Extracto
Antecedentes
Muchos pacientes con diagnóstico de cáncer de ovario experiencia de recurrencia y metástasis, dos aspectos que a menudo causar su desaparición. Epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un proceso clave implicado en la progresión del cáncer. Con el aumento de evidencia que vincula el cisplatino y EMT, queríamos identificar un compuesto capaz de contrarrestar la progresión de la EMT, cuando las células del cáncer son tratados con cisplatino.
Metodología /Principales conclusiones
La muerte celular se evaluó mediante citometría de Anexina V /tinción con PI en las células A2780 y A2780CP. líneas celulares de cáncer de ovario fueron tratados con cisplatino (24 h, 10 m) y diferentes concentraciones de resveratrol para evaluar su efecto sobre la EMT inducida por cisplatino mediante Western Blot y análisis RT-PCR. Los estudios morfológicos y ensayo de la herida curativas para evaluar la motilidad celular se realizaron con 72 h de tratamiento con cisplatino células A2780 y A2780CP. La densitometría se realizó el Western Blot y PCR resultados, y la significación estadística se determinó usando ANOVA de un factor seguido por el test post-hoc de Tukey. Nuestros resultados muestran que el cisplatino induce cambios morfológicos asociados a la EMT en la línea celular de cáncer de ovario A2780 y en menor medida en su contraparte A2780CP resistentes al cisplatino. Resveratrol causó la muerte celular en las líneas celulares A2780 y A2780CP de una manera apoptótica independiente. Resveratrol inhibe la expresión de Snail inducida por cisplatino mediante la reducción de la activación de la vía Erk, revierte los cambios morfológicos inducidos por el cisplatino y la disminución de la migración celular.
Conclusiones
Estos resultados indican que el resveratrol tiene un potencial interesante para evitar cisplatino EMT inducida en células de cáncer de ovario. Mediante el aumento de la muerte celular, sino que también representa un enfoque atractivo como terapia adyuvante para ser utilizado con la quimioterapia. El uso de inhibidores de la vía ERK también podría ser útil en el tratamiento del cáncer de ovario para reducir el riesgo de metástasis
Visto:. Baribeau S, Chaudhry P, S Padres, Asselin E (2014) Inhibe resveratrol inducida por cisplatino-a-epitelial La transición mesenquimales en líneas celulares de cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (1): e86987. doi: 10.1371 /journal.pone.0086987
Editor: Goli Samimi, Kinghorn Centro del Cáncer, Instituto Garvan de Investigación Médica, Australia |
Recibido: 4 de octubre de 2013; Aceptado: 19 de diciembre de 2013; Publicado: 22 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Baribeau et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha sido apoyado por una beca de los Institutos canadienses de Investigación en Salud (RP-66987). EA tiene una Cátedra de Investigación de Canadá en Molecular-Gineco-Oncología. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el séptimo cáncer más común y la tercera más común entre los cánceres ginecológicos en las mujeres canadienses. El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico también con la tasa más alta de mortalidad y una tasa de supervivencia a 5 años se estima que solamente el 15-25% [1]. Esto puede explicarse por el hecho de que los pacientes afectados por cáncer de ovario a menudo ya tienen una enfermedad en estadio alto en el momento del diagnóstico [2], [3]. El tratamiento habitual para el cáncer de ovario consiste en citorreducción quirúrgica seguida de quimioterapia basada en platino [4]. A pesar de la respuesta inicial al tratamiento, muchos pacientes recaerán y finalmente verán afectados por metástasis y, finalmente, cumplir con su desaparición.
