Extracto
El cáncer de ovario G receptor acoplado a proteína 1 (OGR1) se ha demostrado que es un sensor de protones receptor de
in vitro
. Hemos demostrado que las funciones OGR1 como un gen supresor de la metástasis del tumor cuando se expresa en off en células de cáncer de próstata humano
in vivo
. Para examinar las funciones fisiológicas de OGR1, hemos generado ratones deficientes OGR1 condicional por recombinación homóloga. ratones deficientes OGR1 eran viables y sobre bruta en la inspección parecían normales. En consonancia con
in vitro
estudios que muestran que en OGR1 está involucrado en la osteoclastogénesis, se detectaron los osteoclastos reducidos en los ratones deficientes OGR1. También se observó un efecto de supervivencia osteoclastos dependiente del pH. Sin embargo, no se observó anormalidad general en los huesos de estos animales. Además, la tumorigénesis de células de melanoma se inhibió significativamente en los ratones deficientes OGR1. OGR1 ratones deficientes en el fondo mixto producido macrófagos peritoneales significativamente menor cuando se estimula con tioglicolato. Estos macrófagos también mostraron señal alterada extracelular
quinasas -regulated de activación (ERK) y la producción de óxido nítrico (NO) en respuesta a lipopolisacárido. no se observaron respuestas de pH OGR1 dependientes evaluadas por la producción de AMPc y la supervivencia celular en los macrófagos o células de grasa marrón, presumiblemente debido a la presencia de otros receptores de protones de detección en estas células. Nuestros resultados indican que el papel de OGR1 en la osteoclastogénesis no es lo suficientemente fuerte como para afectar el desarrollo óseo en general y su papel en la tumorigénesis garantiza una mayor investigación. Los ratones generado se puede utilizar potencialmente para varios modelos de enfermedad, incluyendo el cáncer o enfermedades relacionadas con osteoclastos
Visto:. Li H, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z, et al. (2009) Anomalías en la osteoclastogénesis y la disminución de la tumorigénesis en ratones deficientes para acoplado a la proteína G del receptor de cáncer de ovario 1. PLoS ONE 4 (5): e5705. doi: 10.1371 /journal.pone.0005705
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: April 2, 2009; Aceptado: 5 Mayo 2009; Publicado: 28 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. RO1 HL68804 , RO1-CA89228, y Ralph C. Wilson, Sr. y Ralph C. Wilson, Jr. subvención de la Fundación de Investigación médica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hemos clonado previamente OGR1 de una línea celular de cáncer de ovario HEY [1]. Recientemente, hemos demostrado OGR1 es un nuevo gen supresor de metástasis de cáncer de próstata [2]. OGR1 y sus receptores acoplados a la proteína subfamilia G (GPCRs), GPR4, G2A y de células T gen de la muerte asociada a 8 (TDAG8), han demostrado tener la capacidad de protones de detección de [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Muchas de estas actividades de detección de protones se han identificado en las células que sobreexpresan uno o más de estos GPCRs. Más recientemente, las actividades de detección de protones se han detectado en células de GPR4- y TDAG8-, pero no los ratones con deficiencia de G2A [8], [10], [11].
Los ratones deficientes en G2A, TDAG8, o GPR4 se han generado. Estos knockout (KO) los ratones son viables y muestran diferentes fenotipos. los ratones KO G2A demuestran un patrón normal de T y B diferenciación de linaje celular a través de la edad adulta. Sin embargo, los animales viejos G2A deficientes (& gt; 1 año) desarrollan secundaria agrandamiento de un órgano linfoide asociado a la expansión anormal de ambos linfocitos T y B [12]. Además, otros fenotipos relacionados con células óseas derivadas de médula, incluyendo, monocitos /células endoteliales y macrófagos, así como las células hepáticas se han descrito [8], [13], [14], [15], [16], [17]. TDAG8 es transcripcionalmente hasta reguladas por glucocorticoides (GCS) y denotado por expresión de estudios en la inhibición mediada por psychosine de la citocinesis [18], [19]. Aunque la expresión TDAG8 se asemeja a la regulación dinámica descrito para moduladores conocidos de la apoptosis inducida por GC durante el desarrollo de los timocitos, es prescindible para la formación psychosine inducida de células multinucleadas. Además, los timocitos en ratones KO TDAG8 muestran la apoptosis normal después de
in vivo
y
in vitro
GC tratamiento [11]. Por otra parte, pH extracelular ácido no modula diferencialmente la susceptibilidad de tipo TDAG8 salvaje (WT) y timocitos KO a GC inducida por apoptosis [11]. Sin embargo, en los timocitos y esplenocitos explantados de los ratones deficientes en receptores, TDAG8, pero no G2A, se encuentra que es crítico para la producción de AMPc dependiente del pH [8]. Si bien este manuscrito estaba en preparación, Mogi
et al
han demostrado que TDAG8, pero no OGR1 está involucrado en efecto del pH inducida por inhibidor sobre factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) de producción en los macrófagos [20]. GPR4 se expresa en la mayoría de las células endoteliales y media sphingosylphosphorylcholine (SPC) inducida por las actividades angiogénicas (11). La deficiencia conduce a GPR4 penetrado parcialmente anomalías vasculares durante el desarrollo y que este receptor funciona en sensores de pH de los vasos sanguíneos en un
ex vivo
ensayo de anillo aórtico [10].
