Extracto
in vitro y modelos basados en células de cáncer de pulmón se emplean con frecuencia para estudiar la invasión y los mecanismos detrás de la metástasis. Sin embargo, estos modelos suelen estudiar un solo tipo celular con cultivos celulares en monocapa (2D) de dos dimensiones, que no reflejan con exactitud la complejidad de la inflamación
in vivo
. Aquí, se utilizó un modelo de gel tridimensional (3D) de colágeno de células co-cultivo, que contiene las células humanas de adenocarcinoma de pulmón (HCC), células de fibroblastos de pulmón humano (MRC-5), y macrófagos. Se recogieron los medios de cultivo de células y las imágenes de células, y se monitorizó la metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1) y la producción de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), bajo diferentes condiciones de cultivo celular. Se encontró que simulan condiciones de hipoxia y /o suero de inanición inducida elevada secreción de VEGF en el modelo de co-cultivo 3D
in vitro
, pero no MMP-1; la morfología de HCC en el 2D en comparación con el sistema de co-cultivo 3D fue muy diferente. MMP-1 y VEGF se secretaron a niveles más altos en los grupos de células mixtas en lugar de grupos mono-cultivo. Por lo tanto, la incorporación de células de cáncer de pulmón, fibroblastos y macrófagos puede reflejar mejor los mecanismos fisiológicos de metástasis en comparación con los sistemas de mono-cultivo. Las células del tumor del estroma, macrófagos y células de fibroblastos pueden promover la invasión y la metástasis, que también proporciona una nueva dirección para el diseño de terapias dirigidas a destruir el estroma de los tejidos tumorales
Visto:. Liu Xq, Kiefl R, Roskopf C, F Tian, Huber RM (2016) las interacciones entre las células del cáncer de pulmón, fibroblastos, macrófagos y en 3D co-cultivos y el impacto sobre la MMP-1 y VEGF expresión. PLoS ONE 11 (5): e0156268. doi: 10.1371 /journal.pone.0156268
Editor: Pankaj K. Singh, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 27 de septiembre de 2015; Aceptado: 11-may de 2016; Publicado: 27 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los informes de tumores malignos pulmonares se remontan tan lejos como la antigüedad, y por la mitad del siglo XX, el cáncer de pulmón se había convertido en epidemia y estaba firmemente establecido como la principal causa de muertes relacionadas con cáncer en América del Norte y Europa, tras la introducción de cigarrillos baratos, producidos en masa [1]. En la actualidad, el cáncer de pulmón es el tipo más común de cáncer en todo el mundo, lo que representa más de 1,35 millones de casos por año [2]. A pesar de los avances significativos en el tratamiento de las primeras etapas de la enfermedad, las tasas de supervivencia para las etapas avanzadas de cáncer de pulmón sigue siendo bajo; la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón en etapa tardía mueren dentro de los 18 meses del diagnóstico [3]. La evidencia acumulada demuestra que, si bien la mayoría de los investigadores del cáncer se centran exclusivamente en las células del cáncer de pulmón, hay un creciente reconocimiento de que el microambiente tumoral (TME) y las interacciones con el tumor del estroma juegan un papel importante durante el proceso de establecimiento del cáncer de pulmón, la invasión y la metástasis. El estroma del tumor se compone tanto de la matriz extracelular (ECM) y componentes celulares. El ECM incluye proteoglicanos secretados que juegan un papel tanto estructural y señalización celular. Componentes celulares incluyen células inmunes, fibroblastos asociados con el cáncer (CAF), células endoteliales, adipocitos, células derivadas de médula ósea, miofibroblastos y fibroblastos [4]. estudios de genómica funcional han identificado genes de las firmas que son de pronóstico para la supervivencia del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), incluidos los genes que codifican las proteínas ECM [5], que pone de relieve el papel del estroma en el pronóstico del paciente y la supervivencia.
