Extracto
En este contenido, poli un pequeño ligando molecular del antígeno de membrana específico de la próstata (SMLP) conjugado (caprolactona) (PCL) -b-poli (etilenglicol) (PEG) copolímeros con diferentes longitudes de bloque se sintetizaron para la construcción de un sistema de administración de fármaco satisfactorio. Cuatro micelas poliméricas docetaxel-cargado diferentes (DTX-PMS) se prepararon por diálisis con tamaños de partículas de menos de 60 nm tal como se caracteriza por dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopio electrónico de transmisión (TEM). Optimización de las micelas preparadas se llevó a cabo basado en la estabilidad a corto plazo y el contenido de carga del fármaco. Los resultados mostraron que los sistemas optimizados fueron capaces de permanecer estable durante 7 días. En comparación con Taxotere, DTX-PMs con la misma relación de longitud de la cadena hidrófila /hidrófoba muestran comportamientos de liberación sostenida similares. La citotoxicidad de la optimizado dirigido DTX-PCL
12K-PEG micelas
5K-SMLP (DTX-PMS2) y no-dirigida de DTX-PCL
12K MPEG
5K micelas (DTX-PMS1) se evaluaron mediante ensayos de MTT utilizando antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) células de adenocarcinoma de próstata positivas (LNCaP). Los resultados mostraron que las micelas dirigidas tenían una CI50 mucho menor que sus contrapartes no-dirigidos (48 h: 0,87 ± 0,27 frente a 13,48 ± 1,03 g /ml; 72 h: 0,02 ± 0.008 vs 1,35 ± 0,54 mg /ml).
In vitro
captación celular de PMS2 mostraron 5 veces la intensidad de fluorescencia mayor que la de PMS1 después de 4 h de incubación. De acuerdo con estos resultados, el nuevo sistema de administración de fármacos de tamaño nanométrico basado en DTX-PCL-PEG-SMLP ofrece una gran promesa para el tratamiento del cáncer de próstata
Visto:. Jin J, Sui B, Gou J, Liu J, Tang X, Xu H, et al. (2014) PSMA de ligandos conjugados de PEG-PCL poliméricos micelas dirigidos a células del cáncer de próstata. PLoS ONE 9 (11): e112200. doi: 10.1371 /journal.pone.0112200
Editor: Gnanasekar Munirathinam, Universidad de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Julio, 2014; Aceptado: October 13, 2014; Publicado: 11 de noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Jin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:.. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las micelas poliméricas han recibido considerable atención como portadores prometedores medicamento contra el cáncer, debido a sus notables ventajas, tales como pequeño tamaño, distribución de tamaño estrecha, alta biocompatibilidad, y la solubilización de fármacos hidrófobos [1], [2], [3], [4], [5]. micelas poliméricas autoensambladas con estructuras de núcleo /corteza permiten al sistema para incorporar fármacos poco solubles en agua en el núcleo hidrofóbico y protegerlos de la degradación en medios fisiológicos [6]. Por ejemplo, el núcleo hidrofóbico de las micelas compuestas de PCL-PEG ofrece un depósito para la incorporación de fármacos, mientras que la cáscara pegilado junto con su tamaño nanoscópico garantiza el soporte permanecen-un reconocido por el sistema reticuloendotelial y se someten a un período de circulación largo en la sangre [7], [8], [9].
Aunque micelas poliméricas exhiben una serie de ventajas, un desafío importante es su sitio específico de suministro de fármacos. sistemas de administración de fármacos micela polimérica de ligando modificados son capaces de administración de fármacos específica de sitio. Recientemente, numerosos sistemas de suministro de orientación activos han sido diseñados por la conjugación de PN con ligandos que se unen específicamente a los biomarcadores de dominios extracelulares de las células cancerosas. PSMA como hidrolasa folato I y glutamato carboxipeptidasa II, es una proteína transmembrana bien conocido [10] sobre expresa en las células epiteliales de cáncer de próstata [11], [12] y se ha demostrado que tiene un gran potencial para la terapia del cáncer de próstata (CaP). PSMA tiene una baja expresión en las células epiteliales normales de la próstata y la hiperplasia benigna de próstata. También se expresa en la neovasculatura de la mayoría de otros tumores sólidos, pero no en la vasculatura de los tejidos normales [13], [14]. Todas estas características hacen PSMA un biomarcador atractivo para la detección, el diagnóstico y el tratamiento del CaP [15], [16]. Un nuevo ligando pequeño molecular ((S) -2- (3 - ((S) -5-amino-1-carboxipentil) ureido) pentanodioico, SMLP) se une específicamente a PSMA ha demostrado su potencial en el tratamiento de cáncer en reciente años [17]. El inhibidor de PSMA a base de urea, SMLP, tiene una alta afinidad para PSMA debido a la fuerte unión de hidrógeno [10]. Hrkach y Langer
et al.
