Extracto
Phyllanthus watsonii
de Airy Shaw es una planta endémica que se encuentra en la península de Malasia. Aunque existen numerosos informes sobre las propiedades contra el cáncer de otros
Phyllanthus
las especies, publicado información sobre la citotoxicidad de
P. watsonii ¿Cuáles son muy limitadas. El presente estudio se llevó a cabo con el método de fraccionamiento guiado por bioensayo para evaluar la capacidad de inducción de citotoxicidad y apoptosis de la
P. watsonii
extractos y fracciones en ginecológico humana (Skov-3 y Ca esquí) y colon (HT-29) las células cancerosas.
P. watsonii
extractos mostraron una fuerte citotoxicidad en todas las células cancerosas estudiadas con IC
50 valores de ≤ 20,0 mg /ml. extracto de hexano de
P. watsonii
se sometió adicionalmente a fraccionamiento guiado por bioensayo y se obtuvieron 10 fracciones (PW-1 → PW-10). PW-4 → PW-8 retratado actividad citotóxica más fuerte y se sometió adicionalmente a fraccionamiento guiado por bioensayo y dio con 8 sub-fracciones (PPWH-1 → PPWH-8). PPWH-7 poseía mayor citotoxicidad (IC
50 valores osciló 0,66-0,83 g /ml) y era selectivo en las células de cáncer estudiados. análisis de LC-MS /MS de PPWH-7 reveló la presencia de ácido elágico, ácido geránico, glochidone, betulina, phyllantinas y glucósido de esterol. cambios morfológicos marcados, el aspecto de escalera de ADN y el incremento en la actividad de la caspasa-3 que indican la apoptosis se observaron claramente en ambas células ginecológicos y de cáncer de colon humano tratados con
P. watsonii
especialmente con PPWH-7. El estudio también indicó que
P. watsonii
extractos detenidos ciclo celular en diferentes fases de crecimiento en Skov-3, Ca esquí y las células HT-29. Potencial citotóxico y apoptótico de la
P endémica. watsonii
se investigó por primera vez por el enfoque guiado por bioensayo. Estos resultados demostraron que
P. watsonii
inhibe selectivamente el crecimiento de SKOV-3, Ca de esquí y las células HT-29 a través de la inducción de apoptosis y la modulación del ciclo celular. Por lo tanto,
P. watsonii
tiene el potencial para ser explotado aún más por el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos contra el cáncer
Visto:. Ramasamy S, Abdul Wahab N, Zainal Abidin N, S Manickam, Zakaria Z (2012) Crecimiento La inhibición de Ginecología humanos y células del cáncer de colon por
Phyllanthus watsonii
través de la apoptosis de inducción. PLoS ONE 7 (4): e34793. doi: 10.1371 /journal.pone.0034793
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Septiembre, 2011; Aceptado: March 8, 2012; Publicado: 20 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Ramasamy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación de Postgrado (PPP) Subvenciones UM 524 PS130 /2008A y UM PS307 /2010A, financiado por la Universidad de Malaya. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hay una larga historia en el uso de las plantas en los países del sudeste asiático, algunos de los cuales se han demostrado poseer actividades biológicas interesantes con potenciales aplicaciones terapéuticas [1]. El uso de plantas como la medicina ha dado como resultado el aislamiento y caracterización de compuestos farmacológicamente activos [2] y en la actualidad hay al menos 120 sustancias químicas distintas derivados de plantas que son consideradas como medicamentos importantes y los ingredientes activos en la industria farmacéutica [3].
el cáncer es una de las principales causas de muerte en los países desarrollados y en desarrollo y sigue siendo un problema importante de salud pública en muchas partes del mundo [4]. Se ha hecho mucho esfuerzo para desarrollar diversos enfoques para reducir la amenaza causada por el cáncer y sólo un modesto progreso se ha hecho en la reducción de la morbilidad y la mortalidad de esta terrible enfermedad [5]. De acuerdo con el informe del cáncer mundo publicado por la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer, a nivel mundial había 12,4 millones de nuevos casos de cáncer en 2008 (6.672 millones de hombres y 5.779.000 en las mujeres) y 7,6 millones de muertes por cáncer (4.293 millones de hombres y 3,3 millones de mujeres) [6]. En la actualidad, el tratamiento del cáncer por agentes de quimioterapia, la cirugía y la radioterapia no han sido plenamente eficaz contra la alta incidencia o la baja tasa de supervivencia de la mayoría de tipos de cáncer [7]. La búsqueda de nuevos agentes contra el cáncer de origen vegetal es uno de los enfoques realistas y prometedores en el campo de la quimioprevención del cáncer y esto llevó al descubrimiento de muchos nuevos fármacos contra el cáncer, incluyendo alcaloides de la vinca, vinblastina y vincristina, taxol, camptotecinas, y podofilotoxinas [8]. Enfoques También se han tomado hacia el descubrimiento de agentes contra el cáncer a partir de plantas tropicales [2] como remedios alternativos para el cáncer debido a su baja toxicidad y costes [9].