en este estudio, hemos elegido para investigar la MMP-1 y VEGF como indicadores de la interacción entre las células tumorales y el estroma, porque ambos han sido claramente vinculado con la invasión tumoral y la metástasis. Estudios anteriores demuestran que MMPs juegan un papel relevante en el cáncer [6]. MMPs pueden degradar diversas proteínas asociadas con el ECM. Como resultado, las células tumorales pueden moverse más fácilmente durante los procesos de invasión y metástasis. MMP-1 pertenece a la familia MMP y es conocida como colagenasa o gelatinasa, que degrada el colágeno IV y se incrementa en las células cancerosas altamente metastásicas [7]. VEGF se identificó y se aisló como un mitógeno específico de células endoteliales, que tiene la capacidad de inducir la angiogénesis fisiológica y patológica esencial para el establecimiento de nuevos vasos sanguíneos [8, 9]. En un tumor sólido, durante el proceso de expansión, las partes centrales de la hipóxico convertido tumor, que promueve la producción de VEGF y por lo tanto, la proliferación del tumor [10]. Además, estudios recientes han demostrado que las actividades inducidos por VEGF en las células tumorales incluyen la invasión tumoral y la metástasis [11].
La mayoría de los grupos de investigación han utilizado monocapas de células cultivadas en plástico de cultivo de tejidos, que son menos complejos, menos adaptables, y no es muy representativa del microambiente extracelular fisiológica presente en los seres humanos [12]. Cuando las células se cultivan en las superficies de plástico rígido de frascos de cultivo, que sólo pueden crecer lejos de la de plástico de una manera 2 dimensiones (2D). Además, muchos estudios indican que los cultivos de células 2D no pueden reflejar adecuadamente la complejidad fisiológica de tejido real, y su uso en ensayos basados en células, en cierta medida podría dar lugar a errores en la predicción de respuestas específicas de tejido. Las células cultivadas en formatos 2D se someten a la proliferación y a continuación la desdiferenciación, en consecuencia, la pérdida de sus funciones esenciales [13]. En contraste, las células cultivadas en una matriz 3D son radicalmente diferentes en cuanto a la proliferación, la diferenciación, la morfología y funcionalidad celular [14, 15]. En este estudio, hemos establecido un modelo de co-cultivo organotípico compuesto de células de adenocarcinoma de pulmón (HCC), fibroblastos de pulmón (MRC-5), y las células inmunes (macrófagos), que no sólo permite la exploración de las interacciones entre las células tumorales y estroma las células, sino que también representa un modelo que es más un reflejo de las condiciones actuales
in vivo
.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Todos los celulares líneas fueron proporcionados por el Laboratorio V Clínica médica de la Universidad Ludwig-Maximilians. Células MRC-5 se cultivaron en Eagle medio esencial mínimo (LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania). Para hacer que el medio de crecimiento completo, hemos añadido suero bovino fetal (FBS) a una concentración final de 10%. células de HCC se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% FBS (Biochrom AG, Berlin, Alemania). Los macrófagos se cultivaron en F-12 K medio de Ham (LGC Standards GmbH, Wesel, Alemania) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml solución de estreptomicina, y 2 mM L-glutamina (PAA).
3D gel de colágeno de co-cultivo modelo
Antes de la preparación del gel de colágeno, las células se descongelaron y se diluyeron hasta 2 x 10
5 células por pocillo. La proporción de las células se estableció como sigue: 5: 5: 1 HCC: MRC-5: macrófagos. Para los ensayos de Western blot, las células se colocaron en 2 x 10
5 y 1 x 10
6 células por grupo. Para preparar los geles, colágeno (Invitrogen, Darmstadt, Alemania), estéril 10X tampón fosfato salino (PBS), agua destilada estéril (ddH
2O), y NaOH 1N estéril se mezclaron en hielo. El volumen total de gel de colágeno se calculó como sigue:.
En un tubo estéril mezclar el dH
2O, NaOH 1N, y 10X PBS
La concentración final de colágeno fue de 1 mg /ml, y 0,5 ml se dispensó en cada compartimiento de disco de cultivo y se colocaron inmediatamente en hielo. Las células se siembran a continuación en el gel de colágeno, que se pipeteó varias veces para mezclar bien. Los geles fueron retirados a temperatura ambiente donde se solidifican rápidamente. Los cultivos se incubaron a continuación a 37 ° C en un incubador humidificado durante 30-40 minutos, o hasta que se formó un gel firme. Cada compartimiento plato luego recibió un volumen total de medios de 1,0 ml de cultivo.