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un proceso fisiológico que se produce durante el desarrollo embrionario y, ocasionalmente, en adultos, por ejemplo durante la curación de heridas [5]. EMT es un fenómeno durante el cual las células se someterán a una transición de un fenotipo epitelial a un fenotipo mesenquimal más móviles e invasivo, haciéndolas capaces de invadir tejidos y metástasis de formulario. La principal característica de la EMT es la pérdida de E-cadherina, una proteína de unión normalmente se expresa en las células epiteliales. En la mayoría de los casos, la pérdida de E-cadherina está mediada por represores transcripcionales, y las mutaciones del gen o la proteína no son eventos comunes [6]. Los represores más comúnmente involucrados incluyen caracol, barra, y ZEB1 que se unen directamente al promotor de la E-cadherina para reprimir su transcripción [7], [8]. Hay muchos factores que se sabe que inducen EMT, incluyendo citoquinas tales como TGF-β [9] o la vía MAPK Erk-[10]. Un estudio reciente sobre el cáncer de ovario informaron cisplatino como inductor de EMT [11].
caracoles y babosas son factores de transcripción conocidos principalmente por su participación en la EMT en el que reprimen la expresión de marcadores epiteliales, tales como E-cadherina y claudina-1, y aumentar la expresión de marcadores mesenquimales, tales como ZEB1 y MMP-9 [12] - [16]. También pueden reprimir la expresión y función de la p53 supresor de tumores y promover la quimiorresistencia [17], [18]. Durante la progresión EMT, se cree que Snail será el primer factor para ser activo para iniciar la transición mientras que Slug se expresa en etapas posteriores para permitir que las células conserven sus características mesenquimales [19]. ZEB1 es otro importante promotor de la EMT reprimiendo ZO-1 y E-cadherina [20], pero también puede estar implicado en el aumento de la tasa de proliferación de las células [21].
Resveratrol (trans-3,4 ' , 5-trihidroxiestilbeno) es un compuesto natural que se produce en muchas plantas, incluyendo uvas rojas [22], y posteriormente presente en el vino, conocida por sus propiedades antioxidantes y sus efectos protectores sobre el sistema cardiovascular y contra el cáncer en el que se pueden inhibir múltiples etapas de la enfermedad [23]. Durante los últimos años, estos muchos efectos colocados resveratrol en el punto de mira de la investigación.
En este estudio, se investigó el efecto del resveratrol sobre la EMT inducida por cisplatino en el cáncer de ovario. Encontramos que las células co-tratadas con resveratrol y cisplatino no muestran los rasgos característicos de EMT, como tratamiento Resveratrol abrogada proteína Snail inducida por cisplatino y las expresiones de ARNm de una manera dependiente de la dosis. Esto implicó la vía ERK, que fue inhibido por el resveratrol y su participación fue confirmada a través de la inhibición específica MEK1 /2 con U0126. El resveratrol también bloqueado cambios morfológicos en las células A2780 y A2780CP y la disminución de la capacidad de migración de las células A2780 y A2780CP durante un ensayo de cicatrización de heridas. Se observó una inhibición similar de la migración en OVCAR-3 y SKOV-3 células. También proponemos β-catenina como un marcador de resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino, ya que se escinde sólo en líneas de células cisplatino-sensibles.
Métodos
Reactivos
modificado por Dulbecco Águila medio-F12 (DMEM-F12), y suero de crecimiento bovina (BGS) fueron adquiridos de HyClone (South Logan, Utah). Gentamicina, cisplatino, y el resveratrol se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El /2 inhibidor de MEK1 y el kit de tinción de β-galactosidasa La senescencia se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). kit apoptosis de células muertas con anexina-V /PI, el reactivo Trizol y Moloney murino virus de la leucemia (M-MLV) de la transcriptasa inversa se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA).
Cultivo de células y tratamiento
líneas celulares de cáncer de ovario humano A2780 y A2780CP (resistentes al cisplatino) las células fueron una especie de regalo del Dr G. Peter Raaphorst (Ottawa regional Cancer Center, Ottawa, Canadá) y se describieron originalmente en [24]. líneas de OVCAR-3 y células SKOV-3 se adquirieron de la ATCC. células A2780 y A2780CP se cultivaron en medio DMEM-F12 suplementado con 2% BGS. OVCAR-3 células fueron cultivadas en células medio RPMI-1640 y SKOV-3 se cultivaron en medio de McCoy tanto suplementado con 10% FBS. Se añadió gentamicina (50 mg /ml) a todos los medios de cultivo.