OGR1 ha sido identificado como un fuerte hasta reguladas genes durante la osteoclastogénesis en
Csf1
tl /Csf1
tl
ratas (ratas deficientes en CSF) tratados con macrófagos, factor estimulante de colonias (CSF o M-CSF-1) y en los receptores activador del ligando del factor nuclear κ B (RANKL, o trance, TNFSF11) inducida por la diferenciación de los osteoclastos
in vitro
[21]. La implicación funcional potencial de OGR1 en la osteoclastogénesis se ha demostrado usando un anticuerpo anti-OGR1 y mediante la inhibición de OGR1 con el ARN pequeño inhibidor (siRNA) [21]. Por otra parte, acidosis sistémica tiene efectos perjudiciales en la acidosis esqueleto y local está asociado con la destrucción ósea en enfermedades inflamatorias y neoplásicas. La supervivencia y la señalización del calcio de los osteoclastos se han mejorado de manera significativa por la acidificación del medio de una manera OGR1-depedent [22]. La implicación funcional de OGR1 principalmente ha sido examinada usando anticuerpos OGR1, o un antagonista no específico OGR1 Cu
2 +, o siRNAs contra OGR1. Dado que todos estos reactivos todos potencialmente pueden tener efectos fuera de la meta, se necesita un sistema más específico para evaluar las funciones fisiológicas de OGR1.
Las células madre mesenquimales (MSC) y células madre hematopoyéticas de la médula ósea son capaces de diferenciarse en monocitos, osteoclastos, osteoblastos, y adipocitos, entre otros fenotipos celulares. Estos tipos de células son importantes para muchas funciones biológicas. En condiciones fisiológicas normales, los procesos de diferenciación están estrechamente controlados. procesos de diferenciación y /o activación desequilibradas conducen a condiciones patológicas y enfermedades.
Derivado de monocitos de la sangre, los macrófagos se viven relativamente largo células fagocíticas de tejidos de mamíferos. Los macrófagos están implicados en una variedad de procesos que incluyen la destrucción de patógenos, la inflamación, la reparación de tejido y de remodelación. Ellos tienen un fenotipo muy plástico y su polarización funcional se determina por citoquinas y factores que se encuentran dentro de los microambientes locales [23]. Una de las funciones de los macrófagos es el de proporcionar un mecanismo de defensa contra las células tumorales. Sin embargo, los macrófagos asociados al tumor (TAM), que representan el componente inflamatorio importante del estroma de muchos tumores sólidos, se asocian con la progresión tumoral y la metástasis [23].
Brown y tejido adiposo blanco (WAT BAT y ) son actores clave en la obesidad y relacionado con problemas de salud, como la diabetes tipo 2 y enfermedades cardiovasculares. BAT-no dependiente de la termogénesis temblando significativamente afecta el equilibrio energético del cuerpo. Además de su función de almacenamiento de energía, los tejidos grasos también secretan una serie de hormonas y citoquinas, y están implicados en el control del metabolismo corporal y balance de energía en múltiples sitios [24], [25]. BAT es de particular importancia en los recién nacidos, pequeños mamíferos (tales como ratones) en ambientes fríos, y los animales que hibernan, debido a que su principal función fisiológica es para disipar la energía almacenada en forma de calor. En los bebés humanos BAT comprende hasta un 5% del peso corporal total, que a su vez disminuye con la edad a niveles prácticamente inexistentes en la edad adulta.