Western blotting
sobrenadantes de cultivo de células se recogieron a 48 h. tubos Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemania) se utilizaron para recoger las proteínas a partir del sobrenadante que tenía un peso molecular mayor que 30 kDa. Las concentraciones de proteína se midieron con un kit de no interferencia de ensayo de proteínas (Calbiochem, EMD Bioscience Inc., Darmstadt, Alemania) usando una albúmina de suero bovino (BSA) curva estándar (Bio-Rad Laboratories, Munich, Alemania) |
An-MMP-1 anticuerpo anti producido en ratones se utilizó (Sigma-Aldrich Saint Louis, EE.UU.) con un anti-ratón secundaria de anticuerpos IgG-HRP de cabra (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemania). 40 g de proteína de cada muestra se diluyó con tampón de muestra, mientras que ddH
2O se añadió a un volumen final de 35 l. Las membranas se bloquearon en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante al menos 1 h y después se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1: 200 en tampón de bloqueo. Las membranas fueron incubadas con diluido 1: 5.000 de anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente el día siguiente. Las imágenes fueron analizados utilizando el software de lectura de imágenes LAS-R (Leica Microsystems, Alemania). valores IOD (densidad óptica integrada) se generaron /analizado con software analizador Gel-Pro (Media Cybernetics EE.UU.).
HCC y células de macrófagos
Las células se lavaron dos veces utilizando pre-calentado (37 ° C) PBS para eliminar cualquier medio de cultivo celular residual. A continuación, añade 10 ml de pre-calentado (37 ° C) Solución de trabajo CFDA SE célula trazador (Invitrogen, Darmstadt, Alemania). Las células se incubaron entonces durante 15 minutos a 37 ° C. Entonces hemos sustituido la solución de carga con medio fresco, precalentado y se incubaron los cultivos durante otros 30 minutos a 37 ° C. Esta técnica manchado HCC, las células de macrófagos, y células MRC-5 en el modelo de gel de colágeno 3D descrito anteriormente. Después de 48 h de co-cultivo, las morfologías celulares se observaron por microscopía confocal.
Las secciones congeladas de geles de colágeno teñidas con DAPI y falotoxinas
Se prepararon secciones congeladas después de 48 h de gel de colágeno 3D co-cultivo, y las muestras se montaron en cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 min. a continuación, las muestras se lavaron tres veces con PBS durante 3 min cada vez. Las muestras fueron fijadas en 3,7% de formaldehído en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. a continuación, las muestras se lavaron tres veces más con PBS. A continuación, cada cubreobjetos se colocó en una placa de Petri de vidrio y se extrajo con una solución de 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 3 a 5 minutos y se lavó de nuevo tres veces con PBS. Cuando la tinción con los falotoxinas fluorescentes (Invitrogen, Darmstadt, Alemania), se diluyeron 5 l solución de metanol en 200 l de PBS a cada cubreobjetos a teñir. Para reducir la tinción de fondo no específica con estos conjugados, hemos añadido 1% de BSA a la solución de tinción. Los cubreobjetos donde después se colocaron en solución de tinción durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la tinción, los cubreobjetos se lavaron tres veces con PBS. Contratinción se realizó con DAPI (Invitrogen, Darmstadt, Alemania). DAPI solución madre se diluyó a 300 nM en PBS, y se añadió aproximadamente 300 l de esta solución de tinción DAPI para la preparación cubreobjetos, cubriendo completamente los cubreobjetos. Los cubreobjetos se incubaron durante 1-5 minutos y se enjuagaron tres veces en PBS durante 10 min. Las muestras fueron luego imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia. Las muestras fueron secadas al aire, montados, y se almacenaron en la oscuridad a 2-6 ° C.
Elisa
sobrenadantes de cultivo de células se recogieron en diferentes puntos temporales y se almacenaron a -20 ° C . Un humano MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich Saint Louis, EE.UU.) y humano VEGF DuoSet ELISA Kit (amp I +;. D Systems GmbH Wiesbaden, Alemania) se utiliza para medir los niveles de estas proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Estadísticas
Todos los experimentos se realizaron por triplicado durante un mínimo de tres experimentos independientes. El paquete de software SPSS 19.0 (International Business Machines Corporation) se utilizó para el análisis estadístico. Los datos se representan como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre los dos grupos se compararon mediante un
t-
prueba. Cuando se analizaron tres o más grupos, se utilizaron un modelo lineal y Pearson correlaciones o pruebas de SNK.
P Hotel & lt; 0,05 indica una diferencia estadística.