Para estudiar el efecto del resveratrol en las células EMT, A2780 y A2780CP inducida por cisplatino fueron co-tratados con resveratrol y 10 mM cisplatino durante 24 h. Para estudiar el impacto de la ruta de Erk en EMT inducida por cisplatino, líneas celulares de cáncer de ovario se pretrataron con 20 U0126 mu M durante 1 h, a continuación, cisplatino se añadió al medio de cultivo durante 24 horas a una concentración final de 10 mM. DMSO se utilizó como control para U0126 y Resveratrol.
Detección de la muerte celular por citometría de flujo
células A2780 y A2780CP fueron tratados con resveratrol y cisplatino para 24 h. En la cosecha, las células se centrifugaron a 500 rpm durante 5 minutos, se lavaron con PBS y después se centrifugaron 300 rpm durante 5 minutos. La muerte celular se evaluó con anexina-V-FITC y yoduro de propidio (PI) doble tinción utilizando el kit de apoptosis de células muertas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se leyó la fluorescencia usando un flujo MPL Cytomics FC 500 citómetro (Beckman Coulter). Las células positivas para Anexina-V y /o PI fueron consideradas como las células muertas.
MTT ensayo
La proliferación de células A2780 y A2780CP se evaluó mediante el ensayo de MTT. Las células se sembraron por duplicado en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. El día siguiente, las células en fase de crecimiento se trataron con 0-60 mu M Resveratrol con o sin 10 mM cisplatino durante 24 h en medio de cultivo 100 l. 4 h antes del final del tratamiento, se añadió 10 l de solución de MTT a cada pocillo y las placas se colocaron en la incubadora. 4 h después, se añadieron 100 l solución de solubilización (10% de SDS en HCl 0,01 M) a cada pocillo y las placas se dejaron en la incubadora durante la noche. Al día siguiente, la absorbancia se leyó a A
595 nm con un lector de placas Fluostar Optima.
Western Blot
Las células se recogieron después de 24 h resveratrol en cisplatino o tratamiento U0126 cisplatino y se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células fueron lisadas en tampón de lisis RIPA que contiene cóctel completo de inhibidor de proteasa (Roche Applied Science) y se sometió a tres ciclos de congelación /descongelación a -20 ° C. Las células se centrifugaron después y se recogió el sobrenadante. La concentración de proteína se estimó utilizando el ensayo de proteína BioRad DC. Una cantidad igual de proteínas (20 a 40 g) se separaron luego en SDS-PAGE y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (BioRad, Hercules, CA). Las membranas se bloquearon en 5% no grasa de leche desnatada en PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) durante 1 h antes de la incubación con el anticuerpo primario (diluido 1:1000 en PBS-T /leche) durante la noche a 4 ° C (todo Los anticuerpos son de Señalización celular Tecnología, Danvers, MA, excepto GAPDH de Abcam (Cambridge, MA)). El anticuerpo primario de orientación Snail se incubó 2 h a temperatura ambiente y conjugado con HRP-GAPDH se incubó 45 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, las membranas se lavaron cuatro veces en PBS-T antes de la incubación con peroxidasa de rábano anticuerpo secundario conjugado (BioRad, Hercules, CA) diluido 1:3000 en PBS-T /leche. Las membranas se lavaron cuatro veces en PBS-T y los anticuerpos se revelaron utilizando SuperSignal West Femto sustrato (Thermo Scientific, Rockford, IL), como se describe por el fabricante usando UVP sistema de imágenes Bio. GAPDH se utilizó como control de carga.
Cell morfología
Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos y después se trataron con 2,5 M de cisplatino y /o 60 mu M Resveratrol durante 72 h en células A2780 y A2780CP para que haya tiempo suficiente para que los cambios morfológicos de la EMT que se produzca. Después del tratamiento, las células se lavaron con medio fresco para eliminar las células muertas. Finalmente, se observaron las células bajo un microscopio Zeiss Axio Carl observerZ1 para determinar su morfología y la imagen se tomaron en la microscopía de contraste de fase utilizando magnificación 20X. Las células que presentan características mesenquimales, con una morfología más similar a fibroblastos y protusiones celulares, fueron considerados como procedentes de la EMT.