A lo largo de la vida de un animal, el tejido óseo se encuentra en un estado constante de la facturación como consecuencia de la combinación de la eliminación secuencial de tejido óseo por los osteoclastos y nueva deposición de hueso por los osteoblastos. Los osteoclastos son de resorción ósea células gigantes multinucleadas que se derivan de células precursoras hematopoyéticas mononucleares bajo el control tanto de M-CSF y RANKL [21]. . Estos ayudan en la absorción de las células y eliminar el exceso de tejido óseo en la remodelación de los huesos en crecimiento, o hueso dañado en la reparación de fracturas
Hemos generado y caracterizado los ratones deficientes en OGR1 abordar varios aspectos fundamentales: 1) la funciones fisiológicas de OGR1 en ratones; 2) el papel de OGR1 en la osteoclastogénesis; 3) la capacidad de respuesta pH OGR1 dependiente de la utilización de células OGR1 deficientes; y 4) las funciones de OGR1 en otros procesos biológicos de hueso cuando los ratones son desafiados por estímulos exógenos, tales como células tumorales. Hemos encontrado que, en consistencia con los datos publicados, OGR1 es probable que participen en la osteoclastogénesis. En nuestras manos, se observó osteoclastos derivados de células de médula ósea de ratones deficientes OGR1 reducida. También se observó un débil efecto de supervivencia osteoclastos dependiente del pH. Sin embargo, las estructuras óseas generales de los ratones no fueron afectados y un efecto significativo biológica pH regulado y OGR1 dependiente no se evidenció en general en las células [incluyendo macrófagos y células derivadas de tejido adiposo marrón (BADCs)] OGR1-expresión, lo que sugiere un efecto redundante de otros GPCRs subfamilia OGR1
in vivo
. Además, el efecto y la implicación de la célula huésped OGR1 en la tumorigénesis de células de melanoma es de gran interés y de nuevas investigaciones. Se observaron dos anomalías adicionales relacionadas con los macrófagos peritoneales y MTD de una manera dependiente de ratón de fondo, lo que sugiere la participación de modificar los genes de diferentes orígenes ratón.
Materiales y Métodos
Reactivos
sphingosylphosphorylcholine (SPC) y lisofosfatidilcolina (LPC) eran de Aventi Polar Lipids (Birmingham, AL) o Research Chemicals Toronto (Toronto, Canadá). M-CSF y RANKL eran de Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anti-FLAG M2, H
2O
2, tioglicolato (TG), lipopolysacchride (LPS), perlas de látex, nitrito de sodio, reactivo de Griess, fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) reactivos de tinción y reactivos de tinción tricromática de Masson, eran comprado a Sigma (St. Louis, MO). Anti-fosfo-ERK, anti-ERK, anti-fosfo-p38, p38 anti-eran de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Cabra anti-iNOS, TRITC-anti-conejo eran de BD (San Jose, CA). Anti-F4 /80, anti-PCNA, conejo anit-arginasa y anti-ciclooxigenasa-2 (COX-2) eran de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-CD31 fue de RDI (Fitzgerald, Concord, EE.UU.). tampón citrato, suero de caballo universales, VECTOR Novared, y hematoxilina QS eran de Vector (Burlingame, CA).
