Extracto
La genisteína se ha demostrado que inhibe el cáncer tanto in vitro como in vivo, mediante la alteración de la expresión de varios microARN (miARN ). En este estudio, nos centramos en los miRNAs supresores de tumores regulados por la genisteína y se investigó su función en el cáncer de próstata (CaP) y las vías de destino. Utilizando el análisis de microarrays miARN y en tiempo real de RT-PCR se observó que el miR-574-3p fue significativamente hasta reguladas en células de CaP tratados con genisteína en comparación con el control del vehículo. La expresión de miR-574-3p fue significativamente menor en las líneas celulares de CaP y tejidos CaP clínicos en comparación con las células normales de la próstata (RWPE-1) y los tejidos normales adyacentes. bajo nivel de expresión de miR-574-3p se correlacionó con el estadio tumoral avanzado y la puntuación de Gleason mayor en las muestras de CaP. Re-expresión de miR-574-3p en células de CaP, inhibió la proliferación celular, la migración y la invasión in vitro e in vivo. la restauración de miR-574-3p induce apoptosis a través de la reducción de Bcl-XL y la activación de la caspasa-9 y caspasa-3. Usando GENECODIS software de análisis, se identificaron varias vías afectadas por el miR-574-3p, como por ejemplo 'Senderos en el cáncer', 'la señalización vía Jak-STAT', y 'vía de señalización Wnt'. los ensayos de reportero de luciferasa demostraron que el miR-574-3p se une directamente a los 3 'UTR de varios genes diana (como RAC1, EGFR y EP300) que son componentes de' Caminos en el cáncer '. Cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de Western mostraron que los niveles de mRNA y de expresión proteica de los tres genes diana en células de CaP fueron notablemente las reguladas con miR-574-3p. estudios de pérdida de función demostraron que los tres genes diana afectan significativamente la proliferación celular, la migración y la invasión en líneas celulares de CaP. Nuestros resultados muestran que la genisteína hasta regula la expresión del tumor supresor de miR-574-3p considerando varias vías de señalización celular. Estos hallazgos aumentan la comprensión de cómo se regula la genisteína con miARN en el CaP
Visto:. Chiyomaru T, S Yamamura, Fukuhara S, Hidaka H, Majid S, S Saini, et al. (2013) La genisteína hasta regula tumor supresor de microARN-574-3p en el cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10.1371 /journal.pone.0058929
Editor: Burton B. Yang, de la Universidad de Toronto, Canada |
Recibido: 16 de octubre de 2012; Aceptó 8 de febrero de 2013; Publicado: 12 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chiyomaru et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la investigación de los Institutos nacionales de Salud a través de los números de subvención R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 y VA Merit Review y el proyecto del Programa de VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Co-autor Rajvir Dahiya es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El tipo más comúnmente diagnosticado de cáncer entre los hombres en el 2012 es el cáncer de próstata (CaP) que se espera que representen el 29% (241.740) de todos los nuevos casos de cáncer. CaP ocupa el segundo lugar con el cáncer de pulmón en las muertes relacionadas con el cáncer y se espera que representaría un 9% (28.170) de todas las muertes por cáncer en varones en 2012 [1]. CaP metastásico no es curable y sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer [2]. Paliación puede lograrse mediante terapia de deprivación hormonal sin embargo después de una excelente respuesta inicial, en aproximadamente 2 a 3 años, la mayoría de estos PCAS una recaída de la forma resistente castración de la enfermedad [3] con la muerte generalmente ocurre dentro de varios años [4]. No hay tratamientos exitosos para CaP independiente de los andrógenos. Una mejor comprensión de los mecanismos biológicos de CaP independiente de los andrógenos puede conducir a nuevos enfoques para tratar de responder CaP con más éxito.
