Extracto
Fondo
El campo de rápido crecimiento de la terapia de tumores dirigido a menudo utiliza un anticuerpo, a veces etiquetados con un material de ablación de tumor, tales como radioisótopos, dirigido contra una molécula específica.
Metodología /Principales conclusiones
Este informe describe el descubrimiento de nueve nuevos decapéptidos que puede ser marcado radiactivamente, se unen a, y entregan
32P a las células de cáncer de colon. Los decapéptidos varían entre sí por de uno a tres aminoácidos y demuestran muy diferentes capacidades de unión. El decapéptido más avidez de unión puede ofrecer permanentemente niveles muy altos de radioisótopo a las líneas celulares de cáncer de adenocarcinoma con una eficiencia de 35 a 150 veces mayor que a una variedad de otros tipos de células, incluidas las líneas celulares derivadas de otros tipos de cáncer o de tejido normal.
Conclusiones /Importancia
Este enfoque experimental representa un nuevo ejemplo de una estrategia, denominada terapia péptido de unión, para el tratamiento potencial de cáncer colorrectal y otros adenocarcinomas
Visto:. Abraham JM, Sato M, Cheng Y, Paun B, Kan T, Olaru A, et al. (2007) Novel decapéptidos que se unen con avidez y entregue radioisótopos a las células del cáncer de colon. PLoS ONE 2 (10): e964. doi: 10.1371 /journal.pone.0000964
Editor Académico: Mikhail Blagosklonny, Instituto de Investigaciones Ordway, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2007; Aceptado: 12 de septiembre de 2007; Publicado: 3 Octubre 2007
Derechos de Autor © 2007 Abraham et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas 2RO1CA095323-14, 2RO1CA077057-09, 1R01CA001808-05 y 7R21 /R33CA106763 del Instituto Nacional del cáncer
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la enfermedad y la muerte debido a colorrectal y cáncer de esófago constituyen un desafío monumental cuidado de la salud en los Estados Unidos y en todo el mundo [1], [2]. Los tratamientos actuales incluyen la radioterapia, la cirugía y la quimioterapia. Hay una serie de inmunoterapias aprobados para su uso en el tratamiento de varios tipos de cánceres (
por ejemplo, España Herceptin, Rituxin, Avastin, y otros.) [3] - [6]. Todas estas inmunoterapias utilizan un anticuerpo monoclonal dirigido contra una molécula celular específica [7], [8]. acción destructiva contra las células tumorales se cree que la participación ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), la lisis celular a través de la vía del complemento, o la inducción de la apoptosis [9], [10]. Avastin es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y está aprobado para el tratamiento del cáncer colorrectal [11] - [13].
Además, el linfoma no Hodgkin (LNH) se trata actualmente con dos regímenes aprobados radioinmunoterapéutico: Bexxar y Zevalin. Ambos utilizan un anticuerpo monoclonal dirigido contra el CD20 marcador de células B y puede entregar ya sea
131I (Bexxar) o
90Y (Zevalin) isótopos para dirigirse a las células de linfoma [14], [15]. Los beta-partículas (electrones) generados por estos isótopos pueden penetrar profundamente las células y los daños en el ADN, lo que lleva a la muerte celular. Sin embargo, actualmente no hay radioinmunoterapias aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal.
Los decapéptidos descritos en este documento se unen a y la transferencia de isótopos (
32P) a líneas celulares derivadas de varios carcinomas colorrectales. En condiciones experimentales idénticas, muy poco (
a saber., España menos del 1% de las tasas de las líneas celulares de cáncer de colon ') de los más eficientes decapéptidos
32 P-etiquetados se unen a las líneas celulares establecidas a partir de una variedad de otros tipos de cáncer o de colon normal, los riñones o células esofágicas.
resultados
Hemos identificado nueve decapéptidos, que se diferencian entre sí por sólo unos pocos aminoácidos, que cuando se marcan con
32P puede unirse a un número de líneas celulares de carcinoma colorrectal. Todos los decapéptidos contienen una proteína quinasa A secuencia de sustrato y se designan como (adyuvante Modificado) Mas. La Figura 1 es una representación esquemática de la producción de los péptidos marcados con 32P
y el diseño experimental de los ensayos para medir la unión de péptidos a las líneas celulares.