cicatrización de heridas ensayo
Para evaluar la motilidad celular, las células se sembraron en 24 pocillos placas y se hicieron crecer hasta la confluencia. Se utilizó una punta estéril para crear un rasguño en la capa de células. Las células fueron luego tratados con 2,5 M de cisplatino y 60 micras resveratrol y fotos fueron tomadas en los momentos apropiados para evaluar el cierre de heridas. Las heridas se evaluaron utilizando el software ImageJ para medir el área de la herida en diferentes puntos temporales. El porcentaje de cierre de la herida se calculó como área de la herida en un momento dado en comparación con la superficie inicial de la herida. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos independientes realizados por duplicado.
transcriptasa inversa PCR (RT-PCR)
ARN total fue extraído a partir de células tratadas utilizando el reactivo Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 500 ng de RNA se sometió a transcripción inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa y cebadores oligo (dT). El ARN transcrito inversa se amplificó por PCR usando cebadores específicos. GAPDH se utilizó como control interno. Snail humana se amplificó usando el cebador sentido 5'-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3 'y el cebador antisentido 5'-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3' (longitud del fragmento de 140 pb). TCF8-ZEB1 humano se amplificó usando el cebador sentido 5'-TTACACCTTTGCATACAGAACCC-3 'y el cebador antisentido 5'-TTTACGATTACACCCAGACTGC-3' (longitud del fragmento de 100 pb). La vimentina humana se amplificó utilizando el sentido 5'-CGAAAACACCCTGCAATCTT-3 'y el cebador antisentido 5'-CTGGATTTCCTCTTCGTGGA-3' (fragmento de longitud 133 bp). GAPDH se amplificó utilizando el sentido 5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3 'y el cebador antisentido 5'-GACTTGACAAAGTGGTCG-3' (longitud del fragmento de 139 pb). GAPDH se utilizó como control.
asociada a la senescencia β-galactosidasa tinción
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó adherir durante la noche. El día siguiente, las células se trataron con 60 M Resveratrol y 2,5 M cisplatino para 72 h. Después del tratamiento, las células se lavaron para eliminar las células no adherentes y se tiñeron con el kit de tinción de β-galactosidasa senescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se contaron con un microscopio óptico para evaluar el porcentaje de células senescentes, que apareció como células azules.
Densitometría y el análisis estadístico
El análisis densitométrico se hizo en los resultados de Western Blot y PCR utilizando imágenes Quantity One software (BioRad) para determinar la abundancia de proteínas o amplificado ARNm estudiada. En ambos casos, GAPDH se utilizó como control. En los ensayos de curación de heridas, área de la herida fue la medida con el uso de software ImageJ. Cierre de la herida se evaluó comparando el área de la herida en un tiempo dado a la zona inicial de la herida. La comparación entre los tratamientos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 5.00 (San Diego, CA) a través de una vía ANOVA y análisis de la
hoc
después de la prueba de Tukey. La significación estadística fue aceptada cuando p & lt; 0,05. Todos los experimentos realizados en este estudio se repitieron tres veces independientes.
Resultados
Resveratrol induce la muerte celular en células de cáncer de ovario
Tratamiento de A2780 y células de cáncer de ovario A2780CP con resveratrol aumentó la muerte celular de una manera dependiente de la dosis como se muestra por la proporción de células PI-positivo. La baja proporción de tinción con anexina-V en muestras tratadas con resveratrol, pero no en muestras tratadas con cisplatino sugiere que el resveratrol puede inducir la muerte celular a través de un mecanismo diferente o producirse más rápido que la muerte celular inducida por cisplatino (Figura 1).
niveles de muerte celular se evaluó mediante citometría de flujo con anexina-V y tinción PI en las células A2780 y A2780CP. flujo Representante citometría resultados se muestran para A2780 (A) y las células A2780CP (B) tratados con 10 M de cisplatino y 40 M Resveratrol. En la esquina superior derecha, se muestra el porcentaje de muerte celular, lo que corresponde a la muerte de las células apoptóticas y necróticas. Anexina-V y las células negativas PI (B3) son no apoptótica. células negativas positivas y PI Anexina-V (B4) están en las primeras etapas de la apoptosis. células positivas positivas y PI Anexina-V (B2) son a finales de la apoptosis. células positivas negativas y PI Anexina-V (B1) son células necróticas. porcentaje de muerte de la célula se muestra en (C) para ambas líneas celulares tratadas con dosis crecientes de Resveratrol hasta 60 mM con o sin cisplatino 10 mM. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes. En los gráficos, columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05). En los gráficos, maquetas: las células no tratadas, R20: El resveratrol 20 mM, R40: El resveratrol 40 M, R 60: El resveratrol 60 M, CP: Cisplatino, R20CP: Resv. 20 M + cisplatino, R40CP: Resv. 40 M + cisplatino, R60CP: Resv. 60 M + cisplatino.
