Extracto
Producción específica de las metaloproteinasas de matriz (MMP) para la degradación de la matriz extracelular es un paso vital en la metástasis del cáncer. Se investigaron los efectos de las oncoproteínas HPV16 (16E6, 16E6 * I y 16E7), ya sea de forma individual o combinada, en la transcripción de 7
MMP
s implicado en la invasividad del cáncer de cuello uterino. Los niveles de 7
MMP
informaron a aumentar con el cáncer de cuello uterino se determinaron en C33A que expresan establemente diferentes oncoproteínas HPV16 mediante RT-PCR cuantitativa y se comparan con la capacidad de invasión de las líneas celulares utilizando
in vitro invasión
y la herida ensayos de curación. Se detectó la sobreexpresión de
MMP-2
y
MT1-MMP Hoteles en HPV16E6E7 células que se correlacionaban con un aumento de la invasión de células que expresan. La combinación de las oncoproteínas del VPH siempre mostró mayores efectos que su forma individual. La inhibición de la invasión de células utilizando un inhibidor específico de MMP-2, OA-Hy, y el anticuerpo anti-MT1-MMP confirmó que la invasión de estas células era dependiente tanto de la expresión de MMP-2 y MMP-MT1. El agotamiento de HPV16E6E7 por experimentos knock-down mediadas por shRNA resultó en una disminución de MMP-2 y MMP-MT1 niveles de expresión, así como la capacidad de invasión reducido que sugiere fuertemente efectos específicos de oncoproteínas de VPH en ambos MMPs y en la invasión de células. Estudio inmunohistoquímico en los cánceres de cuello uterino invasivo confirmó el aumento de
in vivo
expresión de estos dos MMPs en HPV16 células infectadas. Además, los posibles sitios requeridos por HPV16E6E7 en el
MMP-2
y
MT1-MMP
promotores fueron investigados y PEA3 (a -552 /-540 para
MMP-2
, -303 para
MT1-MMP) y SP1 (a -91 para
MMP-2, España -102
MT1-MMP) sitios de unión, se mostró a será esencial para mediar la actividad de transactivación. En conclusión, nuestro estudio demostró que HPV16E6 y E7 oncoproteínas cooperan en la promoción de la invasividad del cáncer de cuello de útero upregulating específicamente
MMP-2
y
MT1-MMP
la transcripción de una manera similar.
Visto: Kaewprag J, Umnajvijit W, J Ngamkham, Ponglikitmongkol M (2013) HPV16 oncoproteínas Promover la invasividad del cáncer cervical upregulating específicos metaloproteinasas de la matriz. PLoS ONE 8 (8): e71611. doi: 10.1371 /journal.pone.0071611
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 28 Febrero, 2013; Aceptado: 1 de julio de 2013; Publicado: 13 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Kaewprag et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación trabajo fue apoyado por la Facultad de Ciencias y el Programa de Becarios médicas de la Universidad de Mahidol, Tailandia y el Consejo Nacional de Investigación de Tailandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la infección persistente por el virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH) es la principal causa de cáncer de cuello uterino, que es el segundo cáncer más común en las mujeres de Tailandia [1]. HPV16 se detecta más a menudo y representa más de 50% de los casos de cáncer de cuello uterino en todo el mundo [2]. Carcinogenesis debido a HPV16 se atribuye a las oncoproteínas virales, E6 y E7, a través de sus interacciones con las proteínas del huésped celular implicados en la regulación del ciclo celular que resulta en la transformación celular y la inmortalización [3]. HPV16E7 (16E7) se une a la proteína pRb ciclo celular, que se somete posteriormente a la degradación a través de un proceso de proteasoma mediada [4], mientras que HPV16E6 (16E6) interactúa con e induce la degradación mediada por proteasoma de p53 [5]. Ambos oncoproteínas E6 y E7 también son capaces de modular la transcripción de varios genes del huésped. Los ejemplos incluyen la regulación al alza 16E6 dependiente de la subunidad catalítica de la telomerasa transcriptasa inversa humana (
hTERT
) y factor de crecimiento transformante β (
TGF
genes a través de sitios específicos de unión Sp1 [6], [7 ] y aumento de la expresión de DEK proto-oncogen, que codifica un inhibidor de la senescencia, por E7 través de una vía dependiente de la proteína de la familia pRb [8]. Además de producir de longitud completa E6 (16E6F), HPV16 también genera una forma truncada de E6 (16E6 * I), que promueve la degradación de la proteína Dlg [9] y la transactivación del gen aldo-ceto reductasa [10].