Resultados
La expresión de MMP-1 en modelos 3D con cáncer de pulmón de co-cultivo mono o
HCC, MRC-5, y macrófagos co grupos -Cultura, junto con grupos mono-cultivo de macrófagos MRC-5, HCC, y se cultivaron en FBS al 10% y O
2, como se describe en los métodos. Cada grupo tenía 2 x 10
5 células sembradas, y la relación de HCC, MRC-5, y macrófagos en el grupo de co-cultivo era 5: 5: 1, y el grupo CHC y MRC-5 co-cultivo era 1 :. 1 |
Después de 48 h, la expresión de MMP-1 en el HCC, MRC-5, y del grupo de co-cultivo de macrófagos (1337.00 ± 42.43) fue mayor que en el CHC y MRC-5 co grupo de cultivo (1166,25 ± 56,21), que también fue mayor que en el grupo mono-cultura MRC-5 (991,50 ± 19,09) y fue significativamente mayor que el HCC (284,00 ± 18,38) y macrófagos (98,50 ± 7,12) grupos mono-cultivo. CHC y grupos mono-cultivo de macrófagos mostraron casi ninguna expresión de MMP-1. MMP-1 fue significativamente mayor en los grupos de co-cultivo que los grupos mono-cultivo (n = 3,
P
& lt; 0,05, Tabla 1 y Figura 1A, detectado por ELISA).
(a) Expresión de modelos de cáncer de pulmón de co-cultivo MMP-1 en 3D mono- y a las 48 h detectados por ELISA. La expresión de MMP1 en el CHC & amp; MRC-5 & amp; grupo de co-cultivo de macrófagos era más alta que en HCC & amp; MRC-5 grupo de co-cultivo, o MRC-5 grupos mono-cultura /macrófagos /HCC. Casi no hubo expresión de MMP1 en el grupo mono-cultura /macrófagos HCC. (B) Expresión de MMP-1 en mono- 3D y co-cultivo modelo de cáncer de pulmón a las 48 h detectados por Western Blot. En la figura 1B, una, el peso molecular de MMP-1 es de 52 kD. De izquierda a derecha, los carriles son: HCC grupo mono-cultivo (2 x 10
5 células); MRC-5 grupo mono-cultivo (2 x 10
5 células); grupo de co-cultivo de células MRC-5 y carcinoma hepatocelular (2 x 10
5 células); HCC grupo mono-cultivo (1 x 10
6 células); MRC-5 y HCC grupo de co-cultivo (1 x 10
6 células); MRC-5 grupo mono-cultivo (1 x 10
6 células). La expresión de MMP-1 en los grupos de co-cultivo fue mayor que en los grupos de monocultivo (ambos 2 x 10
5 células y 1 x 10
6 células). La expresión de MMP-1 en el
6 grupo celular 1 x 10 era más alta que la
grupo celular de 2 x 10 5, independientemente de mono-cultivo o designaciones de grupo de co-cultivo. En la figura 1B, b, se muestran los valores medios IOD de la transferencia de Western. (C) Expresión de MMP-1 bajo diferentes condiciones de co-cultivo. La expresión de MMP1 por debajo del 10% de SFB y O
2 (10% de FBS medio de cultivo celular con O
2) fue mayor que en virtud de w /o de FBS y W /O O
2 (sin FBS y sin O
2) a los 7 puntos de tiempo diferentes. Por otra parte, la tendencia expresión de MMP1 bajo la condición de w /o de FBS y W /O O
2 continuaron descendiendo desde 120 h.
La expresión de MMP-1 se investigó adicionalmente por Western Blot. grupos de HCC y MRC-5 grupos de monocultivo y el HCC y MRC-5 de co-cultivo se dividieron en 2 x 10
5 células y 1 x 10
6 grupos de células, tal como se describe en los métodos. La relación de la HCC y MRC-5 grupo de co-cultivo era 1: 1. Se encontró que la expresión de MMP-1 en los grupos de co-cultivo fue mayor que en los grupos mono-cultivo, tanto en el 2 x 10
5 grupos celulares y 1 x 10
6 grupos celulares. Por otra parte, la expresión de MMP-1 en los 1 x 10
6 grupos de células fue mayor que el 2 x10
5 grupos de células, independientemente de monocultivo o agrupación de co-cultivo (n = 5, P & lt; 0,05, Tabla 2 y la figura 1B).