Hemos investigado la apoptosis y la autofagia como posibles mecanismos de muerte celular. En las células A2780, cisplatino induce un aumento de la caspasa-3 y PARP de escisión, lo que indica la inducción de la muerte celular a través de apoptosis. Por el contrario, el tratamiento de células A2780 o A2780CP con Resveratrol no afectó los niveles de caspasa-3 escinde pesar de la presencia de células muertas, el fortalecimiento de la posibilidad de que un mecanismo distinto de la apoptosis está implicada (Figura 2). a continuación, se decidió estudiar la inducción de la autofagia mediante la evaluación de los niveles de expresión de LC3B-II y Beclin-1, dos proteínas conocidas por su participación en la progresión de la autofagia. El resveratrol causó un aumento en los niveles de LC3B-II en ambas líneas celulares, apoyando los resultados de Opipari
et al
. que muestra la autofagia como un mecanismo potencial responsable de la muerte celular Resveratrol inducida por [25]. En nuestro modelo, no se observó un aumento en los niveles de Beclin-1, que ya se expresa en niveles relativamente altos en líneas celulares A2780 y A2780CP.
El mecanismo de muerte celular se estudió en células A2780 y en A2780CP respuesta a cisplatino y el Resveratrol. La ausencia de aumento en los niveles de PARP escindida y la caspasa-3 escisión cuando se utilizan dosis más altas de resveratrol sugiere Resveratrol podría inducir la muerte celular a través de un mecanismo independiente de la apoptosis. El aumento significativo en LC3BII sugiere resveratrol podría inducir la muerte celular a través de la autofagia. análisis de densitometría se muestra debajo de Western Blot para cada línea celular. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes. En los gráficos, columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05). En los gráficos, maquetas: las células no tratadas, R40: El resveratrol 40 M, CP: Cisplatino, R20CP: Resv. 20 M + cisplatino, R40CP: Resv. 40 M + cisplatino, R60CP: Resv. 60 M + cisplatino.
El resveratrol potencia la disminución inducida por cisplatino en la proliferación celular
A continuación trató de evaluar el efecto del resveratrol sobre la proliferación de líneas celulares A2780 y A2780CP. Como se muestra en la Figura 3, bajas dosis de resveratrol (20-40 M) se incrementa ligeramente la proliferación de ambas líneas celulares a pesar de la muerte celular asociada a este tratamiento. A la dosis más alta probada (60 M) Resveratrol induce una ligera disminución en la proliferación en las células A2780 y casi ningún cambio en las células A2780CP. En las células A2780 cisplatino sensibles, Resveratrol potencia la disminución de la proliferación celular observada cuando el cisplatino se utiliza como tratamiento de lo que sugiere una acción sinérgica entre estos dos compuestos. Esto no se observó en las células resistentes al cisplatino A2780CP pero la dosis más alta Resveratrol no aumentó la proliferación cuando se usa en combinación con cisplatino.
ensayo de MTT se realizó para evaluar la proliferación de células A2780 y A2780 líneas en respuesta a 10 mM cisplatino y el aumento de dosis de hasta 60 M de Resveratrol. células A2780 proliferación se incrementó en Resveratrol a 20 M y se redujo a 60 micras, mientras que todas las dosis sugieren un aumento de la proliferación en las células A2780CP. El resveratrol también potencia la disminución de la proliferación de cisplatino en las células A2780. Gráfico de barras con letras diferentes son estadísticamente diferentes (p & lt; 0,05). En los gráficos, maquetas: las células no tratadas, R20: El resveratrol 20 mM, R40: El resveratrol 40 M, R 60: El resveratrol 60 M, CP: Cisplatino, R20CP: Resv. 20 M + cisplatino, R40CP: Resv. 40 M + cisplatino, R60CP: Resv. 60 M + cisplatino.