Generación de OGR1 knockout (KO) los ratones
OGR1 construcción diana se ha generado a través de una contratar con AntEQ ratones transgénicos (Australia). En resumen, un 13,2 kb Bam HI fragmento genómico que contiene el gen OGR1 se subclonó a partir de una copia cromosoma artificial bacteriano (BAC) (una especie de regalo del laboratorio del Dr. Owen Witte en UCLA) en un PBS (KS) II vector (plásmido#182) . La región 5 'de homología del locus OGR1 se amplificó por PCR usando cebadores OGR1#1 y#2 y el plásmido#182 como una plantilla. Primer#2 creado un nuevo sitio Nco1 al principio de OGR1 (cambiado el primer codón de ATG a CTC). El fragmento de PCR se subclonó en pCR2.1.TOPO (Invitrogen) para dar el plásmido#183. Exón 1 de OGR1 se amplificó por PCR utilizando los cebadores#7 y#8, mientras que el cebador#7 introdujo un sitio Xba I para etapas de clonación adicionales. El fragmento de PCR se subclonó en pCR2.1.TOPO para dar el plásmido#188. Esta secuencia completa OGR1 se confirmó por análisis de secuenciación. Un fragmento de 6,2 kb genómica de la región no traducida 3 'del locus OGR1 se subclonó en el plásmido#182 para dar el plásmido#189. A 1,4 kb floxed-neo-cassette se clonaron a continuación en el plásmido#189 linealizado con Stu I para dar el plásmido#208. Stu I corta en el extremo del extremo 3 'de la región Hind III 5 OGR1. Los 3xFLAG región de codificación de tres epítopos FLAG adyacentes se amplificó por PCR a partir del plásmido p3xFLAG CMV-19 utilizando los cebadores#3 y#4 y el segundo cebador incluía un sitio Xho I para clonación adicional. El 353 pb producto de PCR se subclonó en pCR2.1.TOPO (plásmido#185). Un fragmento de 400 pb Ken y XhoI del#185 fue subclonado adicionalmente en PBS (KS) II para obtener el plásmido#196. Un fragmento Kpn-Nco I de 2,6 kb (región 5 'homoloy) a partir del plásmido#183 a continuación se subclonó en el plásmido#196 en frente de la región FLAG 3 × (plásmido#199). El sitio loxP en la región 5 'del exón 1 se clonó usando cebadores hibridados#5 y#6, y se ligó en el plásmido#199 en los sitios Xho I y Xba I. Esto dio lugar al plásmido#204, que se secuenció para confirmar la integridad de la unión 3xFLAG-LoxP-exón 1. Un fragmento de 1,8 kb XbaI-Sac I OGR1 incluyendo el exón 1 y la región no traducida '3' del plásmido#188 se subclonó en el plásmido#203 para generar el plásmido#209. Un fragmento Hind III de 7,7 kb del plásmido#208 que alberga el casete neo flanqueado por sitios loxP y la región 3 'OGR1 homología se subclonó en el plásmido#209 para dar el vector dirigido OGR1#218. La funcionalidad de los sitios LoxP se confirmaron en un
E. coli cepa BNN123
Cre que expresan constitutivamente recombinante. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron:
#1: 5 'GGT ACC GGA GGA CGT GAG CAA CAA CT
#2: 5' ATG TTC CCC ATG GTT GGG CCA GAA
#3: 5 'TCC TAC TTG GCA GTA CAT CT
#4: 5' ATC TCG AGC TTG TAC TCG TCA TCC TTG
#5: 5 'TCG AGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT
#6: 5 'CTA GAT TTC AAC GTA TAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATC
#7: 5' ACT TCT AGA GGG AAC ATC ACA GAA TC AAC
#8: 5 'AGG AAC TTG GCT AAG GAC
las construcciones diana OGR1 se inyectaron en células madre embrionarias en el Centro de ratón transgénico Core de la Universidad Case Western Research (Cleveland, OH). Se generaron ratones quiméricos con genes de la línea germinal OGR1 bandera de etiquetado flanqueadas por dos sitios loxP. A través de la cría de los ratones C57 /BL6, estos ratones se usaron para generar ratones heterocigotos con una copia de OGR1 bandera de etiquetado. la posterior reproducción de OGR1 heterocigóticos
fl /+ ratones generados OGR1
fl /fl ratones homocigotos. Todos los descendientes de la cría de los ratones heterocigotos OGR1
fl /+ se genotipo mediante análisis de ADN de los clips de la cola. Inicialmente se realizaron dos análisis de transferencia de Southern y PCR para confirmar el genotipo. genotipado subsiguiente se llevó a cabo principalmente mediante análisis de PCR. Los ratones homocigotos con OGR1 floxed (OGR1
fl /fl) fueron criados con ratones Cre línea germinal ZP-3 (una línea de ratones transgénicos para la inactivación de loxP-flanqueado genes diana específicamente en la línea germinal femenina [26]; Jackson Labs , Bar Harbor, Maine). Además, ellos fueron criados para PRM (protamina-Cre, una línea de ratones transgénicos para la inactivación de los genes diana loxP-flanqueado específicamente en la línea germinal masculina de ratones [27]; amablemente suministrados por el Dr. Guangbin Luo, Case Western Reserve University ) para generar OGR1
+/- Cre ratones, que fueron criados además para generar OGR1
- /- (KO o ratones deficientes). El OGR1
fl /fl ratones fueron designados OGR1 FL. OGR1
- /-. Ratones en el fondo mixto han sido backcrossed con el C57 /BL6 durante 10 generaciones, el OGR1
+ /+ 10
º ratones generación fueron designados OGR1 tipo salvaje (OGR1 WT)
Fenotipo analiza
ratones KO OGR1 fueron viables y fértiles. Un análisis completo fenotipo del ratón se realizó en dos pares de OGR1 KO y ratones FL (8 semanas de edad, un macho y una hembra en cada grupo), en el recurso compartido de ratón fenotipos, Universidad del Estado de Ohio, Columbus, OH. Para determinar el índice de adiposidad, se utilizó un método publicado anteriormente [28].