El desarrollo de agentes quimioterapéuticos con baja toxicidad paciente está siendo investigado actualmente por muchos científicos. Muchos de estos agentes son derivados de productos vegetales naturales. La genisteína es un isoflavonoide phytoestrogenic que tiene efectos biológicos pleiotrópicos en una amplia variedad de cánceres sin ninguna toxicidad visible a las células normales [5]. La genisteína es un inhibidor de la proteína tirosina quinasa y afecta a la proliferación celular, la apoptosis, la angiogénesis tumoral, la metástasis y la resistencia a múltiples fármacos atenúa la participación de componentes clave de las vías de transducción de señales [6], [7], [8].
microRNAs (miRNAs ) son pequeños ARN no codificantes (21-23 nucleótidos) que principalmente se unen de manera imperfecta a la región 3 'no traducida (UTR) del ARNm diana y regulan negativamente la expresión génica post-transcripcionalmente por la represión de traducción y la degradación del ARNm diana [9], [ ,,,0],10]. Desde la identificación de miRNAs en 1993 más de 1.500 miRNAs humanos se han registrado en la base de datos miRBase (http://microrna.sanger.ac.uk/). Bioinformática indican que más del 60% de los genes codificantes de proteínas puede ser objetivo de miRNAs [11]. miRNAs juegan un papel importante en muchos procesos biológicos, tales como el desarrollo, la diferenciación, la proliferación, la apoptosis, la angiogénesis y el metabolismo. Además, son reguladores clave en muchas enfermedades incluyendo el cáncer [12] y miRNAs pueden funcionar como oncogenes o genes supresores de tumores [13], [14]. Los efectos de la genisteína en la regulación de varios miRNAs se han reportado [15], [16], [17]. Nuestro laboratorio ha demostrado que la genisteína inhibe el crecimiento de células de cáncer de orientación miRNAs oncogénicos tales como el miR-21, miR-151, miR-221 y miR-222. En este estudio, nos centramos en supresor de tumores miR-574-3p que está regulado por la genisteína y se investigó su función en CaP y de destino vías.
Resultados
Tratamiento genisteína Aumenta el miR-574-3p expresión que se redujeron regulado en el CaP
Para determinar los niveles de expresión de miR-574-3p en células de la próstata, hemos realizado cuantitativa en tiempo real PCR utilizando PC3 y DU145 líneas celulares y en comparación con las células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1). Hemos observado que la expresión de miR-574-3p fue significativamente las reguladas en líneas celulares de CaP en comparación con las células RWPE-1 (PC3 0,68 veces, DU145 0,65 veces) (fig. 1A).
(A) La expresión de miR-574-3p en líneas celulares de CaP (DU145 y PC3) y células epiteliales de próstata normales (RWPE-1). PCR en tiempo real mostró que los niveles de expresión de miR-574-3p se redujeron regulado en líneas celulares de CaP (DU145 y PC3). la expresión de miR-574-3p se normalizó a RNU48. Los datos se presentan como media ± SE. *, P & lt; 0,05. (B) Los niveles de expresión de miR-574-3p después del tratamiento con genisteína (25 micras y 50 micras). miR-574-3p expresión aumentó en un 30 a 50% en las células tratadas genisteína en comparación con los controles. *, P & lt; 0,05. la expresión (C) miR-574-3p en muestras clínicas (tejido normal adyacente, n = 48; CaP, n = 48). la expresión de miR-574-3p se determinó mediante PCR en tiempo real y normalizado a RNU48. P & lt; 0,0001. (D) PCR en tiempo real que muestran la correlación de las características clinicopatológicas con la expresión de miR-574-3p.
Para identificar miRNAs reguladas por la genisteína, se realizó un microarrays miARN utilizando células PC3 después del tratamiento genisteína (Tabla 1 ). La expresión de miRNAs 33 fue significativamente hasta reguladas mediante dos concentraciones de genisteína (25 mM y 50 mM) con miR-574-3p siendo los más afectados. Anteriores estudios de expresión de miRNA de nuestro laboratorio también mostraron que el miR-574-3p fue significativamente las reguladas en muestras de CaP en comparación con los tejidos de la próstata no cancerosas [18]. Para confirmar la expresión de miR-574-3p, se realizó un análisis de PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan y observó que la expresión de miR-574-3p fue significativamente hasta reguladas tratamiento con genisteína (1,31 a la 1,50 veces) (Fig. 1B).