Un sistema de expresión recombinante bacteriana produce varios glutatión-S- proteínas de fusión transferasa decapéptido que fueron unidos a glutatión y etiquetados con
32P utilizando la proteína quinasa A. después del lavado, los decapéptidos marcadas se recuperaron después de la digestión de trombina y se incubaron a diferentes tiempos con varias líneas celulares diferentes.
la figura 2 muestra el número de
32P cuentas por minuto (cpm) que queda unido a dieciocho diferentes líneas celulares y pozos en blanco después de una incubación de dos horas con MA5, el decapéptido de unión más eficiente (véase más adelante). La línea celular de adenocarcinoma de colon Caco-2 retiene el mayor número de recuentos radiactivos después de una incubación de dos horas y posteriores lavados con medio completo, el valor medio de los pocillos por triplicado igualando 298.639 cpm por cada 10.000 células. células de adenocarcinoma de colon HCT116 retienen un valor medio de 131.998 cpm por cada 10.000 células. pocillos de blanco y líneas celulares no vinculantes tenían valores medios de menos de 550 cpm; barras que representan estos valores no son visibles en la escala utilizada en la figura 2. Por ejemplo, células de cáncer cervical HeLa S3 sólo se conservan un promedio de 534 cpm por 10.000, células HT1080 de fibrosarcoma retuvieron 367 cpm, y la línea celular de riñón embrionario humano 429 293H retenidos cpm por cada 10.000 células.
La
32P marcado decapéptido MA5 se incubó durante dos horas con 10.000 células, se lavaron tres veces, y las cuentas radiactivas de las células determinados por recuento de centelleo. Siete líneas celulares demostraron ávido de unión de MA5 y se muestran como gráficos de barras de la media y una desviación estándar en los pocillos por triplicado. Las líneas celulares once restantes, además de un pocillo en blanco sólo se promediaron 365 cpm. Estos valores son tan pequeñas como para no ser visible en la escala utilizada en esta figura. Para más información sobre las líneas de células individuales se proporciona en la información complementaria.
Siete de los diez y ocho líneas celulares demostraron una fuerte retención de la radiactividad cuando se incubaron con MA5 (Modificado péptido radiactivo adyuvante) con cinco de los cuales es líneas celulares de adenocarcinoma de colon (Caco-2, HCT15, HCT116, LoVo, HT29), uno de ellos una línea de células de adenocarcinoma esofágico (SEG1), y uno que es línea celular de esófago de Barrett (QHTRT). En contraste, los once líneas celulares no vinculantes eran líneas de células en su mayoría escamosas derivados de los carcinomas de cuello uterino (HeLa S3), colon (RKO), pulmón (1271, A549), el esófago (KYSE-70), una fibrosacroma (HT1080) o células cultivadas de riñón normal (293H), colon (1459), o el esófago (HEEpiC). líneas celulares no vinculantes incluyen T84, derivado de un adenocarcinoma metastásico de colon a pulmón, y SK-BR-3, aislado a partir de un adenocarcinoma de mama. La relación de cpm retenido por Caco-2 (298639) con el promedio de los once líneas celulares no vinculantes (365) fue 818:1. Caco-2 células retienen aproximadamente el 18% del total de cuentas radiactivas presentes en el pocillo de incubación después de la incubación de dos horas.
Nueve variantes MA se ensayaron para determinar la adhesión a células Caco-2 después de dos horas de incubación. La composición de ácidos nivel y amino de unión relativa de cada variante de MA se muestra en la Figura 3A. La alteración de uno a tres aminoácidos en el péptido dio lugar a diferencias de retención tan grande como 70 veces,
por ejemplo, España en la variante MA2
vs.
Variante MA5.
(a) Nine
32P marcado con diferentes decapéptidos, variando una de otra por una a tres aminoácidos, se incubaron con células Caco-2 para dos horas, las células se lavaron tres veces, y Cuenta restante unido a las células son se muestra como un porcentaje de la cantidad total de los recuentos para cada decapéptido utilizado. Las sustituciones de aminoácidos para cada variante (en relación con MA1) están subrayadas y en negrita. (B) Las variantes, MA1, MA4, y MA5 se incubaron con las células Caco-2 para los intervalos que varían de cinco minutos a dos horas, lavado, las células adherentes disueltos en tampón de carga de gel y una ejecución de alícuota en un 10% -20% gradiente de gel de poliacrilamida-SDS. Los tres carriles marcados "24h" (carriles 5, 10 y 15) se incubaron con los respectivos etiquetados decapéptidos (MA1, MA4, MA5) durante dos horas, se lavaron y se incubaron las células con medio completo durante 24 horas. Las células se trataron como se ha descrito para los otros carriles de esta figura.