el papel de las proteínas del virus de la invasividad tumoral se observó por primera vez en un estudio que demuestra en la línea celular de hepatoma capacidad de la proteína del virus de la hepatitis B (HBV) X para inducir la expresión de metaloproteinasas de la matriz MMP-2 y MT1-MMP (MMP-14), a través de un mecanismo de 2 dependiente de Cox [11]. MMPs pertenecen a una familia de proteasas de zinc responsables de degradación de la matriz extracelular que se requiere para la migración y metástasis de las células del cáncer [12]. Estudios recientes han indicado una asociación entre la presencia de MMP y el VPH en el cáncer cervical [13], [14]. Elevados niveles de expresión de un número de MMPs (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MT1-MMP y MMP -15) han sido reportados en carcinomas de cuello uterino invasivo en comparación con los tejidos normales [15] - [17]. Sin embargo, una correlación entre las oncoproteínas del VPH y tipos de MMP sigue siendo controvertido. Smola-Hess
et al
. demostrado que los queratinocitos que se transformaron por HPV16 y HPV8 expresión inducida de MT1-MMP [14]. En un estudio más reciente, la expresión elevada HPV16E7 se demostró que asociar con un aumento de la pro-MMP-9 actividad en cultivo organotípicos de queratinocitos sin embargo, HPV16E6 /E7 no tuvo efecto sobre la MMP-2, -9 y MT1-MMP niveles en queratinocitos de prepucio humanos [18]. Aunque la sobreexpresión de varios tipos de MMP se ha observado en tejidos de cáncer de cuello uterino, sólo el aumento de los niveles de MMP-2 y MMP-9 fueron demostrado que se correlaciona con mal pronóstico en los pacientes [16]. Además, una relación entre
MMP-2
los niveles de ARNm y la invasividad del cáncer cervical se ha demostrado [19]. La activación de MMP-2 y MMP-MT1 fue encontrado en carcinomas cervicales escamosas [16] y la generación de la forma activa de MMP-2 se demostró que requieren la activación por MT1-MMP [20]. Este requisito es apoyada por la demostración de que MT1-MMP es capaz de escindir MMP-2 para formar una MMP-2 pro-/MT1-MMP complejo /TIMP-2, lo que aumenta la concentración de activo de MMP-2 en el borde delantero de invasores células del cáncer [21]. Aunque un número de MMPs tiene actividad superposición en un grupo similar de sustratos, la regulación de sus niveles de expresión parece estar regulada de manera independiente.
MMP-2
se expresa constitutivamente en muchos tipos de células, mientras que las citoquinas regulan
MMP-9
la transcripción [22] y la regulación de los
MT1-MMP gratis (constitutiva o inducida ) sigue siendo poco clara [14].
En este estudio, hemos analizado la capacidad de las oncoproteínas de HPV16 de alto riesgo y HPV18 que regulamos transcripcionalmente 7 tipos de
MMP
s
(MMP 1, -2, -7, -9, -10, -11 y
MT1-MMP)
y correlacionar la expresión de MMP con la invasión celular en líneas celulares de cáncer de cuello uterino. Además, estos resultados se compararon con los obtenidos a partir de biopsias de cáncer cervical etapa invasiva. Especulamos que las oncoproteínas del VPH de alto riesgo upregulated tipos específicos de MMP en células de cáncer cervical en el nivel transcripcional.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
muestras de tejido humano usados en este estudio se obtuvieron con el consentimiento informado por escrito de los pacientes o sus familiares. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto Nacional del Cáncer, Tailandia (CE 236/2011).