La expresión de MMP-1 en un modelo de cáncer de pulmón de co-cultivo 3D bajo diferentes condiciones de co-cultivo
La expresión de MMP 1 en HCC y el modelo de co-cultivo-5 MRC fue analizado bajo diferentes condiciones de cultivo: 10% de FBS y O
2 (10% de medio de cultivo de células FBS con O
2), y con ninguno (sin FBS y O
2) para explorar el efecto de la hipoxia simular y privado de la condición de suero fetal bovino en la secreción de MMP-1. sobrenadantes de cultivo de células se recogieron por separado de los modelos de colágeno de co-cultivo 3D en siete diferentes puntos de tiempo de 48 a 192 h. Cada grupo tenía un número igual de células (2 x 10
5) con una relación de 1: 1. Se encontró que la expresión de MMP-1 con 10% de SFB y O
2 fue mayor que la expresión sin FBS y O
2 para todos los siete puntos de tiempo. Por otra parte, la MMP-1 de expresión sin FBS y O
2 disminuyó de 120-192 h (n = 3, P & lt; 0,05, Tabla 3 y Figura 1C).
La expresión de VEGF en modelos de cáncer de pulmón de mono o de co-cultivo 3D Barcelona grupos
HCC, MRC-5, y los macrófagos de co-cultivo, junto con MRC-5, HCC, y grupos mono-cultivo de macrófagos se cultivaron en FBS al 10% y o
2, como se describe en los métodos. Cada grupo tenía 2 x 10
5 células sembradas y la relación de HCC, MRC-5, y los macrófagos; el grupo de co-cultivo fue de 5: 5: 1 y el grupo de co-cultivo HCC y-5 MRC fue 1:. 1
HCC, MRC-5, y macrófagos grupos mono-cultivo se cultivaron por separado, y sobrenadantes de cultivos celulares se recogieron después de 48 h. Hemos encontrado que la expresión de VEGF en el grupo mono-cultura HCC (241,97 ± 78,56) fue significativamente mayor que en el mono-cultura MRC-5 (12,69 ± 5,46) y el macrófago mono-cultivo (13,65 ± 7,44) grupos (n = 3,
P Hotel & lt; 0,05, Tabla 4 y figura 2A) guía empresas
(a) La expresión de VEGF en el CHC, MRC-5, y macrófagos grupos mono-culturas.. La expresión de VEGF en el grupo mono-cultura HCC fue significativamente mayor que la expresión en el grupo mono-cultura MRC-5 /macrófagos bajo 10% de FBS y O
2 condiciones de cultivo. (B) Expresión de VEGF en HCC, MRC-5, y los grupos de co-cultivo de macrófagos en comparación con el grupo mono-cultura HCC. La expresión de VEGF en el HCC & amp; MRC-5 & amp; grupo de co-cultivo de macrófagos fue mayor que en el HCC & amp; MRC-5 grupo de co-cultivo y el grupo mono-cultura HCC cultivaron con 10% de SFB y O
2 durante 48 h. (C) Expresión de VEGF en HCC, MRC-5, y los grupos de macrófagos de co-cultivo bajo diferentes condiciones de co-cultivo. La expresión de VEGF en células cultivadas w /o FBS (hambre de FBS pero con O
2), w /o de FBS y w /o O
2 (sin FBS y sin O
2) fue mayor que en 10% de FBS o o
2 (medio de cultivo celular 10% de FBS con o
2), mientras que la expresión de VEGF en las tres condiciones diferentes aumentó primero y luego disminuyó.
El HCC, MRC-5, y el grupo de los macrófagos de co-cultivo, HCC y MRC-5 grupo de co-cultivo, y el grupo mono-cultura HCC (como control) se cultivaron por separado, y se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células en 48 h. La expresión de VEGF en tanto HCC, MRC-5, y macrófagos (492,84 ± 51,43) y los grupos de co-cultivo CHC y MRC-5 (429.63 ± 54.13) fue mayor que en el grupo mono-cultura HCC (208,31 ± 46,45). La expresión de VEGF en el HCC, MRC-5, y el grupo de los macrófagos de co-cultivo fue también más alto que el HCC y el grupo co-cultivo-5 MRC (n = 3,
P
& lt; 0,05, Tabla 5 y la figura 2B).
la expresión de VEGF en el HCC, MRC-5, y en 3D co-cultivo de macrófagos modelo de cáncer de pulmón en diferentes condiciones de co-cultivo
HCC, MRC grupos de co-cultivo -5, y los macrófagos se cultivaron bajo tres condiciones diferentes: 10% de SFB con O
2 (medio de cultivo celular 10% de SFB con O
2), 0% de SFB con O
2 ( falto de FBS, pero con O
2), y sin ambos (sin FBS y sin O
2). sobrenadantes de cultivo de células se recogieron a diez puntos de tiempo diferentes. Hemos encontrado que la expresión de VEGF en condiciones con 0% de FBS y O
2 y sin tanto fue mayor que la expresión en el FBS 10% con O
2 grupo, mientras que la tendencia de la expresión de VEGF en los tres condiciones aumentaron en primer lugar, luego disminuyó (n = 3,
P Hotel & lt; 0,05, Tabla 6 y figura 2C).