Para investigar la rapidez
32P isótopo podía ser transferida de las variantes de péptidos y se incorporan en las proteínas celulares, los tres más avidez de unión se añadieron mas (véase la figura 3A) para replicar los pocillos que contienen células Caco-2, a continuación se lavó de distancia a intervalos variables de tiempo y las células y el sobrenadante ensayadas. Como se muestra en la Figura 3B, los porcentajes sustanciales de estos
32P-etiquetados decapéptidos variantes unidos a las células dentro de sólo unos pocos minutos, con grandes cantidades de proteínas celulares radiomarcados que aparecen en dos horas después de la exposición de las células a los péptidos marcados. Se incubaron las células Notablemente, un experimento paralelo en el que las condiciones descritas en la Figura 3 se duplicaron, pero lavó
durante la noche
en medio completo (datos no mostrados), todavía reveló niveles similares de liberación y retención
32P-decapéptido para todas las nueve áreas metropolitanas, como se describe para MA5 en la Figura 2.
El péptido de unión, a continuación, el lavado y el experimento de ensayo descrito para la Figura 2 se repitió en los siete más avidez de unión de líneas celulares utilizando MA5, excepto que después de tres lavados de medio, se añadieron 200 ul de medio completo a cada pocillo y se incubaron las células
durante la noche
a 37 ° C. La Figura 4A muestra el cpm retenido por las células o liberada en el medio después de esta incubación durante la noche. Aproximadamente el 88% de MA5 recuentos radiactivos retenidos inicialmente por las líneas celulares de cáncer de colon se libera en el medio, mientras que aproximadamente el 12% de los inicialmente retenido recuentos radiactivos fueron retenidos por las células. Las dos líneas de células esofágicas que inicialmente retenidos grandes cantidades de cuentas radiactivas, QH-TRT y SEG1, retienen el 39% y el 37% de su población en el original, respectivamente, después de la incubación durante la noche. Caco-2 células retienen el mayor número de cuentas, con un promedio de 58.305 cpm en pocillos por triplicado que contenían 10.000 células cada uno. Esta cifra representa aproximadamente el 5,8 cpm, o 348 pulsos por hora, por célula (
es decir, España cuando se extrapola lo largo de un período de exposición potencial a 2 semanas, equivalente a más de 87.000 recuentos por célula).
(a) El decapéptido
32P marcado con MA5 se incubó durante dos horas con siete líneas de células diferentes, se lavaron las células y se añadió medio completo. Tras una incubación de 24 horas, el número de cuentas por minuto liberadas en el medio (R), así como el número de cuentas permanece unido a las células se determinaron (B). Cada barra muestra la media y una desviación estándar de triplicados pozos. (B) Evolución temporal de la liberación y retención del decapéptido
marcado con 32P-MA5. MA5 se incubó durante dos horas con células Caco-2, las células se lavaron y el cpm liberado (línea discontinua), así como que queda unida (línea continua) a las células determinadas para intervalos de tiempo post-lavado. Cada punto muestra la media más /menos una desviación estándar de determinaciones por triplicado. C) Sustancias radiactivas descritas así como presos (línea continua) en la figura 4B se corrieron en un gel de poliacrilamida-SDS al 16,5% y expuestos a la película. Inmediatamente después de lavar (
es decir., España a las 0 horas), la mayoría de los recuentos se visualizaron como
32P-péptido. Durante los siguientes 48 horas, el péptido recuentos disminuido en gran medida, con la mayoría de radiactividad unida incorporado en las proteínas celulares. (D) Las alícuotas de medio que contiene el (línea de puntos) liberada
32P-péptido MA5 se ensayaron a intervalos de tiempo después del lavado, como se describe en la Figura 4B. A medida que pasaba el tiempo, más de la
32P-péptido fue puesto en libertad, alcanzando una meseta a las 24 horas después del lavado.