Desarrollado ACUPA (PSMA ligando) conjugado DTX NPs compuestos de PEG-b-PLGA o PEG-b-PLA utilizando un método de nano-emulsificación para apuntar PSMA y evaluado la eficacia anti-tumor de los PN
in vitro
y
in vivo
[18]. La excelente potencial que ofrece el vehículo-ligando de dirección PSMA sugiere la necesidad de desarrollar procesos de preparación más diversificadas y carrier-materiales en este campo.
En este estudio, un sistema de administración de fármacos auto-ensamblado de tamaño nanométrico basado en ligando se encontró micelas conjugado PEG-b-PCL para mostrar una gran promesa en el campo de la administración dirigida de fármacos. Copolímeros de PCL y PEG son ambos materiales biodegradables y biocompatibles conocidos ampliamente utilizados en el campo biomédico [19], [20], [21], [22], [23]. Debido a la introducción de ácido glicólico (GA) y ácido láctico (LA), que interrumpe la estructura ordenada de las cadenas moleculares, PLGA mostró baja cristalinidad. Como resultado, las micelas con núcleos de PCL que mostraron mayor cristalinidad son más estables que los que tienen núcleos de PLGA. Además, debido a PLGA es un copolímero aleatorio, es relativamente difícil de controlar la relación de GA a LA precisamente en la producción a gran escala. Sin embargo, la relación de los dos monómeros es un factor clave para influir en la propiedad de PLGA [24]. Así PCL fue utilizado como bloque de formación del núcleo debido a su mejor estabilidad y la facilidad de producir. PCL-mPEG o PCL-PEG-COOH se sintetizó mediante polimerización por apertura de anillo de ε-caprolactona iniciada por mPEG-OH o HOOC-PEG-OH [25], [26]. PCL-MPEG y PCL-PEG-SMLP micelas se prepararon utilizando DTX como un fármaco modelo para examinar los efectos citotóxicos sobre las células LNCaP. Además, una representación esquemática de la preparación y el proceso de endocitosis de DTX-PCL-PEG-SMLP se muestra en la Figura 1.
Materiales y Métodos
Materiales
L éster del ácido glutámico clorhidrato de di-terc-butilo y H-Lys clorhidrato de (Z) OT-Bu se obtuvieron de En Lai biotecnología Co, Ltd (Chengdu, República Popular China). mPEG-OH (Mw: 2 kDa) y MPEG-OH (Mw: 5 kDa) (Aladdin Agente Co., Shanghai, República Popular de China) y OH-PEG-COOH (Mw: 2 kDa), OH-PEG-COOH (Mw : 5 kDa) (Shanghai Seebio biotecnología Co, Shanghai, República Popular de china) se deshidrataron mediante destilación azeotrópica con tolueno antes de su uso. DTX (Shanghai Sanwei Pharma Ltd, Co, Shanghai, PR China) y la bolsa de diálisis éster de celulosa con un corte molecular de 7000 Da (Bioscience Ltd, Co, Shanghai, PR China) se utilizaron como se recibieron. ε-caprolactona (ε-CL, Aladdin Agente Co., Shanghai, P R China) se secó sobre CaH
2 a temperatura ambiente durante 48 h y se destiló a presión reducida. octoato estannoso fue adquirido de Aladdin Agente Co (Shanghai, P R China). Todos los disolventes orgánicos utilizados en los procedimientos de síntesis se adquirieron en el Reactivo Nacional de Medicina Química Co Ltd (Shanghai, República Popular China).