Durante las últimas décadas, muchos estudios han indicado que el mecanismo de la acción de muchos fármacos contra el cáncer se basa en la inducción de la apoptosis, y abriendo así una nueva estrategia en la búsqueda de fármacos contra el cáncer [10]. Una inducción de apoptosis es una característica muy deseable de la estrategia de tratamiento para el control del cáncer, lo que es importante para detectar los inductores de apoptosis de las plantas, ya sea en forma de extractos brutos o compuestos como componente [11]. Este tipo de estudios se deben hacer mediante la evaluación de la citotoxicidad y la inducción de apoptosis en líneas celulares de cáncer antes de los estudios en animales enteros o ensayos clínicos se llevaron a cabo.
Phyllanthus watsonii
de Airy Shaw es un pequeño arbusto que crece a aproximadamente 1 m de altura y pertenece a la familia Phyllanthaceae (Figura 1). La especie es endémica de una estrecha y sólo se sabe que se produce desde el norte hasta el sur de Johor Pahang (dos estados de la península de Malasia) en las orillas del río Endau [1], [12]. Un número de estudios han demostrado que los extractos y compuestos derivados de otro
Phyllanthus
especie podría suprimir el crecimiento de diversos tipos de cáncer incluyendo cervical [13]; hígado [14], de pulmón [15], los macrófagos [16], uterino, gástrico [17], de mama y cáncer de colon [18]. Sin embargo, no había sido detallado estudio realizado para evaluar el efecto citotóxico y apoptóticos de
P. watsonii
en líneas celulares de cáncer humano, con excepción de un solo informe que demuestran el efecto del extracto acuoso y metanol de
P. watsonii
contra las células de melanoma de piel Mewo y células PC-3 con cáncer de próstata [19]. Los estudios Phytochemistry revelaron la presencia de dos nuevas nor-triterpenos insaturados (26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3-ona y 26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3beta-ol), palmitato lupenyl, friedelina, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, LUP-20 (29) -en-1 beta, 3 beta-diol, sitosterol y sitosterol-beta (D) glucósido en
P. watsonii
[20].
El presente estudio se llevó a cabo para evaluar el potencial citotóxico de metanol, hexano y acetato de etilo extractos de
P. watsonii
contra ginecológico humanos y líneas celulares de cáncer de colon. MRC-5, también se utilizó una línea celular de fibroblastos de pulmón humano normal para determinar la especificidad de los extractos de las células cancerosas. Células MRC-5 se han usado comúnmente como un control en muchos estudios similares [21] - [23]. fraccionamiento guiado por bioensayo también se llevó a cabo con el fin de determinar los metabolitos secundarios bioactivos con propiedades citotóxicas. Hasta donde sabemos, esta será la primera vez que este tipo de extractos y fracciones de
P. watsonii
se están probando en contra de estas líneas celulares. Además también se investigó el proceso de apoptosis asociada con el efecto citotóxico de estas células.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los permisos y permisos necesarios para la recogida de los materiales eran obtenido para los estudios de campo descritas y la parte involucrada está debidamente reconocido. Las especies (
Phyllanthus watsonii
) está situado en el Parque Nacional Endau Rompin que pertenece al gobierno del estado de Johor y gestionado por el Johor Nacional de Parques Corporation (JNPC), Malasia. La especie no está en peligro y el hábitat no se vea amenazada y tampoco aparece en los apéndices de CITES (Convención sobre el comercio internacional de especies amenazadas de fauna y flora silvestres).