ensayos de distribución tisular
Órganos fueron extirpados de los ratones y se fijaron en Zinc (BD, Franklin Lakes, NJ) durante 12 hr -24, después se mantuvo en 70% de etanol antes de ser incluido en parafina y, a continuación se seccionaron a 5 micras. Publicar desparafinación y rehidratación, los portaobjetos se trataron con tampón de citrato durante 20 min y con H
2O
2 (0,3%) en etanol durante 15 min. suero de caballo universal se utiliza para bloquear el tejido seguido de tratamiento con anticuerpos anti-FLAG (1:200 diluciones). VECTOR Novared fue utilizado como el QS sustrato y hematoxilina como tinción de contraste.
El aislamiento de ARN, la transcripción inversa-PCR (RT-PCR)
Los tejidos fueron extirpados de los ratones y se pulveriza a presión después de la congelación en nitrógeno líquido. El ARN total se extrajo utilizando RNeasy mini kit (Qiangen, Maryland) y transcripción inversa de M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). ADNc derivados fueron amplificados utilizando PCR master mix (Promega, Madison, WI). Las secuencias de cebador para OGR1 fueron como sigue: 5'-CTCAATGACCTCCTTGTGATTG-3 'y 5'-CTACCAGAAAACTCCTCACTATC-3'. β-actina se amplificó como un gen de mantenimiento con los cebadores 5'-ACCGCTCGTTGCCATTAGTGATGA -3 'y 5'-AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC-3'.
Brown aislamiento tejido adiposo y la proliferación de células derivadas de tejido adiposo marrón (BADCs)
grasas
Brown fue disecada de la cara dorsal del tórax entre las escápulas, y formalina (10%) fijo & amp; entonces embebidos en parafina, seguido por H & amp; E tinción. Para BADCs de cultivo, la grasa marrón se cortó en piezas pequeñas y se coloca en mismo volumen de solución de colagenasa (DMEM, 1% de penicilina /estreptomicina, 1% de BSA, 1 mg /ml de colagenasa tipo I, filtrada). Esta suspensión se puso en un agitador de C 37 ° a 200 rpm durante 60 min. Después de esto, se añadió medio DMEM (10 ml) que contenía 10% de FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, 2% de glutamina, aminoácidos no esenciales 1% y 1/1000 β-mercaptoetanol a las células de grasa marrón. Después de centrifugación a 2000 rpm durante 5 min, la capa blanca se retiró y los sedimentos celulares se resuspendieron en 10 ml de medio de cultivo, y se filtró a través de un filtro de células. Las células se transfirieron a placas de cultivo celular y se dejaron llegar a confluencia. Para los ensayos de proliferación /supervivencia, las células se mueren de inanición durante 24 horas, después se trataron con diferentes estímulos durante 24 y 48 horas [3]. 10 l de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT, 5 mg /ml) se añadió a las células 3 h antes de la cosecha. La absorbancia de la solución a 550 nm se determinó usando un vector
3 espectrofotómetro (PerkinElmer, Waltham, MA).