La próstata LNCaP y PC3 líneas celulares se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia China de Ciencias (Shanghai, china). Las células LNCaP fueron cultivadas usando frascos de cultivo de células-bind (Corning, USA).
Métodos
Síntesis de mPEG-PCL (PMS1) y PCL-PEG-SMLP (PMS2) copolímeros.
Los copolímeros con una gama de longitudes de bloque se prepararon mediante copolimerización por apertura de anillo de ε-CL iniciado por hidroxilo del PEG. Brevemente, se añadieron una cantidad predeterminada de ε-CL y octoato estannoso a un recipiente de reacción que contiene mPEG-OH o OH-PEG-COOH en una atmósfera de argón seco (octoato estannoso /ε-CL en relación molar 1:1000). A continuación, el recipiente de reacción se colocó en un baño de aceite y se mantuvo a 120 ° C durante 24 h. A continuación, los copolímeros en bruto se disolvieron en DCM y se precipita en éter dietílico frío para eliminar el monómero y oligómero sin reaccionar. A continuación, el producto se filtró y se secó para obtener un precipitado blanco.
PCL
12k-PEG
5k-COOH (1 g, 0,059 mmol) se disolvió en 5 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF) con 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida hidrocloruro (EDC) (57,4 mg, 0,3 mmol, 5 equiv) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (27,6 mg, 0,24 mmol, 4 equiv). A continuación, la mezcla de solución se agitó a temperatura ambiente durante más de 12 h bajo atmósfera de argón. El PCL
copolímero 5k-NHS-PEG 12k se precipitó en éter dietílico enfriado con hielo para proporcionar un precipitado blanco que se recogió y se secó para obtener el producto deseado como un polvo blanco (rendimiento, 90%). SMLP (300 mg) se disolvió en THF anhidro (20 ml) para preparar 10 mg /ml (SMLP /THF) aqua. PCL-PEG-NHS (500 mg, 0,03 mmol) y diisopropiletilamina (0,7 ml) se añadieron a 5 ml aqua (SMLP /THF), y la solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 20 h bajo argón. Después de la terminación de la reacción, la solución se purificó por diálisis durante 24 h y se secó por liofilización para obtener un polvo floculento blanco (rendimiento 90%). La estructura del copolímero final se caracterizó por
1 H espectroscopía de RMN.
PCL
4.8K-mPEG
2K y PCL
4.8K-PEG
se prepararon 2k-SMLP utilizando el mismo método indicado anteriormente.
caracterización
Polímero.
la
resonancia magnética nuclear 1H (
1 H RMN) de todas las muestras se registraron en un Bruker DMX 300 o 600 espectrómetro (Billerica, MA). Los desplazamientos químicos (δ) se dan en ppm usando tetrametilsilano como el patrón interno. Transformada de Fourier espectros de espectroscopía infrarroja se registraron en un espectrómetro Bruker Tensor 27, y las muestras se prepararon usando discos de KBr (Scharlau Chemie, Barcelona, España). cromatografía de permeación en gel (GPC) de ensayo se realizó en un Waters 1515 GPC instrumento (Waters Corp., Milford, MA) equipado con tres columnas Styragel (Waters Corp; 10
5, 10
4, y 103 Å) en tándem y un detector de índice de refracción 2,414 diferencial. DMF fue seleccionado como el eluyente a un caudal de 1,0 ml /min a 35 ° C. Las concentraciones de la muestra fueron de aproximadamente 2 mg /ml. Los pesos moleculares se calibraron usando patrones de poliestireno.