miR-574-3p es significativamente las reguladas en el CaP muestras de tejido
se evaluaron los niveles de expresión de miR-574-3p en tejidos humanos CaP (n = 48) y no adyacentes tejidos cancerosa (n = 48). El nivel de expresión de miR-574-3p fue significativamente menor en el CaP en comparación con los tejidos normales (P & lt; 0,0001; Fig. 1C). Para determinar si los niveles de miR-574-3p en los tejidos tumorales se correlaciona con factores clínico-patológica, se analizaron los niveles de expresión de miR-574-3p en muestras de tumores humanos. demografía clínicas de la cohorte del estudio se resumen en la Tabla 2. Correlación de expresión 574-3p con variables clínico-patológicas tales como el estadio patológico (pT) y la puntuación de Gleason se muestra en la Fig. 1D. Estos resultados ponen de manifiesto que los casos con bajo aumento de la expresión de miR-574-3p de bajo grado, bajo el estadio patológico de alta calidad y alta estadio patológico. Estos resultados sugieren que el miR-574-3p es significativamente las reguladas en el CaP y puede ser un supresor tumoral putativo en el CaP.
Efecto de miR-574-3p El exceso de expresión sobre la proliferación celular, la migración y la invasión de CaP líneas celulares in vitro e in vivo
Para examinar el papel funcional de miR-574-3p, hemos realizado estudios con ganancia de función usando una pre-miARN miR-574-3p precursoras transfectaron en células PC3 y DU145. La expresión de miR-574-3p fue notablemente hasta reguladas en transfectantes precursores pre-miARN MIR (Figura 2A;. PC3 316,8 veces, DU145 307,5 veces). Ensayo de proliferación celular (MTS) y el ensayo de curación de la herida mostraron una inhibición significativa en los transfectantes miR-574-3p tanto en las células PC3 y DU145 en comparación con los transfectantes de control (Fig. 2B y 2C). ensayo de invasión (Matrigel) también mostró que el número de células invasoras se redujo significativamente en el miR-574-3p transfectantes en comparación con sus homólogos (Fig. 2D). Para confirmar el efecto de miR-574-3p en tumorigenicidad in vivo, miR-574-3p y DU145 células transfectadas-miR-control se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. Hemos observado que el miR-574-3p sobreexpresión inhibe la formación de tumores de células DU145 in vivo (Fig. 2E). Estos resultados sugieren que miR-574-3p juega un papel importante en la progresión de células tumorales.
(A) miR-574-3p niveles de expresión en líneas de células de CaP (PC3 y DU145) se determinaron por PCR en tiempo real a las 72 horas después de la transfección de precursor Pre-MIR miRNA. la expresión de miR-574-3p se normalizó a RNU48. Los datos se presentan como la media ± SE. (B) La sobreexpresión de miR-574-3p inhibe significativamente la viabilidad celular. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de proliferación celular MTS 1, 2 y 4 días después de la transfección transitoria. *, P & lt; 0,05. (C) La sobreexpresión de miR-574-3p inhibe significativamente la migración celular. Después de la transfección (48 horas), una herida se formó por raspado y mide después de 6, 12 y 24 horas. Imágenes representativas de ensayo de la cicatrización de heridas se muestran en 200 × magnificación. **, P & lt; 0,0001. *, P & lt; 0,005. (D) La sobreexpresión de miR-574-3p disminuyó significativamente la invasión celular. Imágenes representativas de ensayo de invasión se muestran en 200 × magnificación. *, P & lt; 0,005. (E) Imágenes representativas de tumores en ratones desnudos 5 semanas después de la inyección subcutánea de líneas transfectadas miR-574-3p DU145 células o líneas celulares de control y evolución en el tiempo del crecimiento del tumor.
miR-574-3p influencias celular apoptosis en células de CaP
Desde la restauración de miR-574-3p proliferación celular significativamente inhibido en líneas celulares de CaP, la hipótesis de que su restauración puede inducir apoptosis. Higo. 3A y 3B muestran que las fracciones de apoptosis temprana y apoptóticos (parte superior derecha e inferior derecha de las imágenes de cuadrante, respectivamente) fueron mayores en los transfectantes miR-574-3p comparación con el control. Esto apunta a un papel pro-apoptótica de miR-574-3p y sugiere que afecta a las vías de apoptosis y regula la tumorigenicidad. Por lo tanto, hemos examinado la expresión de varias proteínas apoptóticas mediante análisis de transferencia Western y encontramos que el miR-574-3p re-expresión de Bcl-XL causa baja regulación (Fig. 3C). caspasas-9 también, escindidos y -3 fueron hasta reguladas (Fig. 3C), apoyando además el hecho de que el miR-574-3p es un miARN pro-apoptótica.
