Extracto
cánceres de colon humanos albergan comúnmente pérdida de función de las mutaciones en APC, un represor de la vía Wnt canónica, lo que conduce a la señalización de WNT-TCF hiperactivo. Restablecimiento de la función APC en ratones, diseñado para reprimir condicionalmente Apc través de RNAi, resolver los tumores intestinales formadas debido a la señalización de Wnt-Tcf hiperactivado. Estos y otros resultados han llevado a la búsqueda de antagonistas específicos vía Wnt como agentes terapéuticos para el cáncer de colon humano clínicamente problemáticas y metástasis asociadas, que siguen siendo en gran medida incurable. Esta opinión ampliamente aceptada está en agudo contraste con una serie de hallazgos utilizando materiales de pacientes derivados: objetivos TVC canónicas son reprimidos, en lugar de ser hiperactivado, en los cánceres de colon avanzado, y la represión de la función TCF generalmente no produce la regresión tumoral en xenoinjertos. Los resultados de una serie de estudios genéticos de ratón también han sugerido que la señalización Wnt-TCF canónica conduce metástasis, pero las pruebas directas in vivo se carece, y, sorprendentemente, la represión TCF puede mejorar directamente plantada crecimiento metastásico. Aquí hemos abordado las capacidades de mejora y bloqueado WNT-TCF señalización para alterar el crecimiento tumoral y las metástasis a distancia utilizando xenoinjertos de cáncer de colon humano en ratones avanzados. Encontramos que la señalización Wnt-TCF endógena es en su mayoría anti-metastásico ya que la regulación por disminución de la función TCF con dnTCF generalmente mejora la diseminación metastásica. Consistentemente, elevando el nivel de la señalización de WNT, mediante el aumento de los niveles de ligandos Wnt, no es generalmente pro-metastásico. Nuestros datos actuales y anteriores revelan una respuesta heterogénea de modular la señalización de WNT-TCF en células cancerosas humanas. Sin embargo, los hallazgos de que una fracción de los cánceres de colon probado requieren la señalización de Wnt-TCF para el crecimiento del tumor, pero todos responden a la señalización reprimida mediante el aumento de metástasis piden una reevaluación de la meta de bloqueo de la señalización WNT-TCF para el tratamiento de los cánceres de colon universalmente. Nuestros datos sugieren que el bloqueo WNT-TCF puede ser eficaz en la inhibición de crecimiento del tumor en sólo un subconjunto de los casos, pero en general aumentará metástasis
Visto:. Seth C, Ruiz i Altaba A (2016) metástasis y cáncer de colon Tumor Mostrar el crecimiento respuestas divergentes a la modulación de la señalización Wnt canónica. PLoS ONE 11 (3): e0150697. doi: 10.1371 /journal.pone.0150697
Editor: Michael Klymkowsky, Universidad de Colorado, Boulder, Estados Unidos |
Recibido: 30 Octubre, 2015; Aceptado 18 de febrero de 2016; Publicado: 3 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Seth, Ruiz i Altaba. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Suiza, la curación consorcio EU-FP7, la Liga del cáncer de Suiza y del departamento d'Instrucción Pública de Genève en ARA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hay una gran cantidad de evidencia que apoya la idea de que la señalización Wnt es esencial para los cánceres de colon humano, que es quizás el mejor ejemplo de dos hallazgos clave i- la gran mayoría de los cánceres de colon albergan mutaciones en el gen supresor tumoral APC, una clave antagonista vía WNT-TCF [1], y la restauración de la función II- APC en
apc
ratones resulta comprometidos en la pérdida de tumores intestinales [2]. Estos y otros resultados han promovido la búsqueda de terapéuticas bloqueadores WNT-TVC para el tratamiento de los cánceres de colon humanos universalmente con la señalización de Wnt canónica hiperactivo (por ejemplo, [3]). Dado que la APC es, hasta ahora, no druggable, los esfuerzos para desarrollar antagonistas de Wnt-TVC se han centrado en los pasos de aguas arriba (por ejemplo, inhibidores de puerco y tankirasa [4-6] o aguas abajo (bloqueadores de CBP [7], la ivermectina [8]) de APC función en el complejo de la destrucción ß-CATENINA. Independientemente de la etapa específica, pantallas o ensayos de validación muchos han utilizado un reportero TCF-luciferasa para monitorear las respuestas vía Wnt canónica [9].