Construcciones de plásmidos y líneas celulares transfectadas de forma estable
HeLa, SiHa, Caski (amablemente proporcionados por P . Chambon, IGBMC, Francia) y C33A (ATCC: HTB-31) líneas celulares de cáncer de cuello uterino y una línea de células humanas embrionarias de riñón 293T (amablemente proporcionado por P. Angeletti, Universidad de Nebraska Lincoln, EE.UU.) se mantuvieron a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de CO
2 en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de cóctel de penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). HPV16 oncogén ADNc, a saber, 16E6 (que contiene tanto 16E6 * I y 16E6F), 16E6 * I, 16E7, 16E6E7 (tanto 16E6 y 16E7) y 16E6 * IE7 (tanto 16E6 * I y 16E7) se prepararon a partir de células SiHa y ADNc de HPV18E6E7 (tanto 18E6 y 18E7) se prepararon a partir de células HeLa. Todos los ADNc se insertaron en el vector pcDNA3, y se generaron las células C33A expresan de manera estable proteínas del VPH y se mantuvieron como se describe anteriormente [10]. Dos construcciones de horquilla corta (sh) ARN (shE6A y shE6B) que contienen oligonucleótidos complementarios diseñados para silenciar HPV16E6 ARNm [23] y no la orientación de control negativo shRNA (shCtrl) se clonaron en pSUPER.retro.puro (OligoEngine). construcciones del promotor se generaron mediante la amplificación de secuencias de ADN -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 y -211 /+ 40 del promotor
MMP-2 y -1277 /+ 187, -425 /+ 187 y -151 /+ 187 de
MT1-MMP
promotor de células C33A y se inserta en el plásmido pGL3-Basic (Promega). Los siguientes cebadores; -1721 /+ 40
MMP-2
cebador directo 5 'GAGTGCTCGAGGATCAGGCTGAAGGGCCTGG 3', -1001 /+ 40
MMP-2
el cebador 5 'GAGTGCTCGAGGAATTCGTGGAACTGAGGG 3', -211 /+ 40 MMP -2 cebador directo 5 'GAGTGCTCGAGCGAGAGAGGCAAGTGGGG 3',
MMP-2
cebador inverso 5 'CCTGAAAGCTTCTGGATGCAGCGGAAACAA 3', -1277 /+ 187
MT1-MMP
el cebador 5 'CACCTCGAGGGAGGCTCCACAGGACCTGAAA 3', - 425/187 +
MT1-MMP
cebador directo 5 'CCACTCGAGTCCCACACTCTGAGCTCCTCGTT 3', -151 /+ 187
MT1-MMP
cebador directo 5 'TTGCTCGAGGGCTAAAACAACCACGTCCCCA 3' y
MT1-MMP
cebador inverso 5 'CCGGGAAGCTTGGGCACTGTGGGCTCCGC 3'.
Transcripción inversa (RT)-PCR y PCR cuantitativa (qPCR)
ARN total fue extraído de células con el kit de Illustra ™ Mini RNAspin (GE Healthcare) y se usó como molde para la síntesis de ADNc empleando SuperScript®III RNasa H
Kit -RT (Invitrogen). qPCR se realizó utilizando el sistema de Stratagene Mx3000P qPCR (Agilent Technologies) junto con RBC ThermOne® en tiempo real de premezcla (SYBR Green). condiciones termociclado tanto para qPCR y RT-PCR fueron las siguientes: 10 min a 95 ° C; (40 ciclos de RT-PCR), 30 segundos a 95 ° C, 30 seg a 60 ° C y 30 seg de 72 ° C. Determinación de la hipoxantina-guanina (
HPRT
) la expresión de genes de limpieza se incluyó en cada experimento para corregir las variaciones en las concentraciones de la plantilla. Las cantidades de los amplificados de PCR se analizaron mediante Gel Doc 2000 y Cantidad Un paquete de software (Bio-Rad). Los conjuntos de cebadores utilizados para la amplificación de HPV16E6 /E7,
MMP
,
TIMP-2
y el control interno
HPRT
ADNc se han descrito anteriormente [10], [24] , [25]. Expresión relativa se presentan como media ± E.E.M de tres experimentos independientes llevó a cabo por duplicado.
Gelatina Zymography
actividad gelatinasa de MMP-2 se evaluó mediante zimografía de gelatina como se describe anteriormente [26]. C33A expresan de forma estable las diferentes oncoproteínas se incubaron en medio libre de suero durante 48 h antes del análisis. Después de ser concentrada utilizando un Ultra 0,5-dispositivo Amicon® centrífuga de filtro (Millipore), cantidades iguales de proteína total en el medio gastado de cada línea celular se mezcló con no reductor tampón de muestra (2% SDS, 10% de glicerol, Tris 62,5 mM -HCl pH 6,8 y 0,01% bromophenolblue) y se ejecutan en un gel de poliacrilamida 7,5% que contenía 1 mg /ml de gelatina (Sigma). Después de la electroforesis, los geles se renaturalizaron por lavado con 2,5% Triton X-100 dos veces por 30 min. Las bandas claras de sustrato hidrolizado se desarrollaron por incubación en tampón de desarrollo (50 mM Tris-HCl pH 8,0, mM CaCl 10
2, 1 mM ZnCl
2, 0,02% NaN
3 y 1% de Triton X -100) a 37 ° C durante 18 h y se tiñeron con 0,025% (w /v) de Coomassie R250 azul para 1 h. La actividad gelatinolítica de las bandas de MMP se cuantificó por análisis densitométrico (Cantidad Un programa, sistema Gel Doc 2000, Bio-Rad, EE.UU.) y presentada como veces de incremento del total MMP-2 (pro-MMP-2 (72 kD) y activa MMP-2 (68 kDa)) en comparación con las células de control pcDNA3 a las 48 h.