Materiales plantas
Las hojas de
Phyllanthus watsonii
se obtuvieron de Parque Nacional Endau Rompin, Johor (Malasia peninsular) en junio de 2008. La autentificación de
P. watsonii
se llevó a cabo en el herbario del Jardín Botánico Rimba Ilmu, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Malasia y un material de vales (Ref. Nº KLU46068) para este estudio fue depositado en la misma herbario.
Preparación de extractos de
P. watsonii
Las hojas secas de
P. watsonii
(PW) (2 kg) se trituraron y se extrajo con metanol (MeOH) (Fisher Scientific, Reino Unido) (6 L x 3 veces) a temperatura ambiente durante 72 horas y se filtra a través de Whatman No. 1 de papel de filtro (Whatman , Inglaterra). El filtrado se recogió y el exceso de MeOH disolvente se evaporó a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio (Büchi, Suiza) a 40 ° C a sequedad produciendo 160,3 g de extracto de MeOH oscuro-verdoso (PW-M). Parte del extracto de MeOH se reservó para el ensayo, mientras que la parte restante se agitó aún más vigorosamente con hexano (Fisher Scientific, Reino Unido) hasta que el hexano resultante se hizo casi incoloro. El hexano solución soluble se filtró y se agruparon, seguido de concentración a presión reducida mediante un evaporador rotatorio para dar 6,5 g de extracto de hexano (PW-H). El insoluble hexano restante se sometió a disolvente-disolvente de extracción con una mezcla de acetato de etilo (EtOAc) (Fisher Scientific, Reino Unido) y agua destilada (01:01, v /v) seguido de la mezcla bastante vigorosa. Esta mezcla se fraccionó sucesivamente utilizando un embudo de separación en el que formaron dos capas distintas. Se desechó la capa inferior (capa de agua), mientras que la fase de EtOAc (capa superior) se libera en un vaso de precipitados limpio. Este filtrado se concentró a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para dar 9,7 g de extracto de EtOAc (PW-E). En todos los experimentos, los extractos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma) como solución madre y se almacenaron a -20 ° C. Antes del análisis, la concentración final de cada muestra se preparó por dilución de la solución madre en DMSO al 10%. La concentración final de DMSO en el cultivo celular era & lt; 0,5%. PW-M, PW-H y PW-E de
P. watsonii
fueron sometidos adicionalmente a ensayo de captación del rojo neutro de acuerdo con los procedimientos descritos más adelante. PW-H se encontró citotoxicidad para exhibir más fuerte en comparación con el PW-H y PW-E y garantiza una mayor investigación.
El fraccionamiento guiado por bioensayo de PW-H
La fracción citotóxica activa de PW -H (6,1 g) se cromatografió en una columna (4 cm de DI x 40 cm de longitud) empaquetada con gel de sílice 60 F254, el espesor de 0,25 mm (Merck, Darmstadt, Alemania) (160 g). Gradiente de elución paso comenzó con 100% de hexano y la polaridad de disolvente de elución se aumentó gradualmente el uso de acetona (Me
2CO) (Fisher Scientific, Reino Unido) y MeOH. Eluyentes de un volumen de 25 ml se recogieron en viales numeradas. La separación de cada eluyente se controló por cromatografía en capa fina pre-recubierta (TLC) de gel de sílice 60 F254 placa utilizando n-hexano /acetona (20:80, v /v) como se detectaron en desarrollo a las zonas de disolvente y el TLC después de la pulverización con
p
reactivo de anisaldehído y calentamiento a 105 ° C durante 5 - 10 minutos a. Los eluyentes se agruparon de acuerdo a la similitud de la composición química detectada en TLC y el exceso de disolvente se evaporó a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para dar un total de 10 fracciones designadas como PCH-1, PCH-2, PCH-3, ... ...., PCH-8, PCH-9 * y * PCH-10 (Figura 2). Las fracciones PCH-9 * y PCH-10 * se encontró que contienen gel de sílice y se disolvieron más en cloroformo y se filtra a través de Whatman No. 1 de papel de filtro (Whatman, Inglaterra) para eliminar el sílice. Las fracciones PCH-9 y PCH-10 se obtuvieron después de eliminar el exceso de disolvente por evaporación a sequedad a 40 ° C bajo presión reducida en un evaporador rotatorio. Todas las fracciones se someten además a Ensayo de absorción de rojo neutro (procedimientos descritos más adelante) y las fracciones PWH-4, ... .., PWH-8 revelado como las fracciones más activas en la actividad citotóxica.
