Extracto
Los estudios de asociación del genoma a gran escala (GWAS) han establecido el cromosoma 5q31 0.1 como un locus de susceptibilidad para el cáncer colorrectal (CRC), que todavía era la falta de variantes genéticas causales. Se realizaron búsquedas polimorfismos potencialmente reguladoras de nucleótido único (SNP) en la región de solapamiento entre el desequilibrio de ligamiento (LD) de bloques de 5q31.1 y elementos reguladores predichos por modificaciones de las histonas, a continuación, probamos su asociación con el CRC a través de un estudio de casos y controles. Entre las variantes comunes de tres candidatos, encontramos rs17716310 confirió significativamente (modelo heterocigóticos: OR = 1,273, intervalo de confianza del 95% (IC del 95%) = 1,016 a 1,595,
P = 0,036
) y marginalmente (modelo dominante: SI = 1,238, IC del 95% = 1,000 a 1,532,
P = 0,050
) aumento de riesgo de CCR en una población china incluyendo 695 casos y 709 controles. Esta variación se sugirió a ser normativo alterar la actividad del promotor de que el control
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expresión. El uso de la información epigenética como la inmunoprecipitación de la cromatina-secuenciación (chip-ss) de datos podría ayudar a los investigadores a interpretar los resultados de los GWAS y localizar variantes causales de enfermedades en la era post-GWAS
Visto:. Ke J, Lou J, Chen X, Li J, Liu C, Gong Y, et al. (2015) Identificación de una variante de Regulación Posibilidad de Cáncer Colorrectal Mapeo de riesgo para el cromosoma 5q31.1: un estudio post-GWAS. PLoS ONE 10 (9): e0138478. doi: 10.1371 /journal.pone.0138478
Editor: Yifeng Zhou, Facultad de Medicina de la Universidad Soochow, CHINA
Recibido: 24 Junio, 2015; Aceptado: 29 Agosto 2015; Publicado: 18 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Ke et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF-81402744) a JG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en china, el cáncer colorrectal (CCR) es el quinto cáncer más comúnmente diagnosticado en varones y la tercera en las mujeres, con un estimado de 310,244 nuevos casos y 149,722 muertes que se producen en el año 2011 [1]. Los factores de riesgo para CRC incluyen alimentación, la inactividad física, la obesidad, fumar y beber [2, 3], y es bien sabido que los factores genéticos también juegan un papel importante en la etiología de la CRC [4, 5]. Por ahora, los estudios de asociación de genoma completo (GWAS) e investigaciones de mapeo fino han identificado variantes de riesgo de asignación a más de 30 loci de susceptibilidad independiente de la CRC en los europeos y los asiáticos [6-20]. Sin embargo, gran mayoría de estas variantes reside en regiones intergénicas y intrónicas, y el mecanismo biológico más probable que los une a la enfermedad es regulador [21].
La acumulación de pruebas mostró que no codificante variantes genéticas de riesgo asociado loci podría ejercer un efecto sobre la expresión génica mediante la modulación de la actividad de elementos reguladores [22], incluyendo promotores, potenciadores, aisladores y silenciadores. Y diversas histonas en los nucleosomas que flanquean de tales regiones genómicas se han descubierto para llevar característicos modificaciones post-traduccionales [23, 24]. Por ejemplo, los promotores suelen marcar H3K4me3 (histona H3 en la lisina 4 trimetilada) y potenciadores por H3K4me1 (histona H3 en la lisina monometilado 4), y, o bien es, además, marcado por H3K27ac (histona H3 acetilada en la lisina 27) tras la activación [25- 28]. Hoy en día, la cartografía de todo el genoma de las histonas modificaciones realizadas por inmunoprecipitación de la cromatina-secuenciación (chip-ss) es ampliamente utilizado para predecir los promotores y potenciadores [29-32].
5q31.1 fue mapeado por primera vez como una susceptibilidad CRC locus por Jia et al [17], tanto en Asia Oriental y las poblaciones europeas, apoyado además por otro estudio genético a gran escala por Zhang et al [20] en el este de Asia. El gen más probable que participan
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(emparejado-como homeodominio 1) ha sido considerado como un gen supresor de tumor en relación con la carcinogénesis de CRC [33, 34] y otros tipos de cáncer [33, 35-38]. Sin embargo, la fuerte informado rs647161 polimorfismo riesgo es de la función poco clara y no en cualquier secuencia conocida transcritos o reglamentarias. Así, razonó que rs647161 no es el polimorfismo causal de un solo nucleótido (SNP) y los SNPs funcionales reales permanecen para ser explotado en esta región. Al mismo tiempo, la identificación de SNPs funcionales que se superponen elementos reguladores específicos de tejido predichos por el estado de la cromatina tales como modificaciones de las histonas, han representado un enfoque poderoso para el progreso de la asociación estadística de la funcionalidad y la causalidad en investigaciones genéticas-GWAS enviar [39-42].