El resveratrol inhibe la inducción de la EMT mediada por cisplatino en líneas celulares de cáncer de ovario
Para evaluar los efectos del resveratrol sobre la EMT inducida por cisplatino, las células A2780 y A2780CP fueron co tratadas con resveratrol y cisplatino. Como era de esperar, el tratamiento de las células con cisplatino aumentó los niveles de proteína de caracol, vimentina y ZEB1, tres de los principales marcadores de EMT. El tratamiento de las células con cisplatino y Resveratrol disminución de los niveles de expresión de caracol, pero no mostraron este efecto en vimentina y expresión ZEB1. Por el contrario, estas dos proteínas se aumentaron ligeramente cuando las células fueron expuestas a Resveratrol sola (Figura 4A). La disminución en los niveles de caracol en A2780 tratado con resveratrol y cisplatino se correlaciona con una disminución en Snail mRNA levels.However, este no fue el caso en células A2780CP donde se observó ningún cambio significativo en los niveles de ARNm de caracol entre muestras tratadas con cisplatino y los tratados con tanto el cisplatino como el resveratrol, lo que sugiere algunos mecanismos después de la traducción también podrían estar involucrados en la regulación por disminución del caracol en estas células (Figura 4B). los niveles de mRNA ZEB1 y vimentina permanecieron mayormente sin cambios en las células tratadas con resveratrol, cisplatino o ambos agentes. En nuestro modelo de celular, no pudimos evaluar la progresión de la EMT en base a la regulación por disminución de la E-cadherina, porque las células A2780 y A2780CP no expresan esta proteína
.
El análisis de Western Blot de la EMT marcadores Caracol, vimentina y ZEB1 en A2780 y A2780CP células (a) en respuesta a 10 micras cisplatino con o sin aumento de las dosis de resveratrol. El análisis densitométrico se muestra debajo de cada línea celular Western Blots. Resveratrol inhibe la expresión de Snail inducida por cisplatino en una forma dependiente de la dosis, pero aumenta ligeramente ZEB1 y los niveles de Vimentina. La disminución dependiente de la dosis de resveratrol en los niveles de P-Erk2 sugiere la participación de la vía ERK en resveratrol inducida regulación a la baja del caracol. Los marcadores de EMT caracol, vimentina y de expresión ZEB1 se analizaron por RT-PCR en las células A2780CP (B) tratados con 10 micras cisplatino con o sin aumento de las dosis de Resveratrol A2780 y. El resveratrol o cisplatino tratamiento no tuvo ningún efecto sobre los niveles de ARNm ZEB1 y vimentina. Vimentina y densitometría ZEB1 se muestra debajo de cada línea celular. la expresión de Snail ARNm se redujo sólo en las células A2780, lo que sugiere otro mecanismo podría estar implicado en las células A2780CP. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos independientes. En los gráficos, columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05). En los gráficos, maquetas: las células no tratadas, R40: El resveratrol 40 M, CP: Cisplatino, R20CP: Resv. 20 M + cisplatino, R40CP: Resv. 40 M + cisplatino, R60CP: Resv. 60 M + cisplatino.