(A) Apoptosis ensayo utilizando citometría de flujo . cifras del cuadrante representativas de transfectantes de control de MIR y miR-574-3p en PC3 (superior) y DU145 células (más bajos). (B) El gráfico de barras indica la proporción de células apoptóticas fracciones (primeras células apoptóticas además de apoptosis) en miR-574-3p transfectantes en comparación con los controles. Los datos para las fracciones de células apoptóticas se expresan como el valor relativo para la expresión media del transfectante de control de MIR. *, P & lt; 0,05. (C) Las inmunotransferencias análisis de marcadores de apoptosis en las células DU145 MIR-MIR-574-3p transfectadas control y. GAPDH se utilizó como control de carga.
Búsqueda de genes diana de miR-574-3p por análisis in silico
Para buscar genes diana putativos de miR-574-3p, nos utilizado la base de datos TargetScan. Este programa mostró que el miR-437 574-3p ha predicho genes diana. Se utilizó el análisis in silico para identificar los procesos biológicos o vías potencialmente regulados por miR-574-3p. Los genes diana candidatos fueron asignados a las vías mediante el análisis de GENECODIS de software (http://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], y las vías enriquecido estadísticamente fueron identificados como 'Caminos en el cáncer' , 'la señalización vía Jak-STAT', y 'vía de señalización Wnt' (P & lt; 0,05, Tabla 3). a continuación, se realizó el análisis de la expresión génica para todos los genes candidatos objetivo que intervienen en cada una de las 9 rutas que utilizan los datos de microarrays de expresión, que fueron aprobadas por la Expresión Génica Omnibus (GEO) y se centró en los 'Caminos en el cáncer'. A partir de este análisis, se identificaron varios genes objetivos cruciales, incluyendo tropomiosina 3 (TPM3), de tipo sin alas MMTV familia del sitio de integración, miembro de 5A (WNT5A), relacionadas con ras sustrato de toxina C3 botulínica 1 (rho familia, proteína de unión a GTP pequeño Rac1) (RAC1), factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR), receptor de retinoide X, alfa (RXRA), v-akt timoma murino viral homólogo de oncogén 2 (AKT2), y E1A p300 proteína de unión (EP300).
luciferasa reportero ensayos utilizando vectores que contienen 3'UTR Sitios de supuestos genes diana de unión
para confirmar la unión de miR-574-3p a los 3 'UTR de estos 7 genes diana, se realizaron ensayos de reportero de luciferasa. Cada objetivo se ha predicho un sitio de unión para el miR-574-3p (Fig. 4A). Hemos clonado los supuestos 3'UTRs miR-574-3p se dirigen en un vector reportero de ensayo de luciferasa. los ensayos de reportero de luciferasa demostraron que el miR-574-3p disminuyó las actividades relativas de luciferasa de RAC1, EGFR y EP300 (Fig. 4B) a excepción de otros cuatro genes. La mutación de los sitios en estos 3'UTRs unión putativa de miR-574-3p disminuyó la respuesta a miR-574-3p que indica que el miR-574-3p se une directamente a la 3'UTRs de RAC1, EGFR y EP300.
sitios putativos (a) miR-574-3p vinculantes y mutados en el 3'UTR de los genes diana. ensayos (B) indicador de luciferasa usando vectores que codifican los sitios de unión putativos 3'UTR. células PC3 y DU145 fueron transfectadas transitoriamente con precursor Pre-MIR miARN o un control negativo, seguido de la transfección transitoria con el vector de base o de tipo salvaje plásmidos informadores 3'UTR o plásmidos mutados 3'UTR durante 24 horas. actividad de reportero 3'UTR se midió por ensayo de luciferasa y se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla. Los datos se presentan como la media ± SE. *, P & lt; 0,05. (DO). Los niveles de mRNA de los tres genes diana de miR-574-3p se determinaron por cuantitativa en tiempo real los análisis de PCR después de la transfección con imita el miR-574-3p y control negativo en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145). *, P & lt; 0,05. (D) El análisis por inmunotransferencia de los genes diana en las células PC3 transfectadas 574-3p MIR-MIR-control y. GAPDH se utilizó como control de carga.