Figura 4B muestra la evolución temporal de la liberación de MA5 del Caco-2 línea celular de adenocarcinoma durante un periodo de tiempo de 48 horas. La mayoría de las cuentas totales liberadas durante el período de 48 horas son liberados por nueve horas de incubación. Las figuras 4C y 4D consisten en dos autorradiogramas que muestran las ubicaciones de las moléculas radiactivas descritas en la Figura 4B en geles de poliacrilamida-SDS. Los tamaños de las proteínas radiactivos celulares en las células se muestran en la Figura 4C;
marcado con 32P-MA5 libera en el medio se muestra en la Figura 4D. No es aparente acuerdo sobre la distribución y los niveles generales de radiactividad en la comparación de la figura 4B y las figuras 4C y 4D. Tan pronto como dos horas después de la introducción del péptido radiactivo, una parte sustancial del isótopo parece haber sido transferido a las proteínas de mayor peso molecular.
Discusión
Este informe describe el descubrimiento de decapéptidos que se puede marcar con una alta energía (1,7 MeV) emisor beta (
32P) y se puede unir ávidamente a varias líneas celulares de adenocarcinoma diferentes, de manera eficiente la entrega de este material potencial para la ablación del tumor a las células. Los decapéptidos, denominadas MA para adyuvante de modificación, son sustratos de la quinasa de proteínas. Anteriormente, nunca había sido demostrado o se sospecha que este sustrato, cuando se marcan con un material de ablación de tumores tales como
32P, podría unirse y transferir el radioisótopo a una línea celular después de una a dos horas de incubación. Por otra parte, hemos demostrado por primera vez que la transferencia de isótopo de estos decapéptidos se limita a tipos de células derivadas de de colon primario y adenocarcinomas de esófago. Por ejemplo, la exposición de ciertas líneas celulares de cáncer de colon
(por ejemplo
. Caco-2) para el péptido marcado más avidez de unión, MA5, por un período de dos horas dio como resultado la transferencia de una dosis radiactiva de más de 29 conteos por minuto por célula después de una incubación de dos horas, lavado, y la determinación inmediata de la radioactividad retenida.
la incubación de decapéptido
32P marcado con con ciertas líneas de células resultó en grandes cantidades de péptido siendo retenidas después de una incubación de dos horas, pero una proporción sustancial de este péptido unido fue puesto en libertad después de una incubación durante la noche. Por ejemplo, después de la incubación de la MA5 variante marcada con células Caco2 durante dos horas, tres pasos de lavado y la incubación durante la noche en medio, 88% de la originalmente retenido
isótopo 32P fue liberado. Sin embargo, el 12% que fue retenido por las células aún representaba 5,8 cpm por célula, la extrapolación a más de 8300 cuentas por célula por día. Además, la radiactividad que todavía fue retenido por las células después de la incubación durante la noche medio se incorporó de forma permanente en una variedad de proteínas celulares, como se demostró por electroforesis en gel de poliacrilamida de los lisados celulares después de la exposición
Entre 18 líneas celulares ensayadas por su capacidad de obligar a los decapéptidos, siete demostraron muy alta retención de isótopos después de la incubación de dos horas. Aunque los siete de estas líneas liberado de 63% a 88% de esta radiactividad después de una incubación durante la noche, la cantidad de isótopo que se conservó durante la noche era todavía considerable. De estos siete líneas celulares, cinco fueron derivados de los adenocarcinomas colorrectales, uno de un adenocarcinoma de esófago, y uno del espécimen metaplasia de Barret. Las 11 líneas de células que no se unen al decapéptido marcado radiactivamente MA5 se derivan de una variedad de orígenes de tejido. Estos carcinomas de células escamosas incluidos del cuello del útero, pulmón, mama, y un fibrosarcoma, así como normal del riñón, colon y los tejidos de esófago.