2D y el modelo de co-cultivo 3D
se estableció un modelo de co-cultivo de gel de colágeno 3D (figura 3A). Medio de cultivo celular impregnado en el gel de colágeno, y se suspendieron las células cultivadas en el espacio 3D.
(A) de colágeno 3D modelo de co-cultivo. La figura 3A, a: 1,0 ml de medio de cultivo celular impregnado en el gel de colágeno a partir de la parte superior, y se suspendieron las células cultivadas en el espacio de gel de colágeno 3D dentro. La figura 3A, b: 0,5 ml de gel de colágeno se confirmó en cada compartimento placa de cultivo de forma independiente. (B) morfologías celulares en modelos 2D y 3D de co-cultivo a las 48 h. La figura 3B, A: imagen de células de HCC y macrófagos en 2D modelo de co-cultivo. La punta de flecha indica un celular HCC, que es plana y no esférica. Punta de flecha indica macrófagos rodean una célula CHC en un aumento de 40X. La figura 3B, b: Imagen de células de HCC y macrófagos en nuestro modelo 3D co-cultivo. Punta de flecha indica un celular HCC, que es subgloboso y espinoso. Punta de flecha indica un macrófago. Esta imagen muestra que estas células están en contacto uno con el otro, como se ve con CFDA SE Rastreador en un microscopio confocal. (C) Imágenes de HCC, MRC-5, y co-cultivos de macrófagos a las 48 y 168 horas a 40 aumentos. La figura 3C, a: Los macrófagos células de contacto y HCC ataque después de 48 h de co-cultivo. Las puntas de flecha indican HCC, macrófagos, y células MRC-5. La figura 3C, b: Co-cultivo después de 7 días. Como se ve en esta imagen después de 7 días de cultivo, las células comenzaron a separarse y flotar en el medio, habiendo perdido su vitalidad y morfología normal de las células. La mayoría de las células de HCC y macrófagos estaban muertos. (D) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células MRC-5, macrófagos, y el CHC en el modelo 3D. Fig 3D (superior): imágenes de microscopio de fluorescencia de células MRC-5, macrófagos, y culturas de HCC (Fig 3D, a). Las células se tiñeron con DAPI (Fig 3D, c) y falotoxinas (Fig 3D, b). Fig 3D (inferior): imágenes de microscopio de fluorescencia de los macrófagos (Fig 3D, d). Las células se tiñeron por DAPI (figura 3D, f) y falotoxinas (Figura 3D, E).
morfologías celulares en nuestros modelos 2D y 3D se compararon (Figura 3B). En el modelo de co-cultivo 2D, la forma de las células de HCC era plana y no esférica (Fig 3Ba), mientras que en el modelo 3D, las células de HCC eran subglobosos y espinoso (Fig 3bb). Por lo tanto, la forma de las células de HCC fue dramáticamente diferente entre los modelos en 2D y 3D.
Además, imágenes de células recogidas después de 48 h de co-cultivo mostró que los macrófagos se pusieron en contacto y ataca las células de HCC (Fig 3CA), mientras que después de 7 días de co-cultivo podíamos ver las células que flotan en el medio que perdió su viabilidad y tenían morfologías alterado. Tanto el CHC y poblaciones de macrófagos fueron en gran medida muertos (Fig 3CB). Imágenes de microscopía de fluorescencia de secciones congeladas del modelo de macrófagos, y HCC MRC-5 y el modelo 3D de macrófagos, también se recogieron (figura 3D).
disscussion
El reto en el desarrollo de terapias novedosas radica en el establecimiento de
in vitro y modelos que reflejan mejor las condiciones actuales
in vivo
. Los primeros modelos en 2D proporcionan una visión mecanicista en la metástasis básica NSCLC. Sin embargo, estos sistemas de modelos no pueden abarcar toda la gama de redundancia de señalización y /o mecanismos de compensación. técnicas de cultivo de células co-3D que utilizan las células del cáncer en combinación con células estromales podrían ser una vía prometedora para la construcción de un modelo más representativo.