las líneas de evidencia sugieren resumidos anteriormente . una acción firme de WNT-TCF señalización en los cánceres de colon en etapa terminal y puede proporcionar un caso convincente para el desarrollo y el uso de antagonistas de Wnt canónica Sin embargo, un hallazgo clave está en desacuerdo con esta opinión generalmente aceptada: la expresión de Wnt-TCF objetivos reprimida, no se ha mejorado en los cánceres de colon avanzado y metástasis en comparación con los tumores en fase inicial [10], [11].
señalización de Wnt-TCF se pensaron también ampliamente para conducir metástasis (por ejemplo [12]) , la promoción del potencial de la siembra de células tumorales circulantes y la mejora de la señalización mediada por ligando en el nicho metastásico [13], [14]. Es de destacar, sin embargo, que no se han notificado pruebas directas para la capacidad aceptado de la señalización canónica WNT-TCF mejorado para promover la metástasis de células de cáncer de colon humano. La mejor evidencia de un papel de señalización Wnt canónica en las metástasis de cáncer de colon se deriva de los estudios con ratones [13], [14] o de los análisis in vitro (por ejemplo, [15], [16]), y otros estudios implican un papel probada para mejorado la señalización de Wnt en las metástasis (por ejemplo [17]). Sin embargo, suponiendo que en la función in vivo a partir de datos in vitro, o la biología humana a partir de datos de ratón, pueden ser problemáticos como los ratones y los seres humanos son bastante especies distantes, e in vitro condiciones pueden imponer una WNT-dependencia a las células cancerosas de colon humano [10].
de manera experimental, la represión de la señalización de Wnt canónica se ha intentado mediante el bloqueo de la función TCF, que es el último paso de la señalización de Wnt canónica. Represión de WNT-TCF de señalización con la cacerola TCF dominante negativo (dnTCF4), que se muestra para ser eficaz in vitro en células de cáncer de colon humano (por ejemplo, [18]), es, paradójicamente, generalmente ineficaces en la represión de crecimiento del tumor después del injerto cánceres de colon humano avanzada ; Por el contrario, se puede impulsar el crecimiento metastásico después de la siembra directa de las células cancerosas en los pulmones [10], [11], [19-21]. Estos hallazgos plantean la posibilidad de que el bloqueo de la señalización de Wnt-activa TCF en células de cáncer de colon humano no siempre puede ser terapéuticamente favorable, a diferencia de lo que ha sido reclamado (por ejemplo, [2], [18]). Sin embargo, los enfoques y modelos utilizados son diferentes y podría haber diferencias metodológicas que subyacen a los resultados divergentes. Por ejemplo, las metástasis sembrados directamente por inyección en la vena de la cola de células de cáncer humano [10] no recapitula totalmente metástasis a distancia. Por otra parte la idea aceptada de que ligandos Wnt promueven el crecimiento metastásico derivado de ratones genéticamente [13], [14], aún no se ha probado directamente a través de las células de cáncer de colon derivados del paciente.
Aquí hemos comparado la ganancia y el bloqueo de la función se acerca a abordar directamente los efectos de la modulación de la señalización de WNT-TCF en el crecimiento de xenoinjerto de cáncer de colon humano en ratones y en metástasis de órganos distantes en vivo, utilizando tanto las células de cáncer de colon primario de pacientes derivada y dos líneas celulares establecidas. Nos encontramos con que sólo una minoría de las células tumorales responden al bloqueo TCF al disminuir el crecimiento del tumor probado, pero a diferencia de todas las células de la prueba respondido mediante la mejora de una metástasis a distancia. Por otra parte, la señalización de Wnt a través de niveles elevados de ligando mejoradas en las células cancerosas no impulsar el crecimiento tumoral en ningún caso. En su lugar, se dio lugar a una respuesta metastásico heterogénea: una mayor señalización reprimido el crecimiento metastásico en un caso WNT, tres casos fueron estadísticamente no afectado, y se ha mejorado metástasis en otro caso. Un análisis más detallado de la mejora de la metástasis en células mCC11 reveló que esto ocurrió en sólo una de las tres cepas de ratones inmunocompetentes, con el argumento de que esto no es una respuesta intrínseca de las células tumorales.
En general, nuestros datos actuales y anteriores [10] sugieren que el bloqueo de la señalización de WNT-TCF en pacientes con cáncer de colon probable será perjudicial en todos los casos como esto conducirá a un aumento de la metástasis, independiente de cualquier reducción en el tamaño del tumor primario en un subconjunto de los casos. En contraste, los resultados Presentamos aquí sugieren que la restauración de la actividad de la vía Wnt-TCF en células de cáncer de colon humano podría en lugar tener valor terapéutico en un subconjunto de cánceres metastásicos.
