nula de esta relación bajo la hipótesis de equilibrio de ligamiento, usando un procedimiento de permutación [18]. haplotipo inferencia se realizó por medio de la maximización de la expectativa algoritmo (EM) para los datos genotípicos multi-locus [19]. El odds ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) se calcularon mediante la prueba de probabilidad exacta de Fisher (dos colas
p-valores
). Con el fin de corregir los factores de confusión, una regresión logística binaria (LR) ajustado por
H. Se realizó pylori
de estado y de género.
P-valores
& lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo. filtros de calidad para la exclusión de los polimorfismos de los análisis estadísticos incluyeron llamar a tasas inferiores al 95% y la desviación de HWE. Los datos se analizaron por medio de programas de la versión 3.1 Arlequin [20], GraphPad Prism versión 5.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, EE.UU.) y SPSS versión 19.0.0. (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.)

gene Expresión de moléculas implicadas en la señalización del receptor de Pathway

cultivo de células de mamíferos como ratones NOD-

la línea monocítica humana THP celular de leucemia-1 (código: TIB-202). (American Type Culture Collection; Manassas, EE.UU.), fue cultivada en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero inactivado por calor fetal bovino (FBS) (Invitrogen; Mulgrave, Australia), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen), 2,500 mg /bicarbonato de sodio L (Invitrogen ) y solución de 100 mg /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). Las células se mantuvieron en 25 cm
2 frascos de cultivo de tejidos (Greiner Bio-On-; Frickenhausen, Alemania).. A 37 ° C con 5% de CO
2

Cultivo bacteriano

El
H pylori cepa
GC026 (
cagA +
,
cagE
+,
CAGL
+,
cagT
+ ,
vacA s1
m1 +,
babA
+,
oipA
+,
Dupa
+ y
Saba
+) se aisló de un paciente GC en el hospital de la Universidad de Malasia, Kuala Lumpur [21], [22]. El
H. pylori cepa 26695
(
cagA
+ y
vacA
s1m1 +) fue aislada de un paciente con gastritis [23] (código ATCC 700392). Tanto
H. pylori
cepas se cultivaron durante dos días en placas de agar sangre de caballo (Blood Agar Base No.2 suplementadas con 6% de sangre de caballo desfibrinada estéril (Oxoid, Heidelberg West, Vic., Australia) a 37 ° C en un recipiente anaeróbico que contiene un kit de generación de gas (Oxoid) para proporcionar una atmósfera microaeróbica del 6% de O
2, 10% de CO
2 y el 84% de N
2.

ensayo de infección.

células THP-1 se sembraron en una placa de cultivo de 6 pocillos a una concentración de 5 × 10
5 células /ml y posteriormente se diferenciaron en macrófagos con acetato de forbol myrastate (Sigma-Aldrich) durante 72 horas [24]. Antes de la infección bacteriana, las células de mamífero se incubaron en medio libre de antibiótico. la
H. pylori
cepas GC026 y 26.695 después se añadieron al medio a una multiplicidad de infección de 1, y se incubaron durante 6 horas a 37 ° C y 5% de CO
2. La concentración bacteriana añadido se determinan en base a una curva estándar y la densidad óptica (OD) lecturas a 595 nm usando un Bio-Rad modelo de lector de microplacas 550 (Bio-Rad). La concentración real añadido fue confirmado contando las unidades formadoras de colonias (CFU) cultivados en placas de agar sangre de caballo después de la dilución en serie de la suspensión bacteriana.

de extracción de ARN, preparación de ADNc y PCR arrays.

Después infección, no desafiado y
H. Se han usado pylori
-challenged células THP-1 para el aislamiento de mRNA utilizando el Qiagen RNeasy Mini Kit como se describe por el fabricante (Qiagen). Para el análisis de la expresión génica de 84 moléculas implicadas en la vía de señalización NLR, cDNA se sintetizó a partir de 0,8 g de ARN total usando la RT
2 Primera Strand cDNA Kit (Qiagen) y además analizados utilizando el inflamasoma humano RT
2 gama de perfiles de PCR (HAP-097R) (Qiagen) según lo recomendado por el fabricante. Perfiles de expresión génica se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes de
H. pylori
GC026 infectados,
H. pylori
26695-infectada y muestras (de control) no infectadas correspondiente. Los experimentos se realizaron empleando el ciclador Rotor-Gene Q (Corbett Ciencias de la Vida; Doncaster, Australia).