Estas fracciones (PCH-4, ... .., PCH-8) (581,0 mg) se combinaron y se purificó adicionalmente por cromatografía en columna de sílice (2,6 cm de longitud de DI x 60 cm) rellena con gel de sílice 60 F254, el espesor de 0,25 mm (Merck, Darmstadt, Alemania) (160 g). La elución se inició con 100% de hexano y la polaridad del disolvente de elución se aumentó gradualmente el uso de Me
2CO y MeOH. Eluyentes de 25 ml de volumen se recogieron en viales numeradas. La separación de cada eluyente se controló por cromatografía en capa fina pre-recubierta (TLC) de gel de sílice 60 F254 placa utilizando n-hexano /acetona (20:80, v /v) como disolvente de desarrollo y se detectaron las zonas de TLC después de la pulverización con
p
reactivo anisaldehído y calentamiento a 105 ° C durante 5 a 10 min. Los eluyentes se agruparon de acuerdo a la similitud de la composición química detectada en la TLC y el exceso de disolvente se evaporó a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio para dar un total de 8 subfracciones designados como PPWH-1, PPWH-2, ... .. , PPWH-8. Los sub-fracciones se sometieron a ensayo de captación del rojo neutro como se describe más adelante. El perfil del sistema disolvente y el rendimiento de cada uno de fracciones y subfracciones obtenidos se resumen en la Tabla 1.
A continuación, extractos citotóxicamente activos (PW-M, PW-H y PW-E) y la mayoría sub-fracción activa se seleccionaron (PPWH-7) y se evaluó su efecto apoptótico hacia las líneas celulares de cáncer de colon y ginecológicas más.
CLEM-MS Análisis
El sub-fracción más activa, PPWH-7 se analizó por el sistema de LC-MS /MS equipado con el 3200 QTrap espectrómetro de masas (Applied Biosystem, Darmstadt, Alemania) y el sistema de Shidmazu UHPLC. La separación cromatográfica se realizó en un 50 mm x 2,0 mm x 5 M columna de Aqua C18 (Phenomenex, Torrance, CA), se eluyó con una fase móvil que consiste en agua (A) y acetonitrilo (B) que contiene ácido fórmico 0,2% y 2 mM formiato de amonio. Una elución en gradiente (a partir de 10% de A a 90% de B, a partir de 0,01 min a 10,0 min, mantener durante 2 min y de nuevo a 10% de A en 0,1 min y se volvió a equilibrar durante 5 min) se utilizó para separar la compuestos de interés antes del análisis de espectro de masas. El análisis del espectrómetro de masas se realizó en un modo de ión positivo (
m /z
M + H
+) para la detección de compuestos secundarios. Las identidades de los compuestos se obtuvieron haciendo coincidir sus iones moleculares (
m /z
) obtenido por LC-MS /MS con patrones de referencia si se conoce y por correlación con los datos previos publicados sobre los constituyentes químicos de
Phyllanthus
[24] - [30]
Cell Cultura y
Las líneas celulares humanas Skov-3 (línea celular de carcinoma de ovario), Ca Ski (carcinoma epidérmico de la línea de células de cuello uterino), HT. -29 (línea celular de cáncer de colon) y MRC-5 (línea celular de fibroblastos de pulmón normal) fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC), EE.UU.. SKOV-3 células se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) (Sigma, Reino Unido), mientras que HT-29, Ca esquí y MRC 5-células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma, Reino Unido) y medio DMEM (Sigma, Reino Unido ), respectivamente. Todos los medios se complementaron con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (PAA Lab., Austria), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PAA Lab., Austria) y las células se se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 en un ambiente humidificado (Shel Lab., EE.UU.).