Materiales y Métodos
Human muestras de cáncer de colon y de cultivo celular
muestras de cáncer de colon humano primaria (CC) CC36 (TNM3), CC14 (TNM4) y mCC11 (metástasis hepáticas de pacientes CC) utilizados para este estudio fueron como en las referencias [10], [21], [22], [23]. El HT29 humano CC y líneas de células T84, este último derivado de una metástasis de pulmón, se obtuvieron de Servicios línea celular. Se utilizaron todas las células CC primarios en un pasaje in vitro temprano en condiciones de cultivo estándar (DMEM-F12 con 10% FBS, 5% de CO
2).
herramientas lentivirales y la infección de CCs humanos
introducción estable de beta-galactosidasa (ßGal) expresando (
lacZ
+) constructos indicadores utilizados partículas lentivirales a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Todos los cultivos infectados fueron controlados por ßGal la expresión in vitro mediante tinción con X-Gal. lotes de cultivos celulares con & gt; 90% fueron seleccionados expresión homogénea de ßGal para otras infecciones (MOI = 2) con GFP
+ lentivectores con o sin dnTCF4, Wnt1 o Wnt3a. Lotes con & gt; 85% GFP
+ células fueron escogidos para todos los experimentos
-PCR cuantitativa en tiempo real
3-5D después de la infección, se recogieron las células infectadas en Trizol y el ARNm. extraídos (Life Technologies). Las reacciones de PCR estándar se realizaron en ADNc derivado con los siguientes cebadores:
cebadores específicos de los humanos: Read
TBP F: CCACAGCTCTTCCACTCACA
TBP R: GGATTATATTCGGCGTTTCG
HPRT F: GCCAGACTTTGTTGGATTTG
HPRT R: CTCTCATCTTAGGCTTTGTATTTTG
AXIN2 F: AGTGTGAGGTCCACGGAA AC
AXIN2 R: ACTGCCCACACGATAAGGAG
LGR5 F: GGAGCATTCACTGGCCTTTA
LGR5 R: CTGGACGGGGATTTCTGTTA
ascl2 F: GCGTTCCGCCTACTCGT
ascl2 R: GGCTTCCGGGGCTGAG
cebadores específicos de ratón:
Wnt1 F: GACGGATTCCAAGAGTCTGC
Wnt1 R: ATTGCGAAGATGAACGCTGT
Wnt3a F: GCACCACCGTGGACGACAG
Wnt3a R: CCTCGCTACAGCCACCCCAC
inyecciones vena de la cola en ratones NSG: Pure
lacZ
+ población celular
10
CC 6 humana se inyectaron células en HBSS en la vena de la cola de 6 semanas de edad, los ratones hembras inmunodeficientes (NSG que carecen de células T, B y NK maduros) en virtud de los procedimientos de explotación autorizadas en las instalaciones de animales en UNIGE. Los animales se pesan 20-25 g al comienzo del experimento. Los animales fueron controlados de forma rutinaria para detectar síntomas de malestar y recogieron 4 semanas después de la inoculación siguiendo los protocolos aprobados. Los pulmones se recogieron en PBS después de la disección
xenoinjertos subcutáneos en GSN, ratones desnudos y SHO:. LacZ
+ células
5x10
se inyectaron 5 células CC en HBSS en el subcutánea capa de 6 semanas de edad ratones Nude hembra (NMRI-Foxn1nu /Foxn1nu, que carecen de células T maduras) o ratones SHO (SHO-PkrdcscidHrhr; carecen de células T maduras y las células B) o-inmune comprometido NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SZJ). Cada ratón lleva 3 xenoinjertos en los flancos. Los ratones desnudos y NSG fueron comprados a Laboratorios Janvier (Francia) y ratones SHO de Charles River (Francia). Todos los animales fueron 20-25 g al comienzo del experimento y fueron posteriormente rutinariamente controlados por síntomas de malestar en el momento de las mediciones del tumor. Los animales se sacrificaron al final de 4 semanas post-injerto y los xenoinjertos y los órganos se recogieron en PBS después de la disección. Los xenoinjertos se cortaron y se almacenan en Trizol después de la solubilización y posteriormente se procesaron para análisis de expresión génica mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
Sub-cutánea
lacZ
+/-
xenoinjertos en ratones NSG
mCC11
lacZ
+ células fueron infectadas con un lentivirus en & gt; 90% de eficiencia. En paralelo, mCC11 en peso (
lacZ
-) las células fueron infectadas con GFP
+ lentivectores que expresan Wnt1. mCC11-
lacZ
+ después se mezclaron 1: 1 con mCC11-
lacZ
- /Wnt1
+ células y un total de 5x10
5 células se inyectaron en cada uno de tres sitios por 6 semanas de edad ratones inmunocomprometidos GSN hembra en condiciones aprobadas. Los animales se comprobaron de manera rutinaria para los síntomas de malestar diariamente a la hora de las mediciones de crecimiento del tumor. Todos los animales fueron sacrificados al final de las 4 semanas post-injerto y los tumores y los órganos recogidos en PBS al final de los experimentos.