La activación de la MAPK Erk se asocia con inducida por cisplatino EMT
A continuación se investigó el mecanismo por el cual el resveratrol contrarresta la expresión de Snail inducida por cisplatino. La vía MAPK /ERK es uno de los posibles mecanismos que pueden estar involucrados en la inducción de EMT en las células. En las células A2780 y A2780CP, Erk2 fosforilación se aumentó en respuesta a cisplatino. La activación de esta vía se inhibió significativamente por el resveratrol, que corresponde a una disminución en los niveles de caracol en líneas de células A2780 y A2780CP (Figura 4). Para confirmar aún más la participación de Erk en el aumento de los niveles de caracol en respuesta a cisplatino, se utilizó U0126, un MEK1 /2 inhibidor específico (Figura 5). El pretratamiento de las células con este inhibidor redujo significativamente los niveles de activación de ERK2 en células A2780 y A2780CP, que también se correlacionaban con una disminución significativa de la proteína Snail en ambas líneas celulares. ligeros aumentos en los niveles de proteína de vimentina y ZEB1 también se observaron (Figura 5A). los niveles de ARNm de Snail se redujeron cuando ambas líneas de células fueron tratados con cisplatino y U0126, lo que sugiere la expresión de Snail inducida por cisplatino través de la vía Erk requiere la transcripción del gen Snail. los niveles de mRNA ZEB1 y vimentina no mostraron cambios significativos cuando las células A2780 y A2780CP fueron tratados con cisplatino y U0126 solo o en combinación (Figura 5B). Estos resultados apoyan la inhibición EMT resveratrol inducida a través de la vía ERK.
A2780 y celulares A2780CP líneas fueron pre-tratados con U0126 para inhibir la actividad de ERK y tratados con cisplatino durante 24 h. Western Blot se muestra en (A). densitometría correspondiente se muestra debajo de cada línea celular. inhibición Erk reduce la expresión de Snail inducida por cisplatino pero aumentó ligeramente ZEB1 y la expresión de vimentina en ambas líneas celulares. Los correspondientes resultados de la PCR se muestran en (B). Caracol ARNm disminución en las muestras tratadas U0126 + cisplatino sugiere una regulación del caracol por cisplatino implica la transcripción de genes. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes. En los gráficos, columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05). En los gráficos, maquetas: las células no tratadas, CP: Cisplatina, U + CP:. U0126 + cisplatino
cambios morfológicos inducidos por el cisplatino Resveratrol bloques
Con el fin de evitar una excesiva citotoxicidad inducida por cisplatino en las células A2780, decidimos utilizar 2,5 M cisplatino para evaluar los cambios morfológicos en las células A2780 y A2780CP para un tratamiento de 72 h. El tratamiento de células de cáncer de ovario con cambios morfológicos inducidos por el cisplatino que recuerdan a EMT como las células epiteliales perdieron su morfología de adoquines-como para adquirir una forma similar a fibroblastos más alargada. protusiones celulares también aparecieron en las células tratados con cisplatino en comparación con las muestras de control. Tanto las células A2780 y A2780CP mostraron estas modificaciones con indicación de su progresión a través de la EMT. Para probar el efecto del resveratrol sobre este fenómeno, hemos utilizado 60 micras, la concentración a la que Snail downregulation era el más evidente. La adición de resveratrol a un tratamiento cisplatino bloqueado estos cambios morfológicos como las células no adquirieron ninguna de las características morfológicas mesenquimales característicos (Figura 6). También es interesante observar que las células tratadas con resveratrol se hicieron más grandes y se muestran una apariencia irregular lo que sugiere otra transformación celular, tal como un programa de senescencia, podría estar ocurriendo [26].
A2780 (A) y A2780CP (B líneas de células) fueron tratados durante 72 horas con 2,5 m de cisplatino con o sin 60 micras resveratrol para permitir EMT cambios morfológicos que se hacen evidentes. El cisplatino indujo cambios morfológicos celulares que recuerdan de EMT en las células A2780 evidentes después de 72 h, que se derogarse cuando se añadió Resveratrol al tratamiento. Resveratrol ejerce el mismo efecto en las células A2780CP aunque los cambios morfológicos inducidos por el cisplatino fueron menos pronunciadas. Las células se observaron bajo 20 aumentos, barra de escala en la esquina superior izquierda de las imágenes representan 20 micras. Las flechas indican ejemplos de células que hayan sufrido un EMT. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos independientes.
El resveratrol induce la senescencia
Se evaluó la inducción de la senescencia en nuestras líneas de células después del tratamiento con cisplatino y el resveratrol y observó un aumento significativo en la senescencia resveratrol inducida en ambas líneas celulares después de 72 h, con un efecto más pronunciado en las células A2780 (Figura 7). También observamos los niveles más altos de senescencia en células A2780 tratados con cisplatino y sugieren que la exposición continua a cisplatino podría inducir un estrés oxidativo que conduce a la senescencia en estas células cisplatino-sensibles. la inducción de senescencia en células A2780 y A2780CP podría ser otro mecanismo implicado en la inhibición de la EMT inducida por cisplatino por Resveratrol
.