Regulación de la Expresión Génica de destino en el CaP líneas celulares por
Cuantitativo en tiempo real PCR-574-3p MIR demostró que los niveles de expresión de ARNm de los tres genes diana en PC3 y DU145 fueron reprimidos en los transfectantes miR-574-3p en comparación con los controles (Fig. 4C). Los niveles de expresión de proteínas de los tres genes diana también se redujeron en los transfectantes miR-574-3p en comparación con los controles (Fig. 4D).
Efecto del gen diana siRNA desmontables sobre la proliferación celular, la migración y la invasión la actividad en las líneas celulares de CaP
Para examinar el papel funcional de los genes diana, hemos realizado estudios de pérdida de la función utilizando si-ARN caída con células PC3 y DU145. La expresión de mRNA y proteína de RAC1, EGFR y EP300 fueron reprimidos notablemente en transfectantes si-ARN en comparación con los controles (Fig. 5A y 5B). Ensayo de proliferación celular (MTS) y terminó ensayo de curación mostraron una inhibición significativa en si-RAC1, si-EGFR y transfectantes si-EP300 tanto en las células PC3 y DU145 en comparación con los transfectantes de control (Fig. 5C y 5D). ensayo de invasión (Matrigel) también mostró que el número de células invasoras disminuyó significativamente en si-RAC1, si-EGFR y si-EP300 transfectantes en comparación con sus homólogos de control (Fig. 5E).
(A) Objetivo los niveles de expresión génica en líneas celulares de CaP (PC3 y DU145) se determinaron por PCR en tiempo real a las 72 horas después de la transfección de ARNsi. expresión del gen diana se normalizó a GAPDH. Los datos se presentan como la media ± SE. *, P & lt; 0,05. (B) expresión del gen diana en las líneas celulares PC3 se determinó por análisis de inmunotransferencia a las 72 horas después de la transfección de ARNsi. GAPDH se utilizó como control de carga. (C) Derribo de RAC1, EGFR y EP300 inhibe significativamente la viabilidad celular. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de proliferación celular MTS 1, 2 y 4 días después de la transfección transitoria. (D) Derribo de RAC1, EGFR y EP300 inhibe significativamente la migración celular. Después de la transfección (48 horas), una herida se formó por raspado y mide después de 6, 12 y 24 horas. Imágenes representativas de ensayo de la cicatrización de heridas se muestran en 200 × magnificación. (E) Derribo de RAC1, EGFR y EP300 disminuyó significativamente la invasión celular. Imágenes representativas de ensayo de invasión se muestran en 200 × magnificación. **, P & lt;. 0,0001
Discusión
Muchos estudios han demostrado que la genisteína regula la proliferación de células de cáncer, la invasión, la angiogénesis y la metástasis por la orientación de varios genes y las vías de señalización [6], [7], [22]. Por ejemplo genisteína inhibe la invasión de células reducción de la expresión de MMP-2 y MMP9 en células epiteliales de próstata humana y células metastásicas en la progresión tumoral se correlaciona positivamente con la expresión de MMP [23], [24], [25]. Hemos demostrado anteriormente que la genisteína el regulado la expresión de MCM2 aumentando la expresión de miR-1296 en células de CaP [26]. También hemos informado de que la genisteína el regulado de miR-221/222 expresión en células de CaP que resulta en aumento de la expresión del gen supresor de tumores ARHI que es objetivo de miR-221/222 [16]. La genisteína También se ha informado de inhibir la angiogénesis CaP por la supresión de las vías de señalización autocrina y paracrina de VEGF mediada por entre las células tumorales y las células endoteliales vasculares [27]. El gen EP300 se ha identificado como un co-activador de HIF1A y desempeña un papel en la estimulación de genes de hipoxia inducida tales como VEGF [28]. RAC1 es también un importante regulador de VEGF mediada por la angiogénesis [29] y miR-151 tiene una función oncogénica la regulación de la activación de RAC1 por la orientación ARHGDIA [30]. También demostramos recientemente que la genisteína inhibe la migración de células de CaP y hasta regulado varios genes supresores de tumores, incluyendo ARHGDIA blanco de miR-151. En este estudio, hemos encontrado que la genisteína regulado hasta la expresión de miR-574-3p en células de CaP. En el análisis de silico y ensayos de reportero de luciferasa demostraron que RAC1 y EP300 eran genes diana putativos para miR-574-3p. Cuantitativa en tiempo real PCR y análisis de Western mostraron que los niveles de mRNA y de expresión proteica de RAC1 y EP300 en células de CaP fueron notablemente las reguladas por el miR-574-3p. Por lo tanto, la genisteína puede regular a la baja RAC1 y EP300 por hasta la regulación de miR-574-3p.