Beta-galactosidasa X-Gal tinción
Todos los órganos se lavaron con PBS frío después de la recolección y se fijaron con PFA al 4% a 4 ° C para 2-12h. La tinción se realiza para 4-8h con X-Gal. a continuación, las muestras teñidas se lavaron con PBS estéril y se inspeccionaron en busca de metástasis visibles bajo un microscopio de disección.
lacZ
+ metástasis se contaron y se fotografiaron.
secuenciación del exoma APC
secuenciación del exoma ADN de las células de cáncer de colon primarios utilizados se llevó a cabo en la Genómica instalaciones de la Universidad de la Escuela de Medicina de Ginebra. Sólo APC se analizó en detalle para este estudio. se reportan las mutaciones en APC sólo se conoce que conducen a la pérdida de la función aquí.
Cuidado de los animales
Todos los ratones se usan bajo protocolos aprobados de la Oficina Cantonal de veterinaria de Genève (OVC). Los animales fueron controlados varias veces a la semana para el bienestar bajo la guía veterinario. Los ratones fueron sacrificados al final de los experimentos y antes de tumores alcanzaron el límite legal local a través de la inyección de ketazol /xilacina o CO
2 inhalación.
Resultados
Modulación de WNT canónica de señalización en las xenoinjertos de cáncer de colon humano en ratones no suele alterar el crecimiento del tumor
células de cáncer de colon humano primario (CC14 y CC36), así como células de cáncer de colon metastásico (mCC11) y una línea celular metastásico (T84) fueron transducidas de forma estable con GFP
+ TCF4 dominante negativo (dnTCF), Wnt1, o con lentivectores de control. injertos subcutáneos en ratones GSN inmunocomprometidos fueron elegidos desde las metástasis del cáncer de colon cutánea se producen en los pacientes y porque no hay injertos ortotópico prefecto son posibles en ratones: incluso la inyección en la pared del recto conduce a una fuga buque, debido a su delgadez y los volúmenes y presiones implicadas en la inyección , dando lugar a la diseminación sistémica. Por otra parte, los injertos Vía subcutánea son simples y altamente reproducible.
Los niveles de expresión de la buena fe del cáncer de colon WNT-TCF actividad biomarcador
AXIN2
, así como los marcadores de células madre WNT-regulados
LGR5
y
(por ejemplo, [2]), fueron determinados por RT-qPCR en las células transducidas in vitro y en xenoinjertos subcutáneos (Fig 1A) ascl2
. Todas las células in vitro e in vivo respondieron a la señalización de WNT-TCF reprimida o mejorado como se demuestra por los niveles endógenos de
AXIN2
mRNA; todas las células reprimidos
AXIN2
niveles de mRNA en respuesta a la vía de bloqueo por parte dnTCF, y todas las células aumentaron
AXIN2
niveles de mRNA en respuesta a la activación de la vía por Wnt1 (figura 1A).
LGR5
y
ascl2
se regula de la misma aunque con diferencias de tipo de células (Figura 1A).