in vitro
invasión Ensayo
in vitro
ensayos de invasión se llevaron a cabo en una cámara Transwell recubierta en la cámara superior con 30 g de Matrigel® (BD Bioscience). Las células (2 × 10
5) en medio libre de suero se sembraron en la cámara superior y DMEM que contiene 10% de FBS se añadió a la cámara inferior. Para los ensayos de inhibición, las células (10
4 para SiHa y 5 × 10
4 para 16E6E7) fueron tratados con concentraciones variables (0, 2, 5, 10 o 20 M) del inhibidor de MMP-2,
cis -9-
Octadecenoyl-N-hidroxilamida; OA-Hy (Calbiochem), o con 20 mg de anticuerpo anti-MT1-MMP /ml (ab78738, Abcam) en la cámara superior con 1% de FBS para SiHa y 2% de FBS para 16E6E7 en la cámara inferior. Después de la incubación durante 24 h (o 12 h en los ensayos de inhibición) para 16E6E7 y 12 h (o 7 h en los ensayos de inhibición) para SiHa, las células en la cámara inferior se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. la actividad de la invasión se determinó contando el número de células invadidas en cinco campos aleatorios y los resultados se presentan como media ± SEM de células teñidas con respecto a los controles, el vehículo o no director plásmido shRNA o las células no tratadas.
Herida Ensayo de curación
Las células fueron cultivadas hasta la confluencia y una herida artificial se ha generado utilizando puntas de pipeta P-200. DMEM que contiene 100 g de Matrigel® (BD Bioscience), se añadió a las células y se dejó polimerizar durante 15 min. El número de células que migran en la región de rayado se contaron a las 0 y 48 h después de la incubación y se informaron como porcentaje de células en la región de rayado en comparación con las células control.
Luciferase Ensayo de actividad
células C33A expresar HPV16E6E7 fueron transfectadas transitoriamente con constructos de luciferasa pGL3-Basic vector que contiene
MMP-2 y
MT1-MMP
promotores como se describe anteriormente. Las células transfectadas se lisaron y se ensayaron para la actividad de luciferasa como se informó anteriormente [10].
Análisis Western Blot
C33A células que expresan oncoproteínas HPV16 fueron lisadas en Lisis-M del reactivo, libre de EDTA, con completa de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Las proteínas se separaron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo con leche en polvo 10% no grasa en PBST, las membranas se incubaron con el ratón anti-p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology en 1:5,000), ratón anti-MT1-MMP (ab78738, Abcam en 1:1,500 ), ratón anti-TIMP-2 (ab1828, Abcam en 1:1,000), o el ratón anti-GAPDH (sc-166 574, Santa Cruz Biotechnology en 1:2,000) anticuerpos a 4 ° C durante la noche seguido por incubación con un HRP secundaria oveja conjugado anti-IgG de ratón (GE Healthcare) (1:3,000) durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se visualizaron usando el sistema ECL Pierce (Thermo Scientific), con GAPDH como control de carga. Los niveles de proteína se cuantificaron utilizando densitometría (Uno de los programas, sistema Gel Doc 2000 Cantidad, Bio-Rad) y los resultados se presentan como el incremento de plegado de la proteína (tanto formas pro y maduros) en comparación con el control del vehículo después de la normalización contra GAPDH.
la inmunohistoquímica fluorescente
Todo investigación clínica se ha llevado a cabo de acuerdo con la declaración de Helsinki y la buena práctica clínica. secciones de tejidos embebidos en parafina de 26 carcinomas invasivos de cuello uterino, tres neoplasia intraepitelial cervical (uno cada uno de CIN 1, CIN 2 y CIN 3), y una adenomiosis se obtuvieron del Instituto Nacional del Cáncer (NCI), Tailandia. Todos los tejidos fueron analizados por patólogos del NCI, y de manera anónima antes de ser sometido al estudio. Los antígenos fueron recuperados por microondas las muestras en tampón de Tris-EDTA (10 mM de Tris base de pH 9,0, EDTA 1 mM, 0,05% de Triton X-100) durante 5 min y la actividad peroxidasa endógena fue inhibida por el tratamiento con 3% de H
2O
2 durante 10 minutos. inmunohistoquímica fluorescente se realizó mediante la incubación de 4 ° C durante la noche con anticuerpos de ratón primario anti-MMP-2 y anti-MT1-MMP monoclonales (42-5D11 y 114-6G6 respectivamente; Chemicon) a una dilución 1:100 seguido de incubación con Alexa secundaria anticuerpo de cabra Fluro 647 marcado con anti-IgG de ratón (dilución 1:400; Invitrogen). Hoechst (dilución 1:1,000; Invitrogen) 33 258 se utilizó para la tinción nuclear. Las secciones fueron montadas con Vectashield® medio anti-fade (Vector Laboratories) y las señales fluorescentes se midieron utilizando un microscopio confocal Olympus FV1000 equipado con el software ImageJ. MMP-2 y MT1-MMP expresión fue evaluado como positivo o negativo después de restar con los controles de referencia sin tratamiento con el anticuerpo primario que da el número de células teñidas de ≥1% o 0%, respectivamente.