En este estudio, se analizaron los datos de chip-ss de modificaciones de las histonas del proyecto ENCODE [29], explorado variantes potencialmente reguladoras dentro del locus de susceptibilidad 5q31.1, e investigó la asociación candidatos SNPs comunes 'con el riesgo de CCR a través de una estudio de casos y controles en la población china.
material y Métodos
Los participantes del estudio
Un total de 695 casos de CCR y 709 controles sin cáncer fueron reclutados del hospital Tongji de Huazhong Universidad de Ciencia y Tecnología (HUST) entre 2008 y 2011. Todos los sujetos no estaban relacionados étnicos chinos Han que viven en la ciudad de Wuhan y sus alrededores. Los criterios de inclusión para los casos fueron confirmados por histopatología CRC sin quimioterapia o radioterapia previa, y ninguna restricción al sexo y la edad. Se seleccionaron los controles al azar de un programas de exploración física en el mismo hospital en el mismo período de tiempo que los pacientes se inscribieron, parte de la cual también participaron en nuestros estudios permeables [43, 44], y fueron agrupados de manera adecuada a los casos en términos de género y edad (± 5 años). En esto, los fumadores fueron definidos como aquellos que habían fumado al menos un cigarrillo al día durante 12 meses o más en cualquier momento de su vida, mientras que los no fumadores fueron definidos como aquellos que no lo había hecho. Al momento del reclutamiento, se recogió sangre venosa periférica de 5 ml de cada sujeto después de que se obtuvo un consentimiento informado por escrito. Este estudio fue aprobado por el comité de etnias del Hospital Tongji de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología
Selección de SNPs candidatos
SNPs candidatos en este estudio se identifican como comunes alelo menor frecuencia (MAF & gt.; 0,05) variantes genéticas de posicionamiento en la región de superposición entre los elementos reguladores 5q31.1 locus y el CRC-específicos marcados por las marcas epigenéticas adecuados. En primer lugar, hemos descargado la información del genotipo de los chinos Han en Beijing, China (CHB), que fue de 500 kb aguas arriba y aguas abajo de los rs647161 tagSNP de la base de datos HapMap, y la entrada de esos datos en la HaploView de software para obtener el desequilibrio de ligamiento (LD) de bloques de rs647161 con los criterios de
r
2 Hotel & gt; 0,8, que se definió como el límite de GWAS locus 5q31.1. En segundo lugar, hemos adquirido los datos de chip-ss de diferentes modificaciones de las histonas producidos en dos líneas celulares de CRC HCT116 y Caco2 de UCSC base de datos integrado con datos de Encode (S1 Tabla), después se extrajo la medida de sus picos de señal de pie para elementos reguladores, en el que intersectado dos versiones de replicación del mismo conjunto de datos (intersección) y unidos todos los diferentes conjuntos de datos (Union). En tercer lugar, basándose en la base de datos dbSNP, escogimos los SNPs con MAF & gt; 0,05 en CHB que se encuentran en la zona de solape entre el bloque LD antes mencionado y picos. Por último, tres SNPs, rs2193941, rs17716310 y rs7703385 fueron elegidos como candidatos SNPs para el genotipado de próxima etapa.
Genotipado
ADN genómico fue extraído de leucocitos de sangre periférica mediante RelaxGene Sistema DP319-02 Sangre (Tiangen, Pekín, china) en función de las instrucciones del fabricante. Todos los SNPs se genotipo con el genotipado SNP ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). 5 muestras duplicadas% fueron seleccionados al azar para evaluar la reproducibilidad del control de calidad, con una tasa de concordancia del 100%.