En nuestro estudio, hemos establecido un modelo tridimensional de colágeno co-cultivo con pulmonar células cancerosas de adenocarcinoma, fibroblastos de pulmón, y las células inmunitarias (macrófagos). Este modelo se diseñó para explorar el microambiente tumoral y las interacciones entre cáncer de pulmón y las células del estroma durante el proceso de la invasión del cáncer de pulmón y metástasis. Roskelley et al. y Mitragotri et al. encontraron que las células cultivadas en una matriz 3D mostraron dramáticamente diferentes propiedades en términos de la proliferación, la diferenciación, la morfología y la función celular [14, 15]. Del mismo modo, nos encontramos con que la morfología de las células de adenocarcinoma de pulmón HCC fue significativamente diferente entre los modelos de co-cultivo 2D y 3D. En el modelo de co-cultivo 2D, las formas de las células de HCC fueron aplanadas y en forma de hoja, que pone en la parte inferior de la placa de cultivo celular, mientras que en el modelo 3D, las células de HCC fueron subgloboso y espinoso. Este modelo de cáncer de pulmón de co-cultivo 3D no sólo proporciona una matriz extracelular de las células de cáncer de pulmón, que es crítica a su forma y función, pero también aparece para simular mejor las condiciones de vida y las interacciones celulares que ocurren
in vivo
.
en nuestro estudio, se encontró que los niveles de MMP-1 eran casi indetectables en HCC y grupos de monocultivos de macrófagos. Los niveles de VEGF eran también casi indetectable en el grupo de monocultivo MRC-5 y los macrófagos, aunque ambos MMP-1 y VEGF se expresaron abundantemente en co-cultivos de estas células. Estos resultados demuestran las interacciones entre cáncer de pulmón y las células estromales son importantes para la expresión de estos marcadores de la metástasis. Por otra parte, la expresión de MMP-1 y VEGF fueron más altas en el modelo que combina los tres tipos de células (HCC, MRC-5, y macrófagos), incluso más altos que los niveles en el sistema de cultivo dual con HCC y MRC-5. Nuestros resultados también sugieren que los macrófagos en los modelos de co-cultivo 3D no sólo aumentan la expresión de MMP-1, sino también mejorar la capacidad de las células de cáncer de pulmón para promover la angiogénesis. Sin embargo, durante el proceso de co-cultivo, se encontró que los macrófagos también atacaron y mataron a las células de HCC. Esta observación implica que la función de los macrófagos en el cáncer de pulmón puede ser un "arma de doble filo", donde se exhiben tanto anti-tumoral y los efectos promotores de tumores relevantes a la invasión, metástasis y daño pulmonar. Algunos informes han asociado una abundancia de macrófagos asociados a tumores (TAM) con un pronóstico de los pacientes pobres [16, 17]. Thomsen et al. informó de que fumar cigarrillos provoca una reacción inflamatoria dentro de los pulmones que recluta células inflamatorias, en consecuencia, la alteración de la secreción de citocinas de una manera tal que conduce a una predisposición para el cáncer de pulmón [18]. Shaked et al. demostraron que las células derivadas de la médula ósea, tales como linfocitos, macrófagos, neutrófilos y mastocitos (MC) a menudo son reclutados en el pulmón en respuesta a daño pulmonar; junto con los fibroblastos, células endoteliales, y pericitos, células inmunes parecen ayudar a condicionar el microambiente tumoral (TME) [19].