La sobreexpresión de Notch1 conduce a la inducción del fenotipo EMT y aumento de la expresión de miR-21 [31]. La genisteína se ha demostrado para inactivar Notch y el erizo de señalización [31], [32] y que ya se ha informado que la genisteína inhibe el crecimiento de células tumorales mediante la reducción de miR-21 expresión en carcinoma de células renales [15]. Por lo tanto la genisteína tiene una función supresora de tumores, la regulación de 'señalización Notch' por la baja regulación de miR-21. La genisteína también puede reducir la proliferación celular mediante la regulación de 'señalización Wnt' [33], [34], [35] a través de miR-574-3p en el cáncer. En este estudio EGFR, un gen diana putativo de miR-574-3p, fue hasta reguladas en el CaP y el aumento en el cáncer avanzado [36], [37]. la expresión de EGFR se correlaciona con una alta puntuación de Gleason, y la recaída de la enfermedad hormono-resistente de estado [37], [38]. Los investigadores han informado de que el EGFR está regulada por varios miRNAs como miR-7, miR-128b, miR-133, miR-145, miR146a, miR-146b-5p, miR-331-3p, miR-542-5p [39] - [47]. La genisteína hasta reguladas expresión de miR-146a en las células de cáncer de páncreas y funciona como un supresor de tumores en el CaP resistente a la castración [44], [45]. La genisteína podría abajo reguladas por niveles de EGFR hasta la regulación de miR-574-3p.
La genisteína induce la apoptosis mediante la regulación de las vías de señalización intrínsecas y extrínsecas. Ción y las proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticos juegan un papel crucial en la regulación de la vía mitocondrial de apoptosis [48] y la baja regulación de Bcl-XL mediante la genisteína induce la apoptosis en células de CaP [49]. En esta vía activada la caspasa-9 acelera la activación de caspasas verdugo, incluyendo la caspasa-3, y las moléculas de señalización y sucesivamente escinde proteínas celulares [49], [50]. En nuestro estudio, el miR-574-3p induce la apoptosis y la expresión regulada de Bcl-XL, la caspasa-9 y caspasa-3. Por lo tanto, este estudio demuestra que la apoptosis inducida por la genisteína en células de CaP se produce por el aumento de la expresión de miR-574-3p.
En este estudio, nos centramos en el miR-574-3p que fue hasta reguladas por la genisteína y era una forma significativa las reguladas miARN específico para el CP en el perfil miARN [18]. Nuestros estudios previos indicaron que el miR-574-3p podría ser un supresor tumoral miARN en el CaP y el cáncer de vejiga [18], [51], [52]. miR-574-3p se encuentra en el cromosoma 4p14, una región cromosómica frecuentemente suprimido en el CaP y líneas celulares de cáncer de vejiga [51], [53]. Su et al informaron de que la expresión de miR-574-3p se redujo en el cáncer gástrico y la proliferación celular, la migración y la invasión se inhibieron significativamente en células de cáncer gástrico miR-574-3p transfectadas [54]. Encontraron el gen CUL2 ser un objetivo de miR-574-3p utilizando por la predicción computacional y validación experimental. Nuestro estudio anterior demostró que el miR-574-3p tiene función supresora de tumores y que el gen oncogénico MESDC1 está dirigida por el miR-574-3p en el cáncer de vejiga [52]. En este estudio, hemos demostrado que el miR-574-3p es el regulado en muestras clínicas y líneas celulares de CaP CaP andrógeno-independiente (PC3 y DU145). Baja regulación de la expresión de miR-574-3p en los tumores se relaciona con un estadio tumoral alto y la puntuación de Gleason que indica que el miR-574-3p puede ser utilizado como un biomarcador de la progresión del tumor en el CaP.