(A) La cuantificación de los niveles de
AXIN2
,
LGR5
y
ascl2
por RT-qPCR in vitro e in vivo en xenoinjertos en los cuatro tipos de células utilizadas en este estudio, con regulación a la baja WNT-TCF través dnTCF4 o la regulación positiva a través de Wnt1 misexpression. Los números son los cocientes entre experimental sobre los valores de Ct de control, después de la normalización con los genes de la casa
TBP
y
HPRT
. Tenga en cuenta que en todos los casos el objetivo y la actividad del indicador WNT-TCF canónica
AXIN2
es inducida por Wnt1 (cajas verdes) y reprimida por dnTCF4 (cajas rojas). (B) GFP + imágenes fluorescentes de tumores diseccionados de mCC11 (fila superior) y T84 células (fila inferior). Modulación de WNT-TCF señalización en vivo hace que pequeños cambios en los tumores en crecimiento. Las barras de escala = 0,6 cm. (C) Histograma de la cuantificación de peso del tumor después de la disección, para cada una de las cuatro células de cáncer de colon utilizados. Véase el texto para más detalles. los valores de p se determinaron con pruebas t de Student de dos colas.
El crecimiento tumoral se controló cada dos días mediante la medición de volumen antes de tumores alcanzaron los límites legales. Al final del experimento, todos GFP
+ tumores se recogieron al mismo tiempo y se fotografió. En ningún caso fueron los tumores experimentales más grandes que los controles (Fig 1B y 1C). En su lugar, 4/8 xenoinjertos T84 que expresan dnTCF (T84
dnTCF) no crecieron y los que lo hicieron estaban dentro del rango de los controles. Además, hubo una disminución menor en el peso del tumor para mCC11
Wnt1 en comparación con los controles (Fig 1B y 1C). Estos resultados sugieren que hasta o modulación de la señalización de Wnt canónica de Down pueden tener efectos dependientes del contexto y divergentes en vivo. Sin embargo, la señalización de Wnt en ningún caso mayor resultado en tumores de mayor tamaño y el bloqueo de la señalización de WNT-TCF no tener efectos anti-tumorales universales.
El bloqueo de la actividad TCF conduce a un aumento general de una metástasis a distancia
para llevar claramente colonias metastásicas en órganos distantes, que injertados con células de cáncer de células integradas em>
expresando lentivectores para permitir la identificación de los humanos ßGalactosidase
+ (ßGal
+) en el ratón tejidos después de la reacción XGal (Fig 2A; [10], [24]). El injerto
lacZ
+ CC14
dnTCF, CC36
dnTCF o mCC11
dnTCF (figura 2B) dio lugar a un aumento neto de la metástasis en los pulmones de los ratones del GSN, y en su índice metastásico (número de
lacZ
+ colonias metastásicas dividido por el peso total del tumor en los ratones gramos, ya que cada realizaron 2-3 xenoinjertos de flanco subcutánea) (figura 2C). Esto indica que por modulación de la actividad WNT-TCF (en alrededor de 50% según lo sugerido por
AXIN2
niveles (Fig 1A) mejora el fenotipo metastásico experimental completo. Dado que la actividad dnTCF impidió el crecimiento de un tercio (4 /12) de T84
dnTCF tumores (figura 1C), una respuesta metastásico en general en este tipo de células no era del todo significativo de cuantificar. sin embargo, el índice de metástasis de T84
dnTCF ratones que desarrollaron tumores fue similar a la de T84
de control (no se muestra).
(a) Diagrama de las células injertadas del procedimiento utilizado para analizar el efecto de la regulación a la baja de la señalización de metástasis a distancia en vivo. WNT son
lacZ
+, que permite la visualización de grandes colonias e incluso las células metastásicas individuales en órganos distantes, especialmente los pulmones (recuadro inferior). el recuadro de la derecha muestra un gran aumento de
lacZ +
metástasis después de diferentes tamaños in toto tinción XGAL para revelar
lacZ
+ células metastásicas (manchas de color azul oscuro). (B) imágenes representativas de lóbulos pulmonares izquierda de los ratones por vía subcutánea injertados con células de control o los que tienen bloqueado WNT-TCF señalización a través la expresión de dnTCF4 como se indica. (C) Cuantificación del número de metástasis pulmonares por animal se muestra como el índice de metástasis (número de metástasis más de peso del tumor) (fila superior), y el peso del tumor (fila inferior) como se indica en cada caso. (D) La cuantificación del tamaño de las colonias metastásicas pulmonares como se indica por lado lóbulo pulmonar izquierdo. En todas las figuras barras de error son s.e.m. y los valores de p se derivan de pruebas t no pareada, de Student de dos colas. Barra de escala = 7 mm para (A); 25mm de (B).