Para el análisis de datos de expresión génica, el método basado en Ct ΔΔ de cuantificación relativa fue implementado utilizando la RT basado en la Web
2 matriz de perfiles PCR análisis de datos versión 3.5 (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). cambios al menos de dos veces (al menos 2, ≤0.5) y
P-valores
. & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo

SDS-PAGE y Western Blot

THP -1 células fueron sembradas, diferenciada e infectadas a una MOI de 1, como se describe anteriormente. Las proteínas fueron extraídas con tampón RIPA, se separó el 12% de dodecil sulfato de geles de electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio, y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno metanol tratadas utilizando el sistema de transferencia de células Trans-Blot (Bio-Rad). Las membranas se immunolabeled con anticuerpos de conejo anti-humanos policlonales contra NLRX1 (1:200) o anticuerpos monoclonales anti-humano de ratón contra β-actina (1:1000) (Santa Cruz). Cabra anticuerpos anti-IgG de ratón acoplados a HRP anti-conejo y (1:2000; Bio-Rad) se utilizaron como anticuerpos secundarios, respectivamente. Membranas se probaron de acuerdo con el protocolo de Pierce ECL Western Blot sustrato (Thermo Scientific; Scoresby, Australia).

Resultados

Características clínicas

Las características clínicas de los sujetos de estudio incluyendo el género,
H. pylori
estado de la infección y la mediana de edad se muestran en la Tabla S3 en las Tablas S1. Se encontró género masculino a ser más predominante en los pacientes que en los controles de GC FD, que muestra una asociación positiva con el desarrollo de GC en esta población de origen chino (OR: 2,15 IC del 95%: 1,29 a 3,58,
P
-valor: 0,0036).
H. Se encontró pylori
infección a estar presente en 68.7% de los individuos en este estudio (73/87 pacientes GC y 140/223 FD controles). Comparación de la prevalencia de
H. pylori
infección en pacientes y controles GC FD mostró que
H. pylori
infección fue un factor de riesgo para el desarrollo de GC (OR: 2,38 IC del 95%: 1,41 a 3,99,
P-valor
: & lt; 0,0001). A pesar de que los sujetos en este estudio fueron agrupados según los grupos de edad de 5 años, la edad media de los pacientes GC (65,3 años) fue significativamente mayor que la de los controles alimenticios y bebidas (54,3 años) (
P-valor
: & lt ;. 0,0001)

los polimorfismos en genes implicados en la NOD-like receptor de señalización Camino están asociados con el cáncer gástrico en individuos de origen chino

Cincuenta y un polimorfismos en genes implicados en la vía de señalización eran NLR genotipo en 310 individuos de origen chino (GC 87 casos y 223 controles) FD. El tipo de referencia de todos los polimorfismos seleccionados era 97 a 100% en este estudio. Se encontró que todos los polimorfismos en la vía de señalización NLR estar en HWE en el grupo de control que muestra no significativa χ
2 valores a excepción de
CARD8
-rs12984929 (χ
2: 35.98),
CARD8-
rs4802445 (χ
2: 5,87) y
CARD8-
rs6509368 (χ
2: 5,43). Veintiún polimorfismos en
NLRP3 gratis (n = 5),
NLRP12 gratis (n = 3),
NLRX1 gratis (n = 3),
ASC
(n = 4) y
CASP1 gratis (n = 6) fueron encontrados para ser no-polimórfico en esta población de origen chino (Tabla S1 en en las Tablas S1).
frecuencias
Alelo y genotipo como así como se muestran RUP y IC del 95% para los restantes 27 polimorfismos en la Tabla 1 y la Tabla S4 en las Tablas S1. El
CARD8
-rs11672725 genotipo TT mostró una fuerte asociación con la GC en el análisis estadístico bivariante (OR: 4,80 IC del 95%: 1,39 a 16,58). Además de
CARD8
-rs11672725, otros cuatro polimorfismos mostraron resultados dudosos en el análisis bivariante (
NLRP3
-rs10754558,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs199475867 y
NLRX1
-rs10790286) (Tabla 1). Otros análisis estadísticos multivariados, ajustando por
H. pylori
la infección y el sexo masculino, mostró que el
CARD8
-rs11672725 genotipo TT seguía siendo un factor de riesgo para la GC en esta población de origen chino (Tabla 2).

análisis basados ​​en haplotipos son un enfoque poderoso para diseccionar la arquitectura de las enfermedades complejas. En el estudio actual, el algoritmo EM identificó 25 haplotipos con una frecuencia & gt; 0,01 en los casos GC (cuadro S5 en las Tablas S1). Usando el principal haplotipo en el grupo control como el haplotipo de referencia, dos
CARD8-NLRP12
(Hap1 y Hap8), uno
NLRP3
(Hap3) y tres
NLRX1-CASP1
(Hap21, 23 y 24) se encontraron haplotipos a aumentar el riesgo de GC en esta población de origen chino. Curiosamente, Hap1 alberga el
CARD8
-rs11672725 alelo T y Hap21 y Hap23 puerto de la
NLRX1
-rs10790286 alelo C, lo que demuestra la consistencia con los resultados obtenidos a partir del alelo y genotipo análisis.