Preparación de micelas poliméricas.
micelas DTX-cargado se prepararon mediante diálisis. En primer lugar, 7 mg DTX y copolímero de 50 mg se disolvieron completamente en 2 ml de THF. A continuación 4 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 10 mM, pH 7,4 o 10 mM, pH 5,5) se añadió gota a gota a la solución con agitación continua durante una hora. Entonces, THF se eliminó por diálisis frente a PBS (10 mM, pH 7,4 o 10 mM, pH 5,5) durante 24 h usando una bolsa de diálisis de éster de celulosa (MWCO: 7.000 Da). El medio exterior fue sustituido tres veces (2, 6, y 12 horas). Por último, la mezcla se pasó a través de una membrana de 0,45 micras filtro para eliminar cualquier precipitantes.
contenido de carga del fármaco y la eficiencia de encapsulación.
Para determinar la eficiencia de contenido de carga del fármaco y la encapsulación, 500 l solución micelar DTX-cargado y 5 ml de THF se transfirió a un matraz aforado de 25 ml, se sometió a ultrasonidos a 180 W durante 10 minutos en un baño de ultrasonidos, y después se diluyó con fase móvil. La concentración en la solución resultante se determinó entonces mediante HPLC. El análisis cromatográfico se realizó utilizando una bomba Hitachi L-2130 y L-2400 un detector UV-Vis Hitachi operado a una longitud de onda de 230 nm, usando una columna Unitaria C18 (5 m, 150 x 4,6 mm). Una fase móvil de acetonitrilo y agua (60/40, v /v) fue seleccionado. La velocidad de flujo fue establecido a 1 ml /min. La respuesta del área de pico frente a la concentración DTX fue lineal en el rango de 0,5-30 g /ml (r
2 = 0,9999).
La eficiencia de contenido de carga del fármaco y la encapsulación se calcula a partir de las siguientes ecuaciones :
mediciones del tamaño de partícula
El tamaño de partícula y la distribución de las micelas se midieron mediante DLS utilizando NICOMP 380 submicron Medidor de partículas (Particle Sizing Systems, Santa Bárbara, CA).. Se utilizó un rayo láser a una longitud de onda de 632,8 nm. El ángulo de dispersión se fijó en 90 ° cuando se llevaron a cabo mediciones.
morfología de superficie.
Las muestras para observación TEM se prepararon mediante la colocación de una gota de solución de muestra (2 mg /ml para el copolímero) en a una rejilla de cobre recubierta con carbono. El exceso de solución se secó con papel de filtro. La rejilla se dejó secar durante 15 minutos. A continuación, las muestras se examinaron utilizando un Hitachi H-600 TEM funciona a un voltaje de aceleración de 100 kV.
in vitro
de lanzamiento.
El
in vitro
DTX cinética de liberación de las soluciones micelares cargadas con fármaco o la inyección DTX (Taxotere, Sanofi-Aventis, París, Francia) que contienen 300 mg DTX se realizaron mediante diálisis por difusión. La solución micelar cargada con fármaco y la solución de fármaco libre fueron colocados en las bolsas de diálisis (MWCO: 14000). Estas bolsas se sumergieron en 15 ml de PBS pH 7,4 (10 mM) o pH 5,5 (10 mM) que contenía 0,5% w /v de Tween 80. Posteriormente, las botellas se colocaron en una incubadora de agitación a una velocidad de agitación de 100 rpm bajo 37 ° C ± 0,5 ° C. Todos los medios de liberación fueron reemplazados con PBS fresco a intervalos predeterminados (1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h) con el fin para medir la concentración de fármaco. La concentración de DTX se midió por HPLC.
Cultivo de células y la citotoxicidad.
El LNCaP de próstata y líneas celulares PC3 se cultivaron en medio RPMI 1640 y F12K de Ham (Invitrogen, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, EE.UU.), respectivamente. Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera humidificada de aire 95% que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C.
ensayo de MTT se realizó para evaluar la citotoxicidad de DTX-PMS1 (nontargeted) y DTX-PMS2 ( dirigida). células LNCaP se suspendieron en medio de cultivo y se sembraron a 5000 células /pocillo en placas de 96 pocillos durante 24 h. A continuación, se dispersa DTX-PMS1, DTX-PMS2, y la solución DMSO de DTX (DDS) que contiene cuatro concentraciones de fármaco (0,1, 1, 10 y 20 g /ml) en cada muestra se incubaron en las células LNCaP. Por último, se determinó la viabilidad de las células después de 48 h y 72 h utilizando un lector de microplacas (IMARK Bio-Rad, EE.UU.).