Análisis estadístico
La prueba t y χ
2 test se aplicó a estimar las diferencias en las variables y la distribución de genotipos entre los casos y controles. Hardy-Weinberg (HWE) se evaluó mediante la aplicación de la bondad del ajuste χ
2 test en los controles. La fuerza de la asociación entre cada SNP de riesgo y el CRC se midió mediante la odds ratio (OR) y su intervalo de confianza del 95% (IC del 95%). Con el fin de evitar la asunción de modelos genéticos, heterocigotos, modelos de homocigotos, dominante, recesivo y aditivos fueron analizados. El poder de la prueba estadística de cada SNP se calcula v3.0 POWER (http://www.mds.qmw.ac.uk/stat-gen/dcurtis/software.html). Y RUP y los correspondientes IC del 95%, ajustado por sexo, edad y tabaquismo se calcularon mediante regresión logística multivariante incondicional. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS v20.0 software (SPSS, Chicago, Illinois, EE.UU.). El potencial de genes y medio ambiente y las interacciones SNP-SNP se evaluaron mediante un análisis por pares en virtud de los modelos [45] y la interacción aditivo multiplicativo [46]. Los valores de
P Opiniones de interacción multiplicativa se calcularon usando un término de interacción multiplicativa en el marco del modelo de regresión logística multivariante en el software SPSS. Y los valores de
P
para la interacción aditivo se evaluaron mediante una prueba de programa previo de la bondad del ajuste utilizando Stata v11.0 (Stata Corporation, College Station, TX). Todos los
Los valores P
eran dos caras con los criterios de significación estadística de
P Hotel & lt; 0.05
Resultados
Selección de SNPs candidatos
El área de GWAS loci de susceptibilidad 5q31.1 definimos por LD era el cromosoma 5:. 134.467.220 a 134.518.445. Después de un análisis bioinformático de tres pasos, tres polimorfismos comunes, rs2193941, rs17716310 y rs7703385 que encuentra dentro de los picos de los datos de chip-Seq modificación de las histonas generados a partir de HCT116 o Caco2, fueron encontrados en los lugares anteriormente (Tabla 1).
Características de la Población
695 casos incidentes y 709 controles emparejados por frecuencia se inscribieron en este estudio. Como se muestra en la Tabla 2, la proporción de los machos fue 58,42% en los casos en comparación con 56,42% en los controles (
P
= 0,449, Pearson χ
2 = 0,570). la edad y la correspondiente desviación estándar media fue de 60,16 ± 12,26 años para los casos y 59,80 ± 13,18 años para los controles (
P = 0.598
mediante la prueba t), y no hubo diferencias estadísticamente significativas entre los casos y controles en cuanto a la edad distribución (
P = 0,305
, Pearson χ
2 = 3,625) entre las cuatro categorías (≤50, 51-60, 61-70 y ≥71). Como era de esperar, más fumadores se presentaron en los casos que en los controles (35,25% frente a 29,62%;
P = 0,022
, Pearson χ
2 = 5.257), teniendo en cuenta que el tabaquismo era un bien establecidos factor de riesgo para CRC (2).
Análisis Asociación
Todos los tres SNPs, rs2193941, rs17716310 y rs7703385, se encontraban en HWE (
P
HWE = 0,55, 0,17 y 0,55), y el poder prueba estadística fue 95,9%, 95,3% y 95,5%, respectivamente. Las distribuciones de genotipo de los polimorfismos estudiados se muestran en la Tabla 3. En el análisis de asociación, solamente rs17716310 mostró una asociación significativa con el CRC bajo el modelo heterocigoto, mientras que los otros dos rs2193941 y rs7703385 SNP presentaron pruebas estadísticas de relación con el riesgo de CCR.
Bajo el modelo de regresión logística multivariante ajustado por sexo y edad, los individuos con el genotipo AC de rs17716310 tuvieron un aumento significativo del riesgo de CCR (OR = 1,273; IC del 95% = 1,016 a 1,595,
P = 0,036
) en comparación con aquellos con homocigotos AA. Un modelo dominante se llevó a cabo para mejorar la potencia estadística mediante la combinación de la CA con CC en un grupo C-portador (CA más CC), y mostró que los portadores del alelo C consiguieron un efecto marginal sobre la susceptibilidad CRC (OR = 1,238, IC del 95% = 1,000 a 1,532,
P = 0,050
). Sin embargo, hay un riesgo significativo de que el alelo variante C se observó en el modelo homocigoto recesivo o aditivo. En cuanto a rs2193941 y rs7703385, no hubo resultados positivos en todas las modelos genéticos que estudiaron.
El análisis de desequilibrio de unión
Se muestra en la figura 1, tres SNPs fueron investigados en alto LD entre sí ( rs2193941 y rs17716310,
r
2
= 0,89; rs17716310 y rs7703385,
r
2
= 0,97; rs2193941 y rs7703385,
r
2
= 0,90) en nuestro estudio. Por otro lado, rs2193941, rs17716310 y rs7703385 se descubrieron estar en alto LD con los rs647161 tagSNP (
r
2
= 0,83,
r
2
= 0,88,
r
2
= 0,88, respectivamente) en la población de CHB 1000 Genomas Proyecto Fase 3.
análisis de interacción
Tabla 4 detalla los resultados del análisis de la interacción entre el SNP rs17716310 prometedor y el tabaquismo, donde se observó una interacción significativa (
P
mult = 0,013) en multiplicativo condiciones. Cuando se analizaron las interacciones por pares entre los tres candidatos variaciones, no se encontraron resultados positivos tanto bajo modelo multiplicativo y aditivo (S2 Tabla).