los polimorfismos en genes implicados en la NOD-like receptor de señalización Camino están asociados con
Helicobacter Pylori
la infección en individuos de origen chino

Teniendo en cuenta que
H. pylori
es conocido por ser un importante factor de riesgo asociado con GC, se realizaron análisis adicionales para evaluar la asociación entre los polimorfismos genéticos implicados en la ruta de señalización de NLR y
H. pylori
infección. Curiosamente, nuestro estudio de casos y controles de origen chino mostró que
NLRX1
-rs10790286,
NLRP12
-rs2866112,
NLRP12
-rs4419163 y
ASC
-rs8056505 se asociaron con un riesgo significativamente mayor de
H. pylori
infección en estos individuos (Tabla S6 en las Tablas S1). El análisis estadístico multivariado confirmó que
NLRP12
-rs2866112 se asoció con un mayor riesgo de
H. pylori
en individuos chinos (OR: 2,13 IC del 95%: 1,22 a 3,71)

Conjunto Efecto de
Helicobacter Pylori
Infección y polimorfismos genéticos aumenta notablemente el riesgo de cáncer gástrico en. los individuos étnicas chinas

se realizaron otros análisis para evaluar no sólo la presencia o ausencia de los polimorfismos seleccionados sino también
H. pylori
estado en relación con el riesgo de GC, en un intento de determinar la existencia de interacción biológica en forma de sinergismo o antagonismo. Sorprendentemente, los individuos que albergan diez de los polimorfismos seleccionados (
CARD8
-rs10405717,
NLRP3
-rs12079994,
NLRP3
-rs3806265,
NLRP3
-rs4612666,
NLRP12
-rs2866112,
NLRP12
-rs4419163,
NLRX1
-rs10790286,
CASP1
-rs2282659,
CASP1
-rs530537 y
CASP1
-rs61751523) e infectadas con
H. pylori
se observaron a ser como máximo riesgo de GC, la mayoría de estos RUP en el intervalo 4,0 a 5,0 (Tabla 3). Por el contrario, en ausencia de
H. pylori
infección,
CARD8
-rs2043211 disminuyó significativamente el riesgo de CG (OR: 0,19; IC del 95%: 0,06-0,63).


Helicobacter Pylori
influye en la expresión de varias moléculas que participan en el NOD-like receptor de señalización Camino

Para caracterizar mejor el efecto de
H. pylori
de moléculas implicadas en la vía de señalización de NLR, se evaluó la expresión de 84 genes que codifican NLRs, otros componentes inflamosoma, reguladores negativos, las citoquinas pro-inflamatorias, las caspasas proinflamatorias y moléculas implicadas en la señalización aguas abajo, en células THP-1 macrófagos -derivado tras la exposición a dos
H diferente. pylori
cepas (GC026 y 26695). En
H. pylori
células THP1 GC026-desafió, 49 genes se expresaron diferencialmente en comparación con el grupo de control (Tabla S7 en las Tablas S1 y Figura S1 en las figuras S1). De éstos, estadísticamente significativo sobre regulación y baja regulación de al menos dos veces se encontró en 17 y 28 genes, respectivamente (Tablas 4 y 5). Treinta y cinco genes fueron expresados ​​diferencialmente entre el grupo control y el grupo expuesto a
H. pylori
26695 (Tabla S7 en las Tablas S1 y S2 en las Figuras Figura S1). De éstos, estadísticamente significativo sobre regulación y baja regulación de por lo menos dos veces se encontró en 5 y 23 genes, respectivamente (Tablas 4 y 5).


Helicobacter pylori
cepas asociadas con el cáncer gástrico y gastritis dar lugar a diferentes niveles de expresión de citocinas y quimiocinas

Dado que la inflamación es un sello distintivo de la carcinogénesis gástrica, además se analizó la expresión de citocinas y quimiocinas proinflamatorias tras la exposición a dos
H. pylori
cepas. La expresión de nueve genes que codifican citoquinas pro-inflamatorias (
IFNB1
,
IL1B
,
IL12B
,
IL6
,
IL33
y
TNF
) y quimiocinas (
CXCL1
,
CXCL2, CCL5
) fueron significativamente hasta reguladas en las células THP-1 estimuladas con ambos
H. pylori
GC026 26695 y cepas (Tabla 4). Por otra parte, una respuesta inmunitaria intensa (
CXCL1
,
CXCL2
,
CCL5
,
IL6
,
IL12B
,
TNF
y
IFNB1
) se inició en contra de
H. pylori
GC026 (Figura 1A). Curiosamente, una serie de genes que codifican quimioquinas (
CCL2
y
CCL7
) y citoquinas (
IL18
,
TNFSF11
y
CD40LG
) se redujeron regulado en
H. pylori
-challenged células THP-1 (Tabla 5).