macrófagos y osteoclastos generación y caracterización
En los macrófagos peritoneales, los ratones se inyectados ip con 1 ml de TG (4%). Los macrófagos se recogieron cuatro días después de la inyección. Las células se recogieron por lavados peritoneales utilizando RPMI. Después del lavado, las células se cultivaron en medio RPMI con 10% de FBS durante 2 hr. Las células no adherentes se eliminaron y más del 80% de las células adherentes se macrófagos [29]. macrófagos derivados de médula ósea (BMMs) se obtuvieron de los fémures de ratones 6-10 semanas de edad [30]. En resumen, los extremos de los huesos se cortaron, y la médula ósea se lavó abundantemente de los fémures amputadas usando una jeringa de 1 ml para obtener una suspensión, que luego se pasó a través de una aguja de calibre 27 para la dispersión. suspensiones de células de médula ósea (500 l; 1 × 10
6 células) se sembraron en placas de bajo M-CSF [3% L 929 de células-medio condicionado (L-CM) como fuente de M-CSF] en RPMI que contiene 20% FBS. L-CM fue producido por la siembra de 2,5 x 10
5 células en un cm 175-
matraz de cultivo de tejido 2 con 50 ml de medio básico hasta que las células fueron confluentes. A continuación, se recogió el sobrenadante, se filtró a través de un filtro de 0,2-m, y se congeló en alícuotas a -80 ° C. Después de dejar que las células del estroma se adhieran durante la noche, se recogieron las células no adherentes y se sembraron en alta M-CSF (30% L-CM). Después de tres días, se retiró el medio junto con las células no inscritos, y nuevo medio que contiene 30% se añadió L-CM. macrófagos adherentes eran poblaciones homogéneas después de 7 días de cultivo. Las células se tiñeron con Diff-Quick y contados. Para diferenciar en los osteoclastos, macrófagos medio fresco con RANKL se añadió (50 ng /ml) en el tercer día y anotó tres días después por el recuento de células TRAP positivas.
fagocitosis y el óxido nítrico (NO) ensayos de producción
Los macrófagos peritoneales (1 × 10
4 células /300 L) se incubaron en placas de 48 pocillos y se trató con perlas de látex (1 × 10
6) durante 3 horas. Los ensayos se terminaron mediante el lavado de las células con PBS enfriado en hielo. Las células se fijaron en metanol durante 30 min. La fagocitosis se cuantificó con un microscopio fluorescente contando el número de perlas internalizados en al menos 200 células, que se registró como el índice de phagocytotic por la fórmula: 100 × número (célula con un talón + 3,5 × número de células con 2-5 perlas + 8 × número de células con 6-10 granos + 20 × número de células con más de 10 granos) /número total de células. Para la producción de NO, los macrófagos peritoneales (5 × 10
5) en 100 l de RPMI que contiene 10% de FBS se cultivaron en placa de 96 pocillos durante 2 horas a 37 ° C. Las células se trataron mediante la sustitución con medio (0,5% de SFB en 100 l) y LPS (50 l de 1 mg /ml) durante 18 hr. Los niveles de NO en el sobrenadante se analizaron mediante la mezcla del mismo volumen de sobrenadantes (100 l) y reactivo de Griess en una nueva placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y se leyó a 570 nm usando un lector de placas. La concentración de nitrito en el sobrenadante del cultivo se calculó a partir de una curva estándar generada a partir de la dilución de nitrito de sodio en agua a un intervalo de concentración de 0,01 a 100 mM.
producción de prostaglandina y la COX-2 expresión
95% de células confluentes en placas de 24 pocillos se trataron con diferentes tampones de pH para 9 hr o 25 hr [31], [32]. Los sobrenadantes se recogieron para el análisis de prostaglandina usando HPLC-espectrometría de masas (API-4000, Applied Biosystems). En breve, las prostaglandinas se extrajeron a partir de sobrenadantes de células (500 l en cada muestra) en la presencia de 14:00 de ácido lisofosfatídico (LPA, 10 pmol) como patrón interno usando cloroformo (2 ml), metanol (2 ml) y HCl (6 N, 10 l). Los iones con el m /z a 351 (el ion primario) y 271 (el ion secundario) se utilizaron para la identificación de las prostaglandinas. Un TARGA C18 5 mM, 2,1 mm de diámetro x 10 mm de TR-0121-C185 (Higgins Analytical, Southborough, MA EE.UU.) se utilizó la columna de HPLC, y la fase móvil fue MeOH /agua /NH
4OH (90:10: 0,1, v /v /v), 6 min /muestra. Los sedimentos celulares se recogieron para el análisis de la expresión de COX-2.
análisis de Western blot
Los macrófagos (10
6) se cultivaron en placas de 6 pocillos se lavaron con PBS y estimulados por LPS ( 100 ng /ml), SPC o LPC (2,5 M) durante 30 min. Las células se lisaron en 100 l de tampón de muestra de Laemmli (BIO-RAD, Hercules, CA), el extracto se resolvieron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon en leche desnatada al 5% durante 2 horas y después se incubaron con anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas fueron desarrolladas utilizando un ECL plus sistema de detección de Western blotting (GE Healthcare, Buckinghamshire Reino Unido). La carga de proteína se verificó mediante la eliminación y reprobing los borrones con anticuerpos contra β-actina
.