El IC50 para cada sistema se calcula entonces. Todos los ensayos se llevaron a cabo con cinco muestras paralelas.
estudios de absorción celular.
En este estudio, se utilizó cumarina 6 como una sonda de fluorescencia. Se utilizaron líneas celulares de próstata independientes de andrógenos dependientes de andrógenos y (LNCaP y PC3, respectivamente). La captación celular de PMs dirigidos y no dirigidos (200 g /ml) que llevan cumarina 6 (100 mg /ml) (PMS1 y PMS2, respectivamente) se llevaron a cabo en LNCaP y líneas de células PC3 para investigar la influencia de SMLP conjugación sobre la captación celular. Las células se incubaron en placas de 96 pocillos con micelas de 4 h, se lavó con PBS frío tres veces, y después se fijaron con 70% de etanol durante 2 horas a -20 ° C. Un estudio de inhibición competitiva también se llevó a cabo utilizando SMLP libres para comprobar si los MPs fueron transportados en las células de una manera SMLP mediada. Se añadió SMLP libre con tres concentraciones diferentes (4 g /ml, 20 mg /ml y 100 mg /ml) en el medio junto con PMS2, se incubaron durante 4 h, se lavó tres veces con PBS frío y se fijaron con 70% de etanol durante 2 h a -20 ° C. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33342.
Las células fueron examinadas usando un contenido ImageXpress Micro XL campo amplio de alta Screening System (ImageXpress Micro XL, Molecular Devices, EE.UU.) con MetaXpress Software. Las imágenes de las células se determinaron por la técnica de canal de contraste de interferencia diferencial y las imágenes de los PM cumarina 6-cargado y los núcleos de las células teñidas por Hoechst 33342 se registraron con los siguientes canales: canal azul (Hoechst 33342) con excitación a 350 nm y el canal verde (cumarina 6) con excitación a 485 nm. Entonces, MetaXpress software se utilizó para cuantificar la intensidad de fluorescencia por célula.
Estadísticas.
Todos los datos fueron procesados utilizando el software Origen 8.5 y presentan como media ± desviación estándar, y se analizaron usando de Student
t-test
. Se realizaron análisis estadísticos y P & lt;. 0.01 fue considerado como el nivel de significación estadística
Resultados y Discusión
Síntesis y caracterización de mPEG-PCL y PCL copolímeros con PEG-COOH
un copolímero de bloque anfifílico compuesto de un bloque de PCL como la parte hidrófoba y un bloque de PEG como la parte hidrófila se sintetizó mediante polimerización por apertura de anillo usando PEG terminado en hidroxilo como iniciador macromolecular.
los pesos moleculares de los copolímeros se calcularon a partir de los
datos de 1H RMN mediante la comparación de las intensidades de pico de los protones de metileno de PEG con los protones de metileno de PCL, como se muestra en la Figura 2E. Las proporciones del bloque hidrófobo para el bloque hidrófilo se determinaron a partir de las intensidades relativas de la señal de protón PCL en 2,31 ppm y la señal de protón PEG en 3,62 ppm. Para el análisis de GPC, sólo un pico apareció en la curva de GPC (Figura 2A), lo que significa que la copolimerización con apertura de anillo de ε-caprolactona con PEG-OH fue completa y todos los residuos se retiraron después de la purificación. La polidispersidad del copolímero (Mw /Mn) se resume en la Tabla 1.
Síntesis y caracterización de PCL-PEG-SMLP
funcionalización de la superficie de la PCL- copolímero PEG-COOH con SMLP se alcanzó bajo condiciones de acoplamiento de amida estándar en presencia de EDC y NHS [27], [28]. La eficacia de acoplamiento con nucleófilos de amina se puede aumentar mediante la formación de un éster NHS intermedio [29].
La síntesis de polímero de PCL-PEG-SMLP se llevó a cabo mediante el siguiente método. En primer lugar, el carboxilo de PCL-PEG-COOH se activó con EDC y NHS para conseguir el intermedio PCL-PEG-NHS. A continuación, se hizo reaccionar el éster activo (NHS) de PCL-PEG-NHS con el grupo funcional amina de la SMLP obtener el polímero final PCL-PEG-SMLP (Figura 3).