Neutro captación del rojo (NRU) Ensayo
La citotoxicidad de
PAG. watsonii
extractos, fracciones y subfracciones se midieron mediante ensayo Neutral Red Uptake (NRU), que se basa en la absorción y posterior lisosomal acumulación del colorante supravital, rojo neutro en las células viables y no lesionados. La cuantificación del colorante extraído de las células se ha demostrado que es lineal con el número de células, tanto por recuento directo de células y por determinación de proteínas de la población de células [31]. Las células se sembraron en una placa de titulación de 96 pocillos micro (Nunc, Dinamarca) a una concentración de 30.000 células /ml y se colocaron en un CO
2 incubadora a 37 ° C para permitir que las células se adhieran antes de la adición de los extractos , fracciones y subfracciones de
P. watsonii
. Después de 3 horas, las células se trataron con extractos y fracciones de
P. watsonii
en seis concentraciones diferentes, es decir, 1, 10, 25, 50, 75 y 100 mg /ml y se incubaron durante 72 horas. Los pocillos que contenían células sin tratar (sin adición de cualquier extracto) fueron considerados como un control negativo, mientras que las células tratadas con doxorrubicina (0,5 a 10 mg /ml) sirvió como control positivo. Al final del periodo de incubación, el medio se reemplazó con medio que contiene 50 solución mg /ml Neutral Red (NR) (50 mg /ml NR en medios de cultivo, 24 horas pre-incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente y centrifugar a 1500 g durante 10 min antes de su uso) y se incubaron durante 3 horas para permitir la captación del colorante vital en los lisosomas de células viables y no lesionados. Después se retiró el medio y las células se lavaron rápidamente con la mezcla de cloruro de calcio-formaldehído. El medio de contraste dentro de las células viables se eluyó de las células con una mezcla de ácido acético, etanol y agua (01:50: 49) (0,2 ml). Las placas se agitaron en un agitador de placas de micro título (LT BioMax 500) durante 30 min y luego la absorbancia contra una referencia en blanco se midió a 540 nm usando un lector de micro placa (Emax, Molecular Devices, EE.UU.).
absorción de RN, proporcional al número de células viables dentro del pozo, se expresó como un porcentaje de absorción por las células de control [(OD
control - OD
muestra) /(OD
control) x 100%] . IC
50 valores (concentración requerida para reducir la viabilidad de las células en un 50% en comparación con las células de control) para cada extracto se extrapola a partir de los gráficos trazan usando los valores de DO obtenidos. Con el fin de investigar si la actividad citotóxica fue específica a las células cancerosas, la actividad citotóxica de los extractos, fracciones y sub-fracción se ensayó y se determinó el índice de selectividad (SI) de extracto activo. El índice de selectividad (SI) de los extractos se define como la relación de la citotoxicidad (IC
50 valores) en fibroblastos de pulmón normales (MRC-5) las células a células cancerosas (SKOV-3, Ca esquí y HT-29). (SI = IC
50 en células MRC-5 /IC
50 en las células cancerosas). Se consideró que las muestras con un SI superior a 3 tener una alta selectividad hacia las células del cáncer [32].
microscopio de detección de apoptosis
evaluación morfológica de las células apoptóticas por contraste de fase invertida.
las células (3 × 10
4 células /ml) se incubaron durante 24 horas en ausencia o presencia de PW-M, PW-H y PW-e de
P. watsonii
y PPWH-7 sub-fracción a concentraciones de 10,0 mg /ml en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Al final del periodo de incubación, se retiró el medio y las células se lavaron una vez con una solución salina tampón fosfato (PBS pH 7,4) y se observó bajo un microscopio Leica DMI 3000B de contraste de fases invertido (Leica Microsystems, Alemania) a 200 × aumentos y fotografiado.
evaluación morfológica de las células apoptóticas por el naranja de acridina (AO) -ethidium bromuro de (EB) doble tinción.
cambios morfológicos celulares se evaluó mediante tinción diferencial utilizando tintes fluorescentes de ADN intercalado, acridina naranja (AO) y bromuro de etidio (EB). Las células (3 x 10
6 células /ml) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos, se trató con PW-M, PW-H y PW-E y PPWH-7 a una concentración de 10,0 mg /ml y se incubaron durante 24 horas. Las células no tratadas se utilizaron como un control negativo. Después de la incubación, el control y las células tratadas se sedimentaron y se suspendieron en 25 l de PBS pH 7,4. Para cada muestra, 1 l de solución de AO /EB; se añadió antes del examen microscópico (1 parte de 100 mg /ml de AO en PBS 1 parte de 100 mg /ml de EB en PBS). La suspensión celular se colocó en un Teflon 3 pocillos recubierta portaobjetos de microscopio, cubierto con un cubreobjetos de vidrio, y se observó y fotografió con una Nikon Eclipse 80i (Nikon, NY) bajo iluminación de fluorescencia con filtros triples (FITC, Cy3 y DAPI) . Las imágenes fueron analizadas por el software de imágenes de Nikon, NIS-Elements (Nikon, Nueva York).