La cuantificación del tamaño de
lacZ
+ colonias metastásicas en los pulmones reveló que hubo un aumento constante en el número de grandes (& gt ; 100 células por colonia) metástasis después de la represión de la señalización de WNT-TCF en ratones portadores de CC36
dnTCF, CC14
dnTCF y mCC11
dnTCF xenoinjertos en comparación con los controles (figura 2D). Además, tanto CC36
dnTCF y mCC11
dnTCF ratones portadores de tumores también se muestra un número mayor de micrometástasis (& lt; 10 células por colonia) sobre los controles (Fig 2D). Estos resultados sugieren que la regulación por disminución de la señalización de WNT canónica puede llevar tanto a un aumento en el número de células metastásicas que llegan a un órgano distante, así como un aumento en el tamaño de las colonias metastásicas.
Mejora de los niveles de ligando WNT hace no pueden incrementar el número de metástasis a distancia
para la prueba de metástasis a distancia desde un sitio del tumor primario a un órgano distante, los pulmones en este caso, el control y Wnt1-expresando
lacZ
+ células fueron injertadas en ratones inmunodeprimidos GSN totalmente por vía subcutánea (figura 3A). Mientras que CC14
Wnt1, o CC36
tumores Wnt1 habían niveles sin alterado de manera significativa de las metástasis pulmonares en comparación con los controles (Figura 3B y 3D), tumores T84
Wnt1 producido menos y mCC11
tumores Wnt1 producen más metástasis y tenía una alteración de la distribución de índice y colonia tamaño metastásico (Fig 3C y 3D). Esto demuestra que el resultado metastásico de la señalización WNT activada por acción del ligando puede ser dependiente del contexto, sino que la señalización Wnt mejorada no es universalmente pro-metastásico.
(A) Diagrama del procedimiento utilizado para analizar el efecto de la regulación al alza de la señalización Wnt en metástasis a distancia en vivo. (B) Los ejemplos representativos de los lóbulos pulmonares izquierdos de ratones con tumores subcutáneos de las diferentes células de cáncer de colon, como se indica, ya sea que llevan control (fila superior) o Wnt1-expresando (fila inferior) lentivectores, después de la tinción X-Gal. Barra de escala = 25 mm. (C) Cuantificación del índice metastásico en cada caso por ratón. (D) La cuantificación del tamaño de las colonias metastásicas pulmonares como se indica por lado lóbulo pulmonar izquierdo. Tenga en cuenta que los controles son los mismos que se utilizan para la figura 2 como los experimentos Wnt1 y dnTCF se realizaron simultáneamente, pero se muestran por separado para mayor claridad.
señalización de Wnt mejorada modula el número de metástasis sembrados directamente en un contexto- forma dependiente
Para proporcionar apoyo adicional del fenotipo metastásico observada con mCC11
Wnt1 y T84
Wnt1 células metastásicas en los ensayos completos descritos células tumorales anterior, se sembraron directamente en los pulmones, mediante la inyección de
lacZ
+ mCC11
Wnt1 o
lacZ
+ células T84
Wnt1 en la circulación de los ratones del GSN a través de la vena de la cola (figura 4A). células mCC11
Wnt1 formaron muchos más y T84
Wnt1 células mucho menos metástasis en comparación con los controles (Figura 4B y 4C). La cuantificación de las colonias metastásicas por tamaño reveló cambios en todas las categorías, de micrometástasis de células individuales a grandes colonias con & gt; 100 células (Figura 4D). Estos datos apoyan los resultados de metástasis a distancia y argumentan que la señalización Wnt puede afectar el crecimiento metastásico, independiente de cualquier otro efecto incluidos en el estroma del tumor primario. Estos resultados también confirman que, paradójicamente, los niveles de Wnt ligando mejoradas son pro-metastásico en un tipo de célula y anti-metastásico en otro.
(A) Representación esquemática del protocolo utilizado para probar los efectos de la señalización de Wnt mejorada en el crecimiento metastásico después de la inyección directa en la circulación vial de la vena de la cola. (B-D) Ejemplos representativos (B), de cuantificación total (C) y la cuantificación de tamaño metastásico colonia (C) de las regiones pulmonares X-Gal teñidas después de la inyección de las células de control o de las células con la mejora o la señalización de Wnt, como se indica. crecimiento metastásico mCC11 se mejora mientras que la de T84 se suprime (C, D). Tenga en cuenta que el número total de colonias metastásicas representados en (C) para mCC11 se dejó por el lóbulo de pulmón, mientras que dada su escasez, que por T84 es para todo los pulmones. Barra de escala = 7 mm de (B).