Discusión
En la era post-GWAS , la identificación de variantes genéticas funcional específica que no representa realmente el fenotipo es el principal propósito y desafío, y elementos reguladores del genoma puede ayudar. El uso de las marcas epigenéticas obtenidos a partir de los tipos de células relevantes, se realizaron búsquedas SNP potencialmente funcionales que estaban situadas en los elementos supuestamente reguladoras, y validado su asociación con CCR en una población independiente.
En este estudio, a través de la combinación de locus 5q31.1 GWAS y regiones reguladoras prometedores predichos por modificaciones de las histonas en líneas celulares de CRC, se seleccionaron tres variantes comunes, rs2193941, rs17716310 y rs7703385, en su superposición. Después se realizó un estudio de asociación en una población china que contiene 695 casos de CCR y 709 controles de salud, se encontró un efecto significativo y marginal de rs17716310, que era en LD con rs647161 tagSNP y de poder interactuado con el tabaquismo.
Los hallazgos condujeron que asumamos rs17716310 influido el riesgo de CCR mediante la alteración de la actividad de elementos reguladores que controlan
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expresión. Situados dentro de una región del genoma que presenta modificaciones de la cromatina y H3k4me1 H3k27ac, rs17716310 es muy recomendable ser un variantes de regulación pertenecientes a un promotor activo [47, 48]. Se trata de aproximadamente 107 kb aguas arriba del gen más cercano
PITX1
, que ha sido reportado como un supresor tumoral regulación negativa de la vía RAS [33], la activación de
TP53
[49] y la actividad de ajuste de la telomerasa [ ,,,0],50]. Además, menor
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expresión se ha encontrado en muestras de tejido de cáncer humano y líneas celulares [35-37], y se asocia con una baja supervivencia en pacientes con CRC [51]. Por otro lado, en una base de datos en línea HaploReg [52], rs17716310 se indicó para cambiar el motivo de unión de p300 que funciona como un coactivador de la transcripción y de la histona acetiltransferasa de regulación de la expresión génica mediante la remodelación de la cromatina [53]. La variante puede alterar el sitio de unión de un factor (s) de la transcripción, y el impacto en la interacción entre este potenciador y el promotor activo aguas abajo de
PITX1
, por lo tanto perjudicar la transcripción y la expresión del gen supresor, y en consecuencia, facilitar CRC tumorigenicidad y la susceptibilidad. En cuanto a la interacción con el tabaquismo que se encuentra en el modelo multiplicativo, que podría ser debido a las relaciones entre el estado de humo y vía RAS,
TP53
y la actividad de la telomerasa [54-57] en la que
PITX1
era involucrado. Sin embargo, la suposición de experimentos necesita más funcionales que deben verificarse.
La aplicación de la información epigenética biofeature tales como datos de chip-ss modificación de las histonas para identificar potenciadores candidatos han representado una herramienta útil para identificar SNPs funcionales candidatos en las regiones reguladoras [ ,,,0],58, 59], y las bases de datos tales como la UCSC y Codificar han proporcionado un fácil acceso a grandes cantidades de datos relevantes. La integración de epigentics recién surgido y epidemiología molecular tradicional podría ser un método eficaz para ayudar a interpretar resluts GWAS y descubrir variantes causales de enfermedades en estudios post-GWAS. La aplicación de la estrategia similar a otras regiones CRC GWAS debe contribuir a una comprensión más profunda del riesgo de CCR.
Sin embargo, varias limitaciones deben ser reconocidas aquí. En primer lugar, la estrategia de recuperación de polimorfismos candidatos dependía de la predicción a partir de los datos de chip-ss de dos líneas celulares de CRC, que no era lo suficientemente riguroso para definir elementos reguladores exactos, y no lo suficientemente amplio como para descubrir todos los SNPs funcionales dentro. En segundo lugar, el tamaño de la muestra de nuestro estudio de casos y controles fue relativamente pequeña. En tercer lugar, la información ambiental insuficiente y clínica nos limita a investigar más a fondo las interacciones entre genes y otros factores. En cuarto lugar, carece de experimentos funcionales, la realidad biológica por debajo de la asociación estadísticamente significativa se informó es incierto.
En resumen, hemos descubierto un SNP probablemente reguladora en alto LD con el GWAS tagSNP que está asociada con el riesgo de CCR en población china . investigaciones sistemáticas sobre más loci de susceptibilidad con mayores tamaños de muestra y análisis funcionales de seguimiento están garantizados para identificar variantes causales y elaborar el mecanismo biológico de etiología genética.
Apoyo a la Información sobre Table S1. conjuntos de datos de chip-ss descargados de la UCSC la integración de datos Codificar
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138478.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. análisis de la interacción entre rs17716310 y rs2193941, rs17716310 y rs7703385, rs2193941 y rs7703385
doi:. 10.1371 /journal.pone.0138478.s002 gratis (DOCX)