ADN análisis de la fragmentación por electroforesis en agarosa
Las células fueron tratadas en presencia o ausencia de PW-M, PW- H, PW-e y PPWH-7 (1,0, 10,0 y 100,0 mg /ml) durante 48 horas, después se recogieron mediante el uso de tampón de 500 lyses mu l [50 mM Tris-HCl (pH 8,0), mM EDTA 20 (pH 8,0), 1,43 ml de Tergitol
® solución de tipo NP-40, y 20 l de SDS al 10%] a 65 ° C durante 30 minutos en hielo. Los pasos subsiguientes se llevaron a cabo en hielo. se añadieron 100 l de acetato de potasio 8 M a las mezclas en suspensión y se incubaron en hielo durante 1 hora. El sobrenadante se obtuvo por centrifugación de los lisados a 10.000 x g durante 10 min (Heraeus PICO 17, Thermo Scientific, EE.UU.) y las proteínas solubles se extrajeron con fenol /cloroformo /alcohol isoamílico (PCI; 25:24: 1, v /v /v) (Invitrogen Life Technologies). Por último, el ADN se precipitó usando 2 × volumen de etanol absoluto enfriado con hielo. Para realizar el ensayo de fragmentación de ADN, el sedimento de ADN se disolvió en 20 l de tampón TE [10 mM Tris-HCl y EDTA 1 mM, pH 8,0], junto con 1 l de RNAsa (10 mg /ml) y 1 l de proteinasa K (100 mg /ml) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min. la fragmentación del ADN se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Se observaron bandas de ADN y se fotografiaron usando un sistema de documentación de gel de Gene Flash (Syngene Bioimaging, UK). Inducción de la apoptosis está indicada por la aparición de fragmentos de escalera de ADN de aproximadamente 180 a 200 múltiplos pb en el gel de agarosa.
caspasa-3 Ensayo de actividad
Actividad de la caspasa-3 se determinó usando el caspasa -3 /CPP32 kit de ensayo colorimétrico (Biovision, CA) según el protocolo del fabricante. El ensayo se basa en la detección espectrofotométrica del cromóforo,
p
nitroanilida (
p
NA), después de su escisión de sustrato marcado DEVD-
p
NA. Las células (2 × 10
6) se sedimentaron y se lisaron después del tratamiento con la 10 g /ml de PW-M, PW-H y PW-E de
P. watsonii Opiniones y PPWH-7 subfracción durante 48 horas. Los ensayos se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos mediante la incubación de 100 g de proteínas de lisado de células por muestra en 50 l de tampón de reacción de 2 ×. El tampón de reacción se complementa con DTT y sustratos de 4 mM DEVD-pNA 10 mM en un volumen final total de 100 l y se incubó a 37 ° C durante 1,5 horas. Formación de
p
nitroanilida se midió usando el lector de micro-placas de ELISA a una longitud de onda de 405 nm y las actividades de caspasa se expresaron como porcentaje de la actividad enzimática en comparación con el control (células no tratadas).
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
Para comparar los efectos del extracto PW-H y sub-fracción PPWH-7 en el ciclo celular, se utilizó el kit CycleTEST PLUS ™ Reactivo de ADN (Becton Dickinson, EE.UU.). Las células (1 × 10
6 células /ml) se sembraron en una placa de 6 pocillos y se trataron con 10 mg /ml de PW-H y sub-fracción PPWH-7. Después de 24 horas de incubación, se recogieron las células, se llevó a suspensión, se permeabilizaron con tampón de tripsina. El ADN nuclear fue marcado con yoduro de propidio solución de tinción (PI) y se incubó en la oscuridad entre 2 ° a 8 ° C durante 10 min. distribución de fase del ciclo celular de ADN nuclear se determinó por citometría de flujo (Becton Dickinson FACS Calibur, EE.UU.) mediante el análisis de al menos 10.000 células por muestra. El porcentaje de células en G1, S y G2 fases se analizaron mediante el software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME).