El AMP cíclico (AMPc) la supervivencia celular y la producción a diferentes pH
Los macrófagos peritoneales se sembraron en 24 placas Bueno, tratados con diferentes tampones de pH que contiene el inhibidor de la fosfodiesterasa isobutilmetilxantina (IBMX, 1 mM) durante 30 min, y luego se lisaron con HCl 0,1 M (60 l). Los lisados celulares se utilizaron para el ensayo de cAMP de acuerdo con las instrucciones del kit (Cyclic AMP EIA Kit, de Cayman, Cat#581001). Para los ensayos de supervivencia, macrófagos o los osteoclastos derivados de médula ósea se sembraron en placas de 96 pocillos durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO
2 y después se cultivaron en un medio a diferentes pH a 37 ° C con 0% de CO
2 durante 20 horas.
histomorfométrico del hueso y análisis inmunohistoquímicos
muestras óseas de animales 8 semanas de edad se fijaron en solución de Bouin durante la noche, descalcificado en EDTA (14%) de 12 día, y embebidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con el Kit de tricrómico de Masson para la observación morfológica.
melanoma tumorigénesis
p>
7 y 5 × 10
5 células en 100 l de PBS se inyectaron por vía subcutánea en los flancos del fondo mixto y los ratones fondo puro C57 /BL6, respectivamente. Los ratones se sacrificaron cuando aparecieron moribundo (9-14 días después de la inyección). La investigación con animales cumplido con todas las directrices federales pertinentes y las políticas del Centro de Recursos Animales de Laboratorio de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana.
Los análisis estadísticos
Todos los datos de este estudio se expresaron como media ± desviación estándar de tres o más experimentos independientes por triplicado. Se analizaron las diferencias entre los grupos de tratamiento usando de Student
t
de prueba y de dos colas de distribución en Microsoft Excel.
Resultados
Generación de ratones deficientes OGR1 y la expresión en los tejidos OGR1
Para estudiar el papel fisiológico de OGR1, hemos establecido una cepa de ratones deficientes OGR1. Generación de ratones deficientes OGR1 se describe en detalle en los Materiales y Métodos. La estrategia general para construir el vector de orientación OGR1 se muestra en la Figura 1A. Los resultados de OGR1 genotipado se muestran en la Figura 1B. OGR1 se expresó en el pulmón, testículo, corazón, cerebro, bazo, timo, grasa marrón, intestino delgado, colon, leucocitos de sangre periférica (PBL), los macrófagos, estómago, ovario, y grasa blanca, pero no en el hígado, riñón, y el músculo esquelético de los ratones OGR1 FL, como se detecta por RT-PCR. expresión OGR1 en la próstata era débil, pero detectable (Figura 2A). La falta total de expresión OGR1 en ratones KO OGR1 se confirmó en todos los tejidos examinados. Insertamos una etiqueta de tres FLAG delante de OGR1 en el constructo ronda en la que la expresión OGR1 endógeno a nivel de proteína se puede detectar en tejidos usando anticuerpo anti-FLAG M2. La tinción inmunohistoquímica de los pulmones de los ratones OGR1 FL mostró que OGR1 se expresó en el cuboidal /columar células epiteliales que cubren las grandes vías respiratorias del pulmón y en las células del músculo liso vascular en los alrededores de un vaso sanguíneo grande (Figura 2B). Este patrón de expresión tisular de OGR1 fue similar a la observada en los tejidos humanos como se ha demostrado anteriormente [1], [33].