Resultados
Efectos de VPH y el VPH oncoproteínas en
MMP
Expresión y la invasión capacidad
invasión capacidad de las líneas celulares de cáncer de cuello uterino que albergan genoma del VPH (SiHa con VPH16, VPH16 con Caski y HeLa con HPV18) se compararon con células C33A y 293T VPH-negativas. Todas las líneas de células positivas para el VPH muestran claramente una capacidad de invadir, mientras que la invasividad de las líneas de células VPH negativo fue mínima (Fig. 1A). capacidad invasión Superior se observó con SiHa (5.000 células) y HeLa (11.000 células) en comparación con las células Caski (2.500 células) (Fig. 1A). Los niveles de expresión mide usando qPCR del 7
MMP
s (
MMP-1, -2, -7, -9, -10, -11 y
MT1-MMP) Hoteles en estas cinco líneas celulares mostraron una correlación entre la presencia de VPH y un aumento de
MMP
transcripciones única de
MMP-2
,
-7
y
MT1-MMP gratis (fig. 1B). La regulación positiva de
MMP-2
expresión era altamente detectarse tanto con HPV 16 y las células HPV18-positivas en comparación con las células VPH-negativas, con la mayor actividad en las células HeLa HPV18-positivas.
MMP-7
y
MT1-MMP
los niveles de transcripción fueron significativamente superiores en las células SiHa y Caski HPV16-positivas, pero sólo ligeramente elevados en células HeLa (fig. 1B). Sin embargo, no hubo elevación de
MMP-10
y
-11
transcripciones en cualquier célula VPH positivas (fig. 1B). Estos resultados indican que la expresión de
MMP-2
,
-7
y
MT1-MMP ¿Cuáles son más probables de ocurrir en las células que albergan el VPH, particularmente HPV16.
(a) la cuantificación de la invasión mediante la migración a través de filtros recubiertos con Matrigel para el VPH positivo (SiHa, Caski y HeLa) y negativo (C33A y 293T) células que presentan como el número de células invasoras. (B) Expresión relativa de
MMP-1 |,
-2
,
-7
,
-9
,
-10
,
-11
y
MT1-MMP
medida en líneas celulares utilizando qPCR. Los datos se normalizó a C33A. *:
p-valor
& lt; 0,05 en relación con C33A. (C) Expresión relativa de
MMP-2, -7
y
MT1-MMP Hoteles en células C33A expresan de forma estable diferente HPV16 (
16E6, 16E6F, 16E6 * I, 16E7, 16E6E7
,
16E6 * IE7
), HPV18
(18E6E7) Opiniones y bajo riesgo HPV6
(6E6)
oncoproteínas, medido por qPCR y normalizado a pcDNA3. *
p-valor
& lt; 0,05 en comparación con las células que expresan pcDNA3. (D) El nivel de transcritos de VPH en comparación con el control, HPRT, en cada línea celular como se muestra por RT-PCR. (E) la actividad de la degradación de P53 16E6, 16E7 y 16E6E7 se comparó por Western blot. GAPDH se utilizó como control de carga.