La mayoría de los regímenes inmunoterapéuticos aprobados para el cáncer implican un anticuerpo dirigido contra una específica molécula celular [16]. Estos agentes pueden funcionar mediante la unión a la superficie celular y pueden utilizar ADCC, la activación del complemento, o apoptosis celular. Los anticuerpos también se pueden acoplar a un agente de ablación de tumor, tales como toxinas o radioisótopos [17] - [21]. La adición de isótopo a péptidos, y su uso para fines diagnósticos y terapéuticos, es un área activa de investigación biomédica [22] - [25]. Nuestro trabajo utiliza sustratos de una proteína quinasa marcadas con
isótopo 32P. A alta energía resultados de radioisótopos emisores beta en un rango de longitud de recorrido de electrones de hasta 5 mm, para permitir la penetración sustancial de los tumores sólidos. Debido a un efecto de "espectador" predicho, una partícula beta penetrará cientos o miles de células dentro del tumor, incluso los que no directamente la unión del decapéptido. Además, dado que los pesos moleculares de estas proteínas decapéptidos minúsculas son mucho más bajo que el límite de peso molecular de exclusión de los riñones de filtrado, estos péptidos deben ser eliminadas rápidamente en la orina, lo que lleva a la reducción de la toxicidad sistémica. Por lo tanto, debería ser factible tanto para una dosis radiactiva y la radiactividad no unida a ser eliminados fácilmente y en un período relativamente corto de tiempo. Anticipamos que los sustratos adicionales de enzimas conocidos pueden ser identificadas con el tiempo como vehículos potenciales para el suministro específico de agentes anti-tumorales a las células cancerosas y que los regímenes terapéuticos de cáncer potencial que emplean este péptido u otras sustancias similares podría ser la más nueva estrategia para la terapia de unión a péptidos.
Materiales y Métodos
la producción de los decapéptidos
32 P-etiquetados: diferentes oligómeros de ADN fueron clonados en pGEX-4T-1 (GE Healthcare) que producen diversos decapéptidos después de la escisión de trombina designado a través MA1 MA9 (Modificado adyuvante). Las secuencias de proteínas son: MA1, GSRRASVGSA; MA2, GSRGASVGGA; MA3, GSRRGSVGSA; MA4, GSRRGSVASA; MA5, GSRRASVASA; MA6, GSRRASVGSG; MA7, GSRGGSVGSA; MA8, GSRGGSVASA; MA9, GSRGGSVGSG. bacterias DH5-alfa que contienen estos clones se cultivaron durante la noche en LB (que contiene 100 mg /ml de ampicilina), se diluyó 1/10 en LB-Amp y se cultivaron a 37 ° C durante dos horas. Se añadió IPTG a 1 mM y el cultivo cultivado a 37 ° C durante cinco horas. Se centrifugaron diez ml de cada cultivo y el sedimento de células se resuspendieron en 1 TBS X que contiene 100 mg /ml de lisozima. Después de dos ciclos de congelación-descongelación, el lisado se centrifugó y el sobrenadante se mezcló con 100 l de Sepharose-glutatión durante dos horas a TA. Cada sedimento se lavó tres veces con 1 X TBS, y las proteínas de fusión recombinantes unidas se marcaron con
32P usando proteína quinasa A y
32P-γ-ATP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis, Mo .). . El sedimento se lavó cuatro veces con 1 X PBS y el decapéptido marcado se escinde y se libera en el sobrenadante con trombina (GE Healthcare)
Ensayo de la unión de decapéptidos
32P-etiquetados a líneas celulares: Las líneas celulares se cultivaron en medio completo que contenía 10% de suero bovino fetal (inactivado por calor). En cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 10.000 células de diversas líneas celulares se cultivaron durante la noche en medio completo. Se añadieron diez l de la-péptido marcado en 1 X PBS y 90 l de medio completo a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C en varios momentos de hasta dos horas. El péptido-medio se retiró y uno l añadido a tampón de carga de gel de 100 ul y se contaron mediante recuento por centelleo para el control de la sonda o en un gel de poliacrilamida-SDS (Biorad) .Las células adherentes fueron brevemente y suavemente se lavó con medio completo tres veces y algunos pozos se analizaron inmediatamente mediante la adición de 100 l de tampón de carga de gel a cada pocillo y se ejecutan en un gel o se contaron en un contador de centelleo. Otros pozos habían añadido 100 l de medio completo y se incubaron durante un período de tiempo más. Se contaron las muestras, ya sea en un contador de centelleo líquido o corridas en geles de poliacrilamida-SDS, se expusieron a película de rayos X, y la película desarrollados.
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Yutaka Shimada (Hyogo Facultad de Medicina, Japón) por el don de la línea celular KYSE-70.