El polímero de PCL
12k-PEG
5k-SMLP se caracterizó mediante FT-IR, como se representa en la figura 2F. Los picos más destacados que se muestran en la Figura 2F en 1671 y 1557 cm
-1 fueron atribuidos a la banda de amida banda II (grupo amino) I (grupo carbonilo) y la amida, respectivamente, mientras que la desaparición de estos picos (Figura 2G) indicó la formación del enlace amida entre SMLP y PCL
12k-PEG
5k-COOH. La estructura del conjugado se examinó adicionalmente por
1H NMR. La figura 2C muestra la
Espectro de RMN 1H de la conjugación del ligando y copolímero PCL
12k-PEG
5k-COOH. La señal característica que aparece en 3,60 ppm (a) fue asignado a la unidad de PEG. Los picos de las unidades de PCL aparecen en 4.4 a 4.8 ppm (b), 2,28 a 2,33 ppm (c), 1,61-1,70 ppm (d) y 1,35 a 1,43 ppm (e), como se muestra en la Figura 2C. Por otra parte, las señales en 2,49 ppm y 3,25 a 3,49 ppm se asignaron al pico del disolvente (DMSO) y el pico de agua, respectivamente. De acuerdo con la figura 2E, no hay señales relacionadas SMLP-mostrados en el espectro
1H NMR de no conjugada PCL
12k-PEG
5k-COOH, lo que indica que no hay interferencia con las señales de SMLP muestra en la Figura 2C .Comparing los picos de PCL-PEG-SMLP en la Figura 2C y los picos de SMLP ligando en la Figura 2B, los desplazamientos químicos eran idénticos. Peinar los resultados de FT-IR y
1H NMR mostró que el SMLP ligando se había conjugado con éxito a PCL
12K-PEG
5K-COOH. La pureza de los polímeros de ligando conjugado, que está críticamente relacionado con el
vitro
rendimiento en de las micelas, fue verificada por cromatografía de permeación en gel. Como se muestra en la Figura 2D, no se observó ningún rastro de SMLP libre en los cromatogramas de PCL
12K PEG-
5K-SMLP o PCL
4.8K-PEG
2K-SMLP, lo que indica que la ligando libre exceso se elimina por completo.
preparación y caracterización de micelas
En este trabajo, se empleó la diálisis para preparar los docetaxel-micelas, lo que lleva a la preparación con éxito de nontargeted [PCL
12K-mPEG
5k (PMS1), PCL
4.8K-mPEG
2K (PMs3)] y específica [PCL
12K PEG-
5K-SMLP (PMS2), PCL
4.8K-PEG
2K-SMLP (PMs4)] micelas. Además, las nanopartículas con diámetros mayores de 100 nm son más propensos a ser eliminados por el sistema reticuloendotelial [30], mientras que sus contrapartes con diámetros de menos de 100 nm eran más propensos a acumular en los tejidos tumorales [31], [32].
Los diámetros medios de micelas (PMS1, PMS2, PMs3 y PMs4) preparadas por diálisis fueron 51,4 ± 1,3 nm, 50,5 ± 1,1 nm, 37,1 ± 0,5 nm y 38,6 ± 0,7 nm, respectivamente. Los valores de índice de polidispersidad (PDI) de los cuatro micelas se muestran en la Tabla 1. Las gráficas DLS de PMS1 y PMS2 se muestran en la Figura 4 (A, B). La morfología y baja PDI de las micelas se ve confirmado por imágenes de TEM. La fotografía TEM (Figura 4, A
1 y B2) de PMS1 y PMS2 estaban de acuerdo con los resultados de DLS. Los diámetros más pequeños de las OMP obtenidos de las pruebas de TEM en comparación con DLS podrían atribuirse a la contracción de la carcasa PEG inducida por la evaporación del agua antes de la medición TEM [33]. Como resultado, el diámetro dado por DLS era más grande que la de TEM debido a la hidratación de la cáscara de PEG.
gráficos TEM de DTX-PMS1 (A
1) y DTX-PMS2 (B
2).