A) La expresión de genes de citocinas y quimiocinas en
H. pylori
-challenged células THP-1, B) La expresión de genes de los receptores NOD-como en
H. pylori
-challenged células THP-1, C)
NFKB1
expresión en
H. pylori
células THP-1 y D) -challenged
PTGS2
y
BIRC3
expresión en
H. pylori
células -challenged THP-1. Pliegue de cambio (2∧ (-Delta Delta Ct)) es la expresión génica normalizada (2∧ (-Delta Ct)) en células THP-1 estimuladas con
H. pylori gratis (GC026 y 26695) dividieron la expresión génica normalizada (2∧ (-Delta Ct)) en su respectivo grupo de control. Fold-regulación representa los resultados del cambio plegable de una manera significativa biológicamente. Pliegue de cambio los valores superiores a uno indican la regulación, y el pliegue-regulación es igual al factor de cambio. los valores de cambio de tapa inferior a la unidad indican regulación a la baja, y el pliegue-regulación es el inverso negativo del factor de cambio. Plegable diferencia en comparación con el grupo de control que muestra a *
P
-valor & lt; 0,05 y ** un
P
-valor & lt; 0,01.
P
-valores se obtuvieron con la prueba t de Student.


Infección por Helicobacter pylori
Resultados en Sobre regulación de
NFKB1
con Marcado simultánea baja regulación de
NLRP12
y
NLRX1

Trece genes que codifican NLRs fueron evaluados en este estudio, incluyendo miembros de la subfamilia de IPAF (NAIP, NLRC4), NLRPs ( NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) y asiente (NOD2, NLRC5, NLRX1 y CIITA) (Figura 1B). La expresión de cinco genes que codifican NLRs se reguló de manera significativa en células expuestas con el H. pylori (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 y NLRX1) (Tabla 5). De éstos, NLRP12 (pliegue regulación: 0,03, p-valor: 0.016298) y NLRX1 (sofá regulación: 0,02, valor p: 0,01762) fueron significativamente las reguladas en células expuestas-GC026 H. pylori. Como técnica de validación, más ensayos de Western blot investigación de la expresión NLRX1, se llevaron a cabo. Por ello, la disminución de los niveles NLRX1 se encuentran en las células THP-1 estimuladas con ambos H. pylori y GC026 26695 (Apoyo a la Información S3).

Dado que NF-kB está regulada negativamente por NLRP12 y NLRX1, se compararon más la expresión de
NFKB1
y
RELA
entre los
H. pylori
GC026- y células 26695-desafiados. Sorprendentemente, a pesar de
RELA
mostró disminución de los niveles en las células THP-1 expuestos a ambos
H. pylori
cepas (sofá regulación: 0,49,
p-valor
: 0,044673 y doble regulación: 0,26,
p-valor
:. 0,131017 por
H pylori
GC026 y 26695, respectivamente), estadísticamente significativa sobre regulación de
NFKB1
solo fue observado en
H. pylori
células GC026-desafiado (sofá regulación: 2,50,
p-valor
: 0,006825). (Figura 1C)


Helicobacter Pylori
aumenta la expresión de
PTGS2
y
BIRC3

la expresión de otras moléculas involucradas no sólo en el NLR vía de señalización, sino también en la carcinogénesis también fue analizada mediante la comparación de células THP-1 respuestas tanto a
H. pylori
cepas. Curiosamente,
PTGS2
fue significativamente hasta reguladas en las células THP-1 tras la exposición a ambos
H. pylori
cepas,
H. pylori
células GC026-desafiado (pliegan regulación: 54.03,
p-valor
: 0,0247) que muestra significativamente más altos niveles de expresión en comparación con
H. pylori
células 26695-desafió (sofá regulación: 19.56,
p-valor
: 0.016089) (Figura 1d). Además, un segundo gen implicado en la carcinogénesis,
BIRC3
, era exclusivamente regulado en
H. pylori
células GC026-desafiado (sofá regulación: 12.28,
p-valor
: 0,001638). (Figura 1D)

Discusión

GC ahora se considera un multifactorial proceso, en el que factores bacterianos, genética ambientales y de acogida están involucrados en diferentes etapas de la fisiopatología del cáncer. En la actualidad, está bien establecido que el cáncer surge en el tejido inflamado crónicamente, y esto es particularmente notable en el tracto gastrointestinal [4]. Como la inflamación crónica de la mucosa gástrica es una consecuencia de
H. pylori
la infección por esta bacteria y está dirigido inicialmente por PRRS, se investigó el papel de las moléculas que participan en la vía de señalización de la NLR en
H. pylori
infección y GC relacionada.

Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de pruebas de que los polimorfismos implicados en la ruta de señalización NLR se asocian con un mayor riesgo de CG en una población humana. pylori
infección. Tabla S1. Tabla S2. Tabla S3. Tabla S4. Tabla S5.