Con el fin de examinar la relación entre la alta expresión de
MMP-2, -7
y
MT1-MMP
y HPV oncoproteínas, qPCR fue empleado para monitorear
MMP
niveles de transcripción en las células que expresan de forma estable C33A 16E6, 16E6F, 16E6 * I, 16E7, 16E6E7, 16E6 * IE7, y 18E6E7 (bajo riesgo) HPV6E6. 16E6F, 16E6 * I y 16E7 fueron capaces de inducir un aumento de
MMP-2
,
MT1-MMP
pero no
MMP-7
transcripciones, en comparación con pcDNA3- control de las células transfectadas (Fig. 1C). C33A células que expresan 16E6 * Me mostraron la más baja
MMP-2 y
MT1-MMP
transcripciones entre las oncoproteínas HPV16 probadas. En las células que expresan 16E6F y 16E6 * I (células decir 16E6-expresión) o 16E6 * I y 16E7 (es decir, 16E6 * células IE7 expresan) o 16E6F, 16E6 * I y 16E7 (células decir 16E6E7 expresan) hubo aumentos significativos en
MMP
s transcripciones, en particular los de
MMP-2
y
MT1-MMP gratis (Fig. 1C). Sin embargo, en las células que expresan C33A 18E6E7, los niveles de transcripción de
MMP-2
,
MMP-7
y
MT1-MMP
no eran diferentes a las de las células que expresan pcDNA3, y como se esperaba, no hubo cambios de
MMP
transcripciones en HPV6E6 de bajo riesgo que expresan las células en comparación con las células que expresan pcDNA3. Estos resultados demuestran claramente que las oncoproteínas HPV16 HPV18 pero no mejoran específicamente la expresión de
MMP-2
y
MT1-MMP
, pero no de
MMP-7
. Los niveles de HPV16 transcripciones de oncogenes en células C33A como se muestra por RT-PCR en la Fig. 1D indicó que
MMP
actividad inductora correlaciona más con tipos pero no dosis de oncoproteínas de VPH. Las actividades funcionales de las oncoproteínas del VPH en la degradación de las proteínas p53 también se demostraron en las células que expresan 16E6, 16E7 y 16E6E7 (Fig. 1E).
invasividad, gelatinasa actividad y MMP expresión en células C33A Expresando HPV16 oncoproteínas
tras fin de determinar si los aumentos en
MMP-2
y
MT1-MMP
transcritos se traducen en una mayor invasividad de las células que expresan HPV16-oncogenes utilizando tanto
in vitro
invasión ( Fig. 2A) y los ensayos de curación de heridas (Fig. 2B). HPV16 C33A oncoproteína expresar eran más invasiva en ambos ensayos que HPV6E6 control que expresa y C33A transfectadas con pcDNA3, con células que expresan una combinación de E6F, E6 * I y E7 (16E6E7) que tiene la más alta capacidad de invasión (Fig. 2A y B). A medida que han aumentado estas células
MMP-2
y
MT1-MMP
transcripciones, que fueron sometidos a zimografía de gelatina usando la misma cantidad de proteínas (30 g) para determinar si la actividad de MMP elevado estaba presente. El medio procedente de todas las células C33A mostró la presencia de una gelatinasa, correspondiente a pro-MMP-2 (~72 kD) y MMP-2 (~62 kD) [14], con más intensos MMP-2 bandas presentes en células que expresan 16E6, 16E6 * IE7 y 16E6E7 (Fig. 2C). Las células que contienen HPV6E6 de bajo riesgo mostraron actividad gelatinasa similar al pcDNA3 de control que contiene células (datos no presentados). La banda de lisis gelatina en zymographies de gelatina ha sido comprobada por la adición de 5 mM de EDTA disódico, un inhibidor de gelatinasa, en la reacción y se ejecuta en un gel separado. Desaparición de las bandas zymographic esperados confirmó la actividad de la gelatinasa de esas bandas de lisis (datos no mostrados). Vale la pena señalar que la presencia combinada de 16E6 * I y 16E6F en 16E6 mejora activas de MMP-2 niveles en comparación con las células que expresan 16E6F o 16E6 * I solo (Fig. 2A, 2B, 2C), lo que sugiere un efecto aditivo entre las dos formas de E6 en la estimulación de
MMP-2
expresión y promoviendo así la invasión de células. Los niveles de proteína de MT1-MMP en estas células también se determinaron mediante análisis de Western blot utilizando el anticuerpo MT1-MMP anti-humano con GAPDH como control. El aumento de veces de la expresión MT1-MMP se calculó a partir total de MT1-MMP (pro-MT1-MMP y MT1-MMP) con el control conjunto de vectores como 1. Como se muestra en la Fig. 2D, todas las células que contienen proteínas HPV16 expresada pro (~66 kD) y madura MT1-MMP (~57 kD) con la mayor intensidad de la banda de pro-MT1-MMP en 16E6E7 (2,5 ×, el total de MT1-MMP) y de madura MT1-MMP en 16E6 (2,3 x, el total de MT1-MMP), mientras que el control de vectores mostró que sólo el pro-MT1-MMP. Estas observaciones revelaron que la invasividad de las células que expresan HPV16 oncoproteína correlacionados con la actividad de MMP-2 y MT1-MMP expresión.