Análisis estadísticos
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las diferencias significativas se determinaron mediante el uso de Student
t-test, donde
*
p Hotel & lt; 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa. Todas las muestras se midieron por triplicado.
Resultados
citotoxicidad de
P. watsonii
Extractos-NRU Ensayo
En el presente estudio, los posibles efectos citotóxicos (IC
50) de
P. watsonii
extraer en metanol (PW-M), hexano (PW-H) y acetato de etilo (PW-E), así como las fracciones y subfracciones de PW-H se investigaron en dos células de cáncer ginecológico humanos (SKOV- 3 y Ca de esquí), células de cáncer de colon uno (HT-29) y uno células normales (MRC-5) utilizando el ensayo NRU. Sobre la base de las directrices del Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos, un extracto crudo se considera en general que
in vitro
actividad citotóxica si el IC
50 Valor en células de carcinoma, después de la incubación de entre 48 y 72 horas, es ≤20 g /ml, mientras que para un compuesto puro de la IC
50 valor es ≤4 g /ml [33] - [34]. La actividad citotóxica (IC
50) y el índice de selectividad de los extractos, fracciones y subfracciones se resumen en la Tabla 2. Además, doxorrubicina, un fármaco quimioterapéutico usado comúnmente para el tratamiento de la leucemia aguda, los linfomas y los diferentes tipos de sólido tumores como el de mama, de hígado y de pulmón [35], se utilizó como control positivo en los experimentos.
P. watsonii
extractos exhiben mayor actividad citotóxica en todas las células cancerosas ensayadas donde todos mostraron IC
50 valores de & lt; 20 mg /ml. Se detectaron las actividades citotóxicas más prometedoras y más selectivos en PW-H y PW-E. El IC
50 (/mL mg) y SI valores con PW-H en Skov-3, Ca esquí y las células HT-29 fueron 5,79 ± 0,29 (SI = 9,9), 6,94 ± 0,96 (SI = 8,3) y 11.79 ± 1,61 (SI = 4,9), respectivamente. Considerando que los valores con PW-E fueron 5,52 ± 0,50 (SI = 6,1), 3,58 ± 1,01 (SI = 9,4) y 5,14 ± 0,36 (SI = 6,6), respectivamente. PW-H fue seleccionado para el fraccionamiento guiado por bioensayo como se demostró el efecto citotóxico más fuerte en las células cancerosas y era el menos tóxico sobre las células normales en comparación con PW-M y PW-E. Estos son los criterios considerados normalmente para justificar una purificación adicional del extracto [36].
Ensayo
cromatografía NRU fraccionamiento guiado por bioensayo columna (CC) de la PW-H produjo un total de 10 fracciones. Las fracciones de PW-H demostraron actividad citotóxica más fuerte y una mayor selectividad en comparación con el PW-H en particular cuando se prueba en células SKOV-3 (Tabla 2). En células SKOV-3, las fracciones PWH-4, PWH-5, PWH-6, PWH-7 y PWH-8 exhibieron IC
50 valores de 0,29 ± 0,06 (SI = 56,0), 0,18 ± 0,06 (SI = 68.1), 0.42 ± 0.12 (SI = 18,7), 0,77 ± 0,29 (SI = 10,4) y 0,36 ± 0,12 (SI = 23,0) mg /ml, respectivamente. IC
50 valores obtenidos cuando las células HT-29 Ca esquí y se trataron con las fracciones PCH-4 - PCH-8 eran entre el rango de 2,77 a 13,19 y de 1,21 a 10,78 mg /ml, respectivamente. Las fracciones PWH-4 a PCH-8 se obtuvieron de la parte media de la columna de sílice (hexano /Me
2CO: 40:60 /50:50) y esto demuestra que la presencia de compuestos altamente citotóxicos estaban en el intermedio fase polaridad. Estas fracciones se agruparon y se sometieron a la segunda etapa de fraccionamiento guiado por bioensayo y produjeron 8 subfracciones. PPWH-7 fue el más citotóxico y exhibió una mayor selectividad (SI) en Ca de esquí y las células HT-29 con IC
50 (/mL mg) y SI valores de 0,83 ± 0,00 (SI = 12,8) y 0,83 ± 0,10 ( SI = 12.8), respectivamente (Tabla 2). Por el contrario, purificada subfracción PPWH-7 demostró menor efecto citotóxico y selectividad en Skov-3 células (CI
50 = 0,66 ± 0,06 mg /ml; SI = 15,5) en comparación con las fracciones PCH-4 (IC
50 = 0,29 ± 0,06 mg /ml; SI = 56,0), PCH-5 (IC
50 = 0,18 ± 0,06 mg /ml; SI = 68,1), PCH-6 (IC
50 = 0,42 ± 0,12 g /ml; SI = 18,7) y PCH-8 (IC
50 = 0,36 ± 0,12 mg /ml; SI = 23,0). Vale la pena mencionar que PPWH-7 mostró actividad citotóxica similar a la del medicamento contra el cáncer estándar, doxorubicina, que se utilizó como control positivo en el presente estudio. Sin embargo doxorrubicina también exhibió una alta toxicidad en 5 MRC células normales mientras que PPWH-7 mostró toxicidad aproximadamente 6 veces menor en las células normales MRC-5.