(A) Estrategia para la construcción del vector de orientación OGR1. (B) La genotipificación se realizó para identificar floxed (FL), - /- (KO) y ratones + /+ (WT) guía empresas
(A) OGR1 expresión en diversos tejidos de los ratones KO y FL. detectado por RT-PCR. El programa de PCR fue de 94 ° C, 2 min; 25 ciclos para la actina y 35 ciclos para OGR1 (94 ° C, 30 s; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min); 72 ° C, 10 min, excepto tanto actina y OGR1 en los macrófagos se amplificaron por 30 ciclos. BAT, el tejido adiposo marrón; BM, la médula ósea; PBL, leucocitos de sangre periférica. Las flechas indican las escaleras de ADN con 500 pares de bases. (B) la distribución OGR1 en el tejido pulmonar de los ratones FL y C57 /BL6. Se utilizó anticuerpo anti-FLAG M2 (1:200). Representativos células teñidas positivamente se indican mediante flechas. Barra de escala = 100 micras.
análisis fisiológicos generales de los ratones KO OGR1 y anomalías del tejido adiposo marrón (BAT) en el fondo mixto
ratones KO OGR1 fueron viables y fértiles. Un análisis completo fenotipo del ratón se realizó en dos pares de ratones KO OGR1 y OGR1 FL (8 semanas de edad, un macho y una hembra en cada grupo). Los pesos corporales no difieren sustancialmente entre los ratones examinados. En estos dos pares de ratones, los bazos de ratones KO OGR1 parecían ser algo más pequeños que los de los ratones FL, mientras que los hígados y los corazones de los ratones KO eran algo más grandes que los de los ratones FL. Sin embargo, un análisis adicional en más ratones no demostró diferencias estadísticas en estos pesos de los órganos (datos no mostrados). Los análisis histológicos en FL y KO no reveló diferencias significativas en la mayoría de los tejidos, y los datos representativos se muestran en la Figura 3.
El representante de H & amp; E se presentaron tinción del hígado, riñón, testículos, próstata, ovario y útero. Barra de escala = 100 micras.
El primer análisis también reveló que el depósito BAT interescapular era más pesado en los ratones KO (0.35 y 0.28 g) que el FL (0,10 y 0,11 g), que puede ser relacionada con la adiposidad alterada en los ratones KO. No se observaron diferencias consistentes en pesos y tamaños de BAT en pares adicionales de los ratones KO y FL (Figura 4A). H & amp; E tinción mostró que mientras los tejidos de grasa blanca (WAT) de ratones FL y KO fueron similares, el MTD de ratones KO eran menos densa en comparación con los de ratones FL (Figura 4B), que pueden estar relacionados, en parte, a la tamaño ampliado de la MTD en ratones KO OGR1.
tejidos adiposos (a) de Brown en los ratones KO eran más grandes que los de los ratones FL. (A) Los pesos de BAT (9 ratones de FL y 9 ratones de KO). (B) la apariencia Representante de las mejores técnicas de ratones KO y FL. (B) H & amp; E tinción de BAT y WAT en ratones KO y FL. * Representa un
valor de P Red de & lt; 0,05 y *** representa un
P valor Red de & lt; 0,001. Barra de escala = 100 m.
OGR1 se ha demostrado que tienen actividad de protones de detección en diversas células [3], [6], [9], [34]. Además, SPC puede modular las acciones de OGR1 [6], [9]. SPC se ha demostrado que induce la proliferación de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano a través de la activación de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) [35]. Para probar si el MTD de ratones KO FL y responder de forma diferente al pH y /o SPC, aislamos BADCs y probado los efectos de SPC o cambios de pH sobre la proliferación celular. SPC (2,5 M) estimuló modestamente la proliferación de células a las 24 horas y este efecto no fue significativamente diferente en BADCs de FL frente a ratones KO (Figura 5A). pH ácido indujo niveles más bajos de la proliferación que el pH fisiológico (7,4), y de nuevo se observó ninguna diferencia estadística en BADCs de FL
vs.
ratones KO (Figura 5B). Hemos backcrossed OGR1 ratones deficientes en C57 /BL6 fondo (10 generaciones). Cuando examinamos BAT en ratones WT y KO en el fondo C57 /BL6, no se observaron diferencias (datos no presentados), lo que sugiere que la anomalía BAT está relacionado con el fondo del ratón.
(A) SPC estimuló la proliferación no fue significativamente diferente en la MTD de FL
vs.
ratones KO. Se utilizó SPC (2,5 M) o LPC (2,5 M). (B) El efecto del pH sobre la proliferación no fue significativamente diferente en FL
vs.
KO. Los resultados de esta figura son representativos de al menos 3 experimentos independientes. (SEGUNDO).