(A)
in vitro
invasión y (B) la cicatrización de heridas ensayos para C33A las células que expresan diferentes oncoproteínas HPV16. (C) Un gel zymographic gelatina representativo que muestra la actividad de MMP-2 normalizado con cantidades iguales de proteína de carga (30 g). Las bandas correspondientes a la actividad gelatinolítica de MMP-2 se cuantificaron por análisis densitométrico y se compararon con los obtenidos a partir de pcDNA3 de control de las células que expresan. (D) Análisis de transferencia Western de MT1-MMP utilizando anticuerpo anti-MT1-MMP (ab78738) a una dilución 1:1,500 con GAPDH como control de carga. *
p-valor
& lt; 0,05, **
p-valor
. & Lt; 0,01
Efecto sobre la capacidad invasora de HPV16E6 células knock-down
Para confirmar que las oncoproteínas HPV16 causan la regulación positiva de
MMP-2
y
MT1-MMP
expresión, los oncogenes E6 en células SiHa HPV16-positivas fueron eliminados por el uso de dos shRNAs (shE6A y shE6B) focalización diferentes sitios del mRNA 16E6 [23]. El uso de RT-PCR, los niveles de HPV16E6F, 16E6 * transcripciones I y 16E7 en células SiHa mostraron ser reducido en ~ 50% después de la transfección con shE6A, mientras que sólo se detectó una reducción de 10 a 30% en las células transfectadas con shE6B (Fig. 3A). Sólo
MMP-2
y
MT1-MMP
pero no
MMP-7
transcripciones se redujeron en E6 células knock-down SiHa (Fig. 3B). Cuando cantidades iguales de proteína (20 mg) a partir del medio acondicionado se ensayó por zimografía de gelatina, se observó que la actividad de MMP-2 en las células transfectadas con shE6A se redujo en comparación con pSUPER y shCtrl transfectaron las células de control (Fig. 3C). Los lisados celulares (30 mg de proteína cada una) analizaron mediante transferencias Western para evaluar los niveles de MT1-MMP con GAPDH como control, revelaron disminuciones leves (~ 30% y ~ 40% de reducción en shE6A y shE6B respectivamente) de los niveles de MT1-MMP en tanto knock las células de comparación con los controles shCtrl (Fig. 3D). Curiosamente, las proteínas MT1-MMP detectado en las células SiHa fueron principalmente el maduro MT1-MMP (57 kD). De acuerdo con estos hallazgos, tanto en las células transfectadas con shRNA, particularmente shE6A, habían reducido significativamente la invasividad (~48%) y la herida capacidad (~ 50%) de curación, en comparación con las células shCtrl (Fig. 3E). Por lo tanto, la ablación de oncoproteínas HPV16E6 /E7 reduce MMP-2 la actividad, la expresión de MT1-MMP y, finalmente, la invasividad de las células SiHa HPV16-positivas.
(A) RT-PCR de
16E6F, 16E6 * I
y
16E7
transcripciones normalizaron con el control,
HPRT
. células SiHa transfectadas con la orientación no shCtrl y control del vehículo pSUPER se utilizaron como controles negativos. shE6A y shE6B son dos shRNAs diferentes utilizados en experimentos knock-down. (B) qPCR de
MMP-2
,
-7
y
MT1-MMP
transcripciones y la actividad de MMP-2 (C) como se ensayó mediante zimografía de gelatina, con igual cantidades de proteína (20 mg), en shRNA células transfectadas. (D) la proteína MT1-MMP en células derribados como determinar mediante análisis de transferencia Western con GAPDH como control de carga. capacidad (E) La invasión de las células SiHa transfectadas con diferentes shRNAs según lo determinado por
in vitro
la invasión y la herida ensayos curativos. veces en relación con la invasión de células de las células no tratadas se establece como 1 se informa. *
p-valor
. & Lt; 0,05 en comparación con las células shCtrl
invasividad reducido por los inhibidores específicos de MMP-2 y MMP-MT1