El tratamiento de células A2780 y A2780CP con resveratrol aumentó significativamente la proporción de células senescentes. El cisplatino indujo un aumento significativo de la senescencia en células A2780. Las células se tiñeron para la actividad de β-galactosidasa y se contaron bajo un microscopio de luz para evaluar el porcentaje de células senescentes (azul). En los gráficos, columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05). El análisis se realizó con tres experimentos independientes.
El resveratrol inhibe la migración de células
Teniendo en cuenta la transformación morfológica que ocurren en las células A2780 y A2780CP, el próximo evaluó la capacidad de migración de estas células con una herida ensayo de curación. Las células se trataron con 2,5 M de cisplatino, para evitar la citotoxicidad excesiva en las células A2780, y 60 mu M Resveratrol. En ambas líneas celulares, se requirieron 72 h para la herida para cerrar completamente en las células no tratadas, lo que sugiere que estas líneas celulares no tienen un fenotipo muy móvil. tratamiento Resveratrol claramente la migración celular inhibida en cada punto de tiempo en el que se evaluó cierre de la herida, reduciendo el cierre de la herida a sólo el 20-25% después de 72 h para las dos líneas celulares, mientras que las células control habían cerrado casi completamente las heridas (Figura 8A y 8B). La acción de resveratrol no se vería afectada por el cisplatino en las células A2780CP donde este agente ejerce el mismo efecto sobre las células con o sin cisplatino.
La capacidad migratoria de A2780 (A), A2780CP (B), OVCAR-3 ( células C), y SKOV-3 (D) se evaluó mediante el ensayo de curación de la herida. Un cero se hizo con una punta estéril en una capa confluente de células y se observó el cierre de heridas después de 24, 48, y 72 h de tratamiento cisplatino y el Resveratrol para A2780, A2780CP, y OVCAR-3 células, y 12 y 24 h para SKOV -3, correspondiente a el momento en que la herida estaba casi completamente cerrado. En ambas líneas celulares, el resveratrol redujo la migración de las células en la herida, impidiendo su cierre después de 72 h. cuadros representativos se muestran en t = 48 h. Representación gráfica de cierre de la herida después de que los diferentes puntos de tiempo estudiados se muestra en (E). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes realizados por duplicado. En los gráficos, los tratamientos se compararon dentro de cada punto de tiempo estudiados y columnas identificadas con letras diferentes son significativamente diferentes (p & lt; 0,05).
Además, se investigó el potencial del resveratrol para inhibir la capacidad de migración de OVCAR -3 células, una línea de células epiteliales que expresan e-cadherina y sin expresión basal de ZEB1 o vimentina que muestra poco potencial de migración, y Skov-3 células, una línea de células mesenquimales que muestra la expresión basal de vimentina y ZEB1, así como una morfología mesenquimal y alto potencial migratorio a pesar basal de expresión de E-cadherina (Figura S1). Similares a las células A2780 y A2780CP, las células OVCAR-3 requieren al menos 72 h para cerrar la herida. En esta línea celular, el resveratrol redujo significativamente el cierre de la herida después de 72 h y en cada punto de tiempo estudiado cuando se usa en combinación con cisplatino. En células SKOV-3, sólo se requirieron 24 h para observar cierre de la herida 80 a 85% y el resveratrol redujo significativamente la migración de estas células cuando se usa solo o en combinación con cisplatino en este punto de tiempo, lo que indica que esta fitoalexina posee la capacidad de reducir la migración de las células que poseen un potencial de migración basal alta, así como células con bajo potencial de migración (Figura 8C y 8D). Resultados observados en las células OVCAR-3 y SKOV-3 se correlacionan con los observados en A2780 y A2780CP respectivamente, donde la sensibilidad al cisplatino es también similar.
Para hacer frente a la posibilidad de un aumento en el potencial de invasión de las células, se realizó un ensayo de zimografía en A2780.