LCMS /MS Análisis
PPWH subfracción -7 se analizó por LC-MS sistema /MS y al menos 15 compuestos estaban presentes en PPWH-7 de los cuales se identificaron 7 compuestos con tiempos de retención de los picos principales a través de espectrometría de masas (Tabla 3). Un ejemplo del análisis de LC-MS /MS que muestra un cromatograma espectros completo positiva de uno de los compuestos detectados (ácido elágico en sub-fracción PPWH-7) en un modo de iones positivos (modo EPI) se muestra en la figura 3. La mayor pico con un tiempo de retención de 13,99 min fue identificado como éster metílico de ácido geraiinic (MS
m /z = 397
), y phyllantinas de potasio (MS
m /z = 457
). Phyllantinas también fue identificado como phyllantinas de sodio (MS
m /z = 441
) en un tiempo de retención de 11,66 min. Otro pico principal fue identificado como glucósido de esterol (MS
m /z = 718
), un isoprenoides en el tiempo de retención de 9,39 min. Dos triterpeno se eluyeron a un tiempo de retención de 10,20 min y 13,45 min y se identificaron como glochidone (MS
m /z = 423
) y betulina (MS
m /z = 443
), respectivamente . Un compuesto polifenólico identificado como éter trimetil de ácido elágico (MS
m /z = 345
) eluyó con un tiempo de retención de 7,77 minutos (Figura 4).
Pico números se refieren a la Tabla 3.
Evaluación morfológica de las células apoptóticas por contraste de fases invertido Microscopio
observación morfológica de no tratado Skov-3, Ca esquís y de células HT-29 mostró que la las células de control mantuvieron su morfología original que son cuboides y poligonal en su forma y se adhiere a las placas (Figura 5). Por el contrario, Skov-3, Ca esquí y células HT-29 tratadas con PW-M, PW-H y PW-E y PPWH-7 exhibieron características apoptóticas como tales como la contracción de las células, la formación de la ampolla y la condensación de la cromatina nuclear y la agregación en masas densas debajo de la membrana nuclear. Las células que sufren apoptosis también dio lugar a otros tipos de cambios morfológicos tales como la contracción de las células redondeadas y perder el contacto con las células vecinas. Como resultado, algunas células sensibles incluso separados de la superficie de las placas.
SKOV-3, Ca de esquí y las células HT-29 después del tratamiento con 10 mg /ml de PW-M, PW-H, PW-e y PPWH-7 durante 24 horas. Las flechas indican la formación de cuerpos apoptóticos (A); (B) condensada núcleos y (c) formación de ampollas en la membrana como evidencia de apoptosis. Las imágenes son representativas de uno de los tres experimentos similares.
Evaluación morfológica de las células apoptóticas por el naranja de acridina (AO) -ethidium Bromuro (EB) doble tinción
Los cambios morfológicos de la SKOV -3, Ca de esquí y las células HT-29 tratadas con 10,0 mg /ml de PW-M, PW-H, PW-e y PPWH-7 para se observaron 24 horas por tinción AO /EB y las células se clasifican como en vivo ( normal), apoptóticas y necróticas (Figura 6). células vivas con el ADN intacto y el núcleo tendrán una ronda y los núcleos verdes.