En conclusión, nuestro Los resultados muestran que la genisteína hasta regula la expresión de miR-574-3p que se dirige a varias vías de señalización celular. Estos resultados mejoran nuestra comprensión de cómo la genisteína regula la expresión de los genes miARN en el CaP.
Materiales y Métodos
Clínica de próstata Las muestras
Todas las láminas de tejido fueron revisados por un patólogo certificado por la junta para el identificación de CaP focos, así como epitelio glandular normal adyacente. Todos los pacientes con cáncer tenían niveles elevados de antígeno prostático específico (PSA) y se habían sometido a prostatectomía radical entre 1998 y 2004. Datos demográficos del paciente se muestran en la Tabla 2. Escrito se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité UCSF Derechos Humanos de Investigaciones (número de autorización: H9058-35751-01).
Cell Cultura y
líneas celulares de CaP humano, PC3 y DU145 y una línea celular epitelial de próstata no maligno, RWPE-1, fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). líneas celulares de CaP se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire a 37 ° C. células RWPE-1 se cultivaron en medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con 5 ng /factor de crecimiento epidérmico recombinante humano ml y 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). células subconfluentes (60% -70% de confluencia) se trataron con genisteína (25 mmol /L y 50 mmol /L; Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) disuelto en dimetilsulfóxido y las células tratadas con vehículo (dimetilsulfóxido) sirvió como control. Medios de comunicación y la genisteína se cambiaron todos los días y las células se cultivaron durante 4 días.
La extracción de RNA
ARN fue extraído de muestras FFPE humanos utilizando un kit incluido en parafina y fijado en formalina miRNeasy (Qiagen, Valencia , CA, EE.UU.) después de microdisección. Para digerir el ADN, se utilizó el kit Qiagen DNasa libre de RNasa. El ARN total se extrajo también de las líneas de CaP de células y una línea de células epiteliales de próstata no maligno utilizando un kit miRNeasy Mini (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
microRNA Microarray
Para miARN microarray, ARN total fue extraído a partir de células PC3 tratadas con genisteína usando un miRNeasy Mini Kit. El análisis de microarrays miARN se llevó a cabo y analizado por una empresa comercial (falange Biotech, Belmont, CA, EE.UU.), utilizando la plataforma humana v3 miARN OneArray que está diseñado para contener el 100% de miRBase Secuencia de bases de datos de salida 17.0.
cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total extraído se transcribe de forma inversa en ADNc monocatenario usando un kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) y un microARN transcripción reversa kit TaqMan (Applied Biosystems, foster City, CA, EE.UU.). El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó con un Applied Biosystems Prism7500 secuencia rápida sistema de detección usando TaqMan PCR Universal mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). Los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando el sistema 7500 Fast SDS software versión 1.3.1 (Applied Biosystems). parámetros de PCR para los ciclos eran las siguientes: 95 ° C durante 20 segundos, 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 3 segundos, y 60 ° C durante 30 segundos. Todas las reacciones se realizaron en un volumen de reacción de 10 l por triplicado. Los datos se analizaron con el método de Ct delta-delta para calcular el factor de cambio. sondas TaqMan y cebadores para RAC1 (ensayo ID: Hs01902432_s1), EGFR (ID ensayo: Hs01076078_m1), EP300 (ID ensayo: Hs00914223_m1), GAPDH (ID ensayo: Hs02758991_g1), miR-574-3p (ID ensayo: 002349), RNU48 (Ensayo de ID: 001006) se obtuvieron de Applied Biosystems. GAPDH y RNU48 se utilizaron como controles internos.