Para determinar si la inhibición selectiva endógena de MMP-2 o MT1-MMP afectan la capacidad de invasión, las líneas celulares que expresan C33A tanto SiHa y 16E6E7 fueron tratados con oA-Hy, un inhibidor específico para MMP-2, (la Fig. 4A, 4B) y anti-MT1-MMP, un anticuerpo específico para el dominio catalítico de MT1-MMP (Fig. 4C). Nuestros resultados mostraron claramente que el tratamiento de la OA-Hy resultó en una reducción significativa en la invasión de células tanto para 16E6E7 (~ 70% en 10 mM) células (Fig. 4A) y SiHa (~ 65% a 20 M) (Fig. 4B) de una manera dependiente de la dosis. Del mismo modo, la inhibición de MT1-MMP utilizando el anticuerpo específico claramente reduce la invasividad (~ 50%) de las dos líneas celulares en comparación con las células no tratadas (Fig. 4C). Nuestros experimentos confirmaron que la invasión de las células infectadas con HPV16 era dependiente de la expresión de MMP-2 y MMP-MT1. Puesto que se ha sabido que la formación de un /TIMP-2 MMP pro--2 complejo de MT1-MMP /es necesaria para la activación de la pro-MMP-2 por MT1-MMP en la superficie celular, los niveles de TIMP-2 expresión en todas las células que expresan HPV16 oncoproteína también fueron investigados. Curiosamente, se encontró TIMP-2 expresión que aumentarse ligeramente tanto en el mRNA (~ 3 ×) y proteínas (~ 2 ×) niveles en todas las células en comparación con el pcDNA3 de control con la excepción de la HPV6E6 de bajo riesgo que exhibió TIMP -2 expresión comparable a el vector vacío (Fig. 4D). Ya sea oncoproteínas VPH mejoran directamente la expresión de TIMP-2 queda por determinar.
(A) la invasión de la célula como se determina utilizando
in vitro
invasión y la cicatrización de heridas de HPV16E6E7 células que expresan y (B) células SiHa tratados con varias concentraciones de inhibidor de MMP-2, OA-Hy. (C) Las mismas líneas celulares también fueron tratados con anticuerpos contra la MT1-MMP (20 mg /ml). veces en relación con la invasión de células de control del vehículo pcDNA3 o las células no tratadas establece como 1 en φ
p Hotel & lt; 0,05 comparan con pcDNA3 y *
p-valor
& lt; 0,05 comparan con las células no tratadas se muestra. (D) proteína TIMP-2 (normalizado con la proteína de carga igual de 5 g) se detectó usando el análisis Western blot con un anticuerpo anti-TIMP-2 de anticuerpos (Abcam, 1:1,000 dilución) y TIMP-2 transcripciones se midieron por qPCR (normalizado a HPRT) para las células que expresan la oncoproteína HPV16.
transcripcional regulación al alza de la actividad de los oncogenes HPV16 en
MMP-2
y
MT1-MMP
Promotor
constructos promotor que contiene secuencias 5 'aguas arriba, es decir, -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 y -211 /+ 40 del
MMP-2
promotor y -1277 /+ 187, -425 /187 y -151 /+ 187 de
se generaron MT1-MMP
promotor fusionado con el gen reportero de la luciferasa en el plásmido pGL3-Basic. Cada construcción se transfectó posteriormente en C33A expresan de forma estable HPV16E6E7. En presencia de HPV16E6E7, la actividad de la luciferasa de la -1721 /+ 40
MMP-2
constructo se demostró que era comparable a la de -1001 /+ 40 presentan 4,6 y 3,9 veces mayor expresión que la de la las células de control transfectadas con el vector pGL3-Basic vacío o aumento ~ 2 veces de ambas actividades de promotor en comparación con el nivel basal en las células que expresan pcDNA3 (Fig. 5A). Resultados similares se obtuvieron de
MT1-MMP
promotor construcciones (Fig. 5B). Estos resultados sugieren que las secuencias responsables de la mediación de la actividad oncogénica HPV16 deben residir dentro -1001 /+ 40 y -425 /+ 187 regiones de
MMP-2 y
MT1-MMP
promotores, respectivamente. Tanto contenida PEA-3 (-552 a -540 y para
MMP-2 y
-303
MT1-MMP) y SP1 (a -91 para MMP-2 y -102 de
MT1-MMP) que sugieren que los sitios de unión a oncoproteínas HPV16 ejercen su actividad de transactivación a través de estos sitios de una manera similar. La falta de p53 y la PEA-3 sitios remotos en
MMP-2
promotor y secuencias de tipo de ligadura de unión
MT1-MMP
construcciones del promotor indicaron que estos sitios no eran responsables de la mediación de la efecto de oncoproteínas de VPH. Sin embargo, las pequeñas construcciones de promotor
MMP-2 (-211 /+ 40) que contiene una bola del Sp1, AP2 y la PEA-3 sitios de unión y de
MT1-MMP
promotor (