La falta de correlación de estado de APC y WNT-TCF fenotipo modulación
Se podría argumentar que hemos seleccionado células que no puede tener mutante APC, haciendo así nuestros resultados no aplicable en general a la mayoría de los cánceres de colon humano. Sin embargo, observamos que los puertos T84
APC
mutaciones y que la secuenciación del exoma de
APC Hoteles en CC14 revela la presencia de mutaciones de pérdida de función (CHR5 112173848 G & gt; T, de la identificación cósmica 18566, e
853- & gt; Parada; CHR5 112175951 G & gt; A, e
1554- & gt;. frameshift)
Para ampliar estos resultados que hemos repetido los experimentos con dnTCF y Wnt1 utilizando así la -conocido
APC
línea celular de cáncer de colon HT29 mutante (figura 5A). En estas células Wnt1 y dnTCF4 regulados objetivos TVC como se esperaba (Fig 5B). Los tumores que expresan HT29
dnTCF fueron ligeramente, pero significativamente menor, pero esto también fue el caso de HT29
Wnt1 tumores (Figura 5C), lo que sugiere la falta de una respuesta clara crecimiento del tumor a la modulación de la señalización de Wnt. Por otra parte, no hubo diferencias en el número de significancia
lacZ
+ metástasis de tumores HT29
Wnt1 en comparación con HT29
controles (Figura 5D y 5E). Por el contrario, el aumento con HT29
dnTCF fue significativa (figura 5D y 5E). Los análisis de tamaño de las colonias metastásico confirmaron aumentos en micro y macrometástasis de HT29
dnTCF, pero no HT29
Wnt1, los tumores en comparación con HT29
controles (Figura 5F).
(A) estrategia utilizada para la administración subcutánea a metástasis pulmonares. (B) Mapa de calor de los niveles de expresión de ARNm normalizados respecto a los controles (y más de los genes de limpieza) para los genes resaltados en células HT29 cultivadas in vitro o en xenoinjertos en vivo. Todos los números son relaciones más controles. (C, D) Efectos de la modulación de la señalización de WNT con dnTCF o Wnt1 expresión en el crecimiento subcutáneo del tumor (C) y el índice de metástasis (índice Met) (D). (E) Los ejemplos representativos de imágenes pulmón izquierdo para cada caso como se ha señalado. Las metástasis son de color azul oscuro después de la reacción XGal debido a su expresión de células intrínseca de
lacZ
. (F) La cuantificación de
lacZ
+ tamaño de las colonias metastásico en tres categorías como se muestra. Barra de escala = 20 mm para (E).
En conjunto, estos datos apoyan la noción general de que la reducción intrínseca de células de señalización canónica respuestas en las células de cáncer de WNT es pro-metastásico, y argumentan que el estado de APC no se trata simplemente correlaciona con el resultado de la modulación de la señalización de WNT-TCF.
los diferentes ligandos Wnt canónica aumenta el número de metástasis distantes mCC11
para descartar la posibilidad de que los efectos del aumento de las metástasis por mejora Wnt1 se debe a una especificidad del ligando utilizado, se repitió el protocolo metastásico completo con células mCC11 que expresan Wnt3a o Wnt1, ambos de los cuales activan la señalización de Wnt-TCF canónico y, como era de esperar, mejorar los niveles de la meta de WNT-TCF
AXIN2
y el marcador de células madre de colon regulado WNT
LGR5
sobre las de las células control (figura 6A). mCC11
Wnt3a
lacZ
+ células tumorales similares a los controles en tamaño, sino que se reproducen la mejora de las metástasis pulmonares distantes de mCC11 producidos
tumores Wnt1 con la distribución de tamaño de las colonias similar (figura 6B y 6C y que no se muestra).
(a) Mayor Wnt1 y Wnt3a producen cambios similares en medidas de la expresión de genes diana por RT-qPCR. (B) Los ejemplos representativos de X-Gal manchado dejaron lóbulos pulmonares con colonias metastásicas como se ha descrito. (C) La cuantificación del índice metastásico y el peso de mCC11 en peso, mCC11
Wnt1 y mCC11
Wnt3a. Tanto Wnt1 y Wnt3a mejorar metástasis más controles, pero sólo los tumores Wnt1 son ligeramente más pequeñas. Barra de escala = 20 mm para (B).
mCC11
Wnt1 células promueven la metástasis de hermanos no Wnt1-expresando células
Para cerciorarse de que los ligandos Wnt de mCC11
Wnt1 células ejercen la señalización autónoma no celular in vivo,
lacZ
-negativo mCC11
Wnt1 células se mezclaron con
lacZ +
peso hermanos células mCC11 y co-inyectados para formar tumores subcutáneos ( la figura 7A). Tras el crecimiento del tumor se probó la presencia mejorada de ßGal
+ mCC11 peso de células en los pulmones. mCC11 células
Wnt1 promovió significativamente el comportamiento metastásico de las células de hermanos mCC11 en peso (Fig 7B y 7C), lo que indica que los ligandos Wnt1 también pueden actuar no autónoma, en este contexto
.