Análisis Western
A las 72 horas después de la transfección, las células se lisaron con tampón RIPA (Pierce, Brebieres, Francia) que contiene inhibidores de proteasa (Sigma). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce). lisado de proteínas (30 mg) se separó en 4% a 20% en geles de SDS poliacrilamida y se transfirió a una membrana de PVDF. Los anticuerpos para EP300 y Bcl-xL se compraron de Invitrogen y Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Los anticuerpos contra RAC1, EGFR y GAPDH se adquirieron de GeneTex (Irvine, CA, EE.UU.), respectivamente. Los anticuerpos a exfoliados caspasa-3, -9 y la caspasa-3, -9 fueron adquiridos de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). Después de la incubación con el anticuerpo primario, la membrana se lavó y después se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.). complejos específicos se visualizaron con un echochemiluminescence (ECL) sistema de detección (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido). La membrana fue despojado utilizando ReBlot Plus solución fuerte de anticuerpos de desmontaje (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). El nivel de expresión de los genes se evaluó a continuación, utilizando el software ImageJ (versión 1.43;. Http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).
La transfección
Pre-MIR precursor de miARN y el control negativo (Applied Biosystems) fueron utilizados en los experimentos con ganancia de función. RAC1, EGFR y EP300 siRNA (Sigma) y control negativo siRNA (D-001810-10; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) se utilizaron en los experimentos de pérdida de función. PC3 y DU145 células fueron transfectadas transitoriamente utilizando Lipofectamine 2000 transfección reactivo (Invitrogen), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
proliferación celular, la migración y la invasión ensayos
Se midió la proliferación de las células utilizando un CellTiter 96 Una solución acuosa Ensayo de proliferación celular (MTS) (Promega, Madison, WI, EE.UU.) realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proliferación celular se determinó por medidas de absorbancia a 490 nm usando SpectraMax 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, EE.UU.). actividad de migración celular se evaluó mediante un ensayo de cicatrización de heridas. Las células se sembraron en placas de seis pocillos, y las monocapas de células se rasparon con una punta de micropipeta P-20. La anchura de la separación inicial (0 h) y la brecha residual 6, 12 y 24 horas después de la herida se calcularon a partir fotomicrografías. Un ensayo de invasión de células se llevó a cabo utilizando modificado Boyden Salas compuestas de Matrigel insertos de filtro de membrana Transwell-pre-revestido con ocho poros micras en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.). medio esencial mínimo que contenía 10% de FBS en la cámara inferior servía de cebo químico, tal como se describe anteriormente [55]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
En vivo Crecimiento Tumoral
Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las directrices del Centro Médico de Veteranos de San Francisco y el estudio fue aprobado por el San Francisco VA (número de protocolo: 11-008-01) IACUC. usuarios en animales han completado programas de capacitación para manejar y trabajar con los ratones a través de AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) antes de los experimentos con animales. Para el modelo de ratón con xenoinjerto subcutáneo, DU145 células (2,5 × 10
6) que fueron transfectadas transitoriamente con el MIR-MIR-574-3p o de control se suspendieron en 50 l de RPMI 1640 y se inyectan por vía subcutánea en ratones desnudos hembra (cepa BALB /c nu /nu; Laboratorios Charles River, Inc., Wilmington, MA, EE.UU., 5 semanas de edad). Un total de 8 ratones desnudos (4-miR-574-3p, 4-miR-control) se utilizaron y el crecimiento del tumor fue examinado en el transcurso de 35 días. El volumen del tumor se calculó sobre la base de la anchura (x) y la longitud (y):. x
2y /2, donde x & lt; y
Apoptosis ensayos
por células activada por fluorescencia (FACS) el análisis de la apoptosis se realizó 96 horas después de la transfección, el uso de Anexina V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células teñidas se analizaron inmediatamente con un citómetro de flujo (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).
Identificación de miR-574-3p regulan los genes diana y el análisis bioinformático
Para buscar genes regulados por miR-574-3p, se utilizó TargetScan algoritmo (versión 6.2, http://www.targetscan.org/).