deficiencia Tumor microambientales de oxígeno (hipoxia) también aumenta el comportamiento maligno de las células cancerosas, en parte a través de la familia del factor inducible por hipoxia (HIF) de factores de transcripción. HIF regulan la expresión de EMT-genes, así como promover la angiogénesis, la proliferación celular, y la remodelación de tejidos [20]. En el presente estudio, se detectó la expresión de VEGF en el HCC, MRC-5, y el grupo de macrófagos co-cultivo en tres condiciones diferentes: 10% de SFB con O
2 (condiciones normales), 0% de SFB con O
2 (privado de suero bovino fetal, pero con O
2), y 0% de SFB y sin O2 (simulando las condiciones de hipoxia y de suero de inanición). Hemos encontrado que la expresión de VEGF en condiciones de hipoxia o privación de suero fue mayor que en condiciones normales después de 72 h de co-cultivo, mientras que la tendencia en la expresión de VEGF mostró un aumento inicial, seguido de una disminución aparente. Esto puede ser debido a la muerte celular HCC con el tiempo mediada por los macrófagos, lo que causó una disminución en la expresión de VEGF latente. Como también se ha implicado, además de la hipoxia, las condiciones de hambre pueden promover la expresión de VEGF
in vitro
. Sin embargo, en el grupo HCC y MRC-5 co-cultivo, que se utilizó para comparar la expresión de MMP-1 en condiciones de hipoxia o privación de suero con condiciones normales, no mostró diferencias significativas en la expresión. Se interpretó en el sentido de que ni la hipoxia o la privación de suero son factores que influyen en la expresión de MMP-1. Además, la expresión de MMP-1 en estas condiciones disminuyó continuamente durante el experimento 120 h. Una explicación puede ser que las células agotan los nutrientes necesarios en el medio de cultivo y /o baja tensión de oxígeno hizo que crecen poco y /o se detiene la división celular.
Es el momento de los reconsiderar los modelos 2D actuales usados para poner a prueba la terapéutica del cáncer de pulmón como el microambiente tumoral, la presencia de células del estroma, los componentes de ECM, y moléculas de señalización influir mucho en la apariencia, la salud y las actividades de las células cancerosas. Proponemos que un mejor enfoque sería para diseñar terapias que también están dirigidos contra las células del microambiente del tumor y del estroma, que también son importantes para la metástasis y la angiogénesis. Las terapias que se dirigen solamente y trabajan directamente en las células de cáncer de pulmón pueden no ser tan eficaz, ya que no tienen en cuenta los factores clave que intervienen en la progresión tumoral. células de cáncer de pulmón son heterogéneos y que poseen diferentes propiedades histológicas, junto con el hecho de que son genéticamente inestables durante la progresión de la enfermedad; todos estos son las principales razones para el fracaso de los tratamientos para el cáncer de pulmón que se centran en objetivos muy específicos en las células de cáncer de pulmón. Además, un alto nivel de resistencia a los fármacos normalmente acompaña terapias dirigidas directamente a las células tumorales. En resumen, vemos las ventajas de las terapias dirigidas a las células del microambiente del tumor y el estroma: 1) que no se dirigen a un aspecto específico de las células tumorales altamente variables, 2) se dirigen a las células del estroma, que poseen un fondo genético estable y la estabilidad heredable, y 3) las células estromales son menos propensos a las mutaciones genéticas y resistencia a los medicamentos, sin embargo, tienen un impacto importante en la progresión tumoral y la metástasis, de tal manera que la inhibición de su función puede efectivamente la progresión tumoral desacelerar o detener /difusión.
El microambiente tumoral se compone de células de cáncer, células intersticiales, citoquinas, y quimiocinas. Generalmente, las células intersticiales, incluyendo fibroblastos, células inmunes, células endoteliales, y células inmaduras se derivan de la médula ósea. Centrándose en la comprensión de cómo la función de las células intersticiales en el microambiente del tumor puede conducir a mejoras en las terapias contra el cáncer. Nuestro trabajo ha demostrado que la morfología de las células de HCC es significativamente diferente entre los modelos de co-cultivo 2D y 3D. La expresión de MMP-1 y VEGF está regulada positivamente en los modelos 3D de co-cultivo en comparación con los modelos de monocultivo, lo que demuestra que las interacciones entre las células del cáncer de pulmón y las células del estroma pueden tener un papel importante en permitir y promover la metástasis. En el modelo de cáncer de pulmón en 3D co-cultivo, condiciones de hipoxia y de hambre simuladas inducen la secreción de VEGF, pero no MMP-1. Los macrófagos en el microambiente tumoral pueden servir papeles duales en el ataque a las células tumorales, mientras que también la regulación positiva de las vías de señalización que ayuda en la invasión tumoral y la metástasis.
Outlook
terapias dirigidas células estromales tumorales puede representar un más eficaz enfoque para combatir el cáncer. Sin embargo, poco se sabe actualmente sobre la interacción entre las células del estroma y del tumor; se necesitan investigaciones adicionales para entender mejor el ambiente del tumor complejo, específicamente cómo función TAM.