(A) Diagrama del protocolo utilizado para probar los efectos no autónomas de ligandos Wnt sobreexpresados en hermano, no sobreexpresan células mCC11 injertados al mismo tiempo. Sólo
lacZ
+;
Wnt1
- las células son rastreados después de la reacción XGAL. (B) Imágenes representativas de X-Gal manchado dejaron lóbulos pulmonares en las condiciones descritas. (C) Cuantificación del índice metastásico y el peso del tumor por condición. Barra de escala = 25 mm para (B).
mCC11
Wnt1 células no muestran un aumento de más de metástasis en ratones desnudos controles o SHO
Los resultados presentados anteriormente muestran que WNT canónica la señalización es pro-metastásico en células mCC11, y que los ligandos Wnt actuar tanto autocrinely y no de forma autónoma en vivo, lo que sugiere que el estroma del tumor primario es poco probable que sea el único objetivo de la señalización de WNT pro-metastásico. Sin embargo, también encontramos que la represión de células autónomas de la función TCF con dnTCF conduce a un marcado aumento en una metástasis a distancia a partir de estas células, al igual que con todas las demás células de la prueba. por tanto, la hipótesis de que el bloqueo de la señalización de Wnt-TCF en células mCC11 podría ser intrínsecamente y en general pro-metastásico (en línea con los resultados en las otras células de la prueba), pero que la señalización Wnt mejorada puede aumentar la metástasis de las células mCC11 a través de un no-celular autónoma, mCC11 mecanismo específico.
Para probar si el fenotipo metastásico mejorada de mCC11
Wnt1 dependía del entorno, que alteró radicalmente el entorno de las células tumorales injertadas cambiando la tensión de los anfitriones de ratón ( Fig 8A). tumores subcutáneos mCC11
Wnt1 crecieron como controles hicieron en ratones desnudos o SHO (Figura 8B y 8C) pero, en contraste con el fenotipo metastásico potente de mCC11
células Wnt1 en ratones GSN descritos anteriormente, mCC11
tumores Wnt1 no mostraron un aumento del número de metástasis en comparación con los controles en ratones desnudos o SHO injertados (figura 8B y 8C). Estos resultados sugieren que las células mCC11 no muestran una célula metastásica mejora intrínseca en respuesta a un aumento de la señalización de Wnt.
(A) Diagrama del procedimiento usado para injertar células mCC11 por vía subcutánea y los análisis de resultante metástasis pulmonares distantes. (B) Cuantificación de los pesos de los tumores metastásicos y los índices que muestran la falta de promoción de la metástasis por mCC11
Wnt1 células injertadas en los ejércitos desnudas o SHO ratón.
Discusión
El noventa y tres por ciento de los cánceres de colon humanos albergar la hiperactivación de la vía Wnt canónica, lo más a menudo a través de pérdida de la función de APC (http://cancergenome.nih.gov/). Esto, junto con los resultados con modelos de ratón genético, se ha prestado apoyo a un papel funcional de la señalización de Wnt-Tcf hiperactivo en la iniciación y desarrollo de tumores intestinales con células en cultivo in vitro y en modelos de ratón in vivo (por ejemplo, [2], [18], [25], [26]). Varias líneas de evidencia derivada también de trabajo con ratones transgénicos han demostrado sugerido que el aumento de la actividad de Wnt, en el nicho metastásico a través de la acción de periostina [13] o mediante la promoción del comportamiento migratorio de las células tumorales [14] circulante, impulsa metástasis en diferentes tipos de cáncer. Se han tomado estos y otros datos que sugieren que la alta canónica de señalización en diferentes cánceres humanos, incluidos los de colon WNT, es esencial para el crecimiento tumoral y la metástasis en pacientes, abogando por el desarrollo de antagonistas terapéuticos vía Wnt-TVC (por ejemplo, [3 ]).