Para evaluar el contenido de carga del fármaco máxima y la eficiencia de carga del fármaco de los cuatro micelas, un simple estudio de estabilidad a corto plazo del contenido de DTX-cargada se realizó y los resultados se muestran en la Figura 5. en primer lugar, se añadió exceso de DTX durante la preparación de los cuatro DTX-PMS. Los PMs más cargadas se mantuvieron a temperatura ambiente y la muestra a tiempo predeterminado. Entonces, el contenido de DTX-carga de las muestras se midió por HPLC usando el método descrito. El perfil demostró que el contenido inicial de DTX-carga de los cuatro PMs era 10,4%, 10,8%, 9,6% y 9,8%, respectivamente. Los valores de contenido de DTX-carga cayeron gradualmente y se mantuvo constante después de 12 h para PCL
12k-PEG
5k y 24 h para PCL
4.8K-PEG
2 k (Figura 5, en círculos en cuadrados ). La reducción en el contenido de carga del fármaco puede ser debido a la ocurrencia de separación de fases entre DTX y PCL. El contenido de carga del fármaco después de un periodo de prueba de 7 días podría considerarse como la capacidad de PCL para DTX carga. Además, la mayor capacidad de PMS1 y PMS2 comparación con PMs3 y PMs4 podría atribuirse a las cadenas más largas de PCL de PMS1 y PMS2. Con la misma relación de la longitud de bloque hidrófilo para la longitud de bloque hidrófobo, la final eficiencia contenido de carga del fármaco y la encapsulación de los cuatro PMs se muestran en la Tabla 1. Estos resultados mostraron la una buena estabilidad a corto plazo del contenido DTX-loading , el contenido de carga del fármaco y la eficiencia, lo que confirma que las micelas basadas en PCL
12K PEG-
5K-SMLP y PCL
12K-mPEG
5k copolímeros eran formulaciones óptimas.
(n = 3).
in vitro
liberar
El
in vitro
comportamiento de liberación de cuatro personas en DTX-MP fue investigado por el método de difusión de diálisis [34]. El comportamiento de liberación de Taxotere se utilizó como control, y los perfiles de liberación de los cuatro DTX PMs a pH 7,4 (entorno simulado de los tejidos normales) y pH 5,5 (entorno simulado de los tejidos tumorales) se muestran en la Figura 6. Casi 90% de DTX fue liberado de Taxotere a las 24 h. A diferencia de Taxotere, todas las micelas mostraron una liberación rápida de DTX en la etapa inicial (primera 24 h) y una liberación sostenida durante el siguiente 72 h. Por otra parte, los perfiles de liberación similares de PMS1 y PMS2 indicaron que la conjugación ligando no influyó en el patrón de liberación.
En las cuatro PMs, porque la estructura éster poli de PCL es sensible al ácido, la liberación de DTX de micelas era más lenta a pH 7,4 que a pH 5,5. Este efecto promueve la liberación de DTX en los tejidos tumorales y en los endosomas que son más ácidos que la sangre [35]. La cantidad de no-DTX liberado fue del 20-25%. Esta proporción de drogas existido en los núcleos micelares; atrapado en las precipitaciones generadas por el calor y tween 80 inducida desglose micelar y adsorbido en bolsa de diálisis y cristalería [36].
citotoxicidad celular
PSMA es un marcador molecular validada sobreexpresados por las células LNCaP [37] , [38]. El efecto potenciador de la citotoxicidad ligando PSMA (SMLP) conjugado DTX-PMs se evaluaron por medio de experimentos de citotoxicidad in vitro utilizando LNCaP y células PC3, respectivamente. La biocompatibilidad de PCL
12K-mPEG
5K y PCL
12K-PEG
5K-SMLP se confirmó mediante la incubación de micelas libres de drogas compuestas de estos dos polímeros en diversas concentraciones con células LNCaP y PC3 células , respectivamente. La viabilidad de las células no se vio afectada durante un período de incubación de 72 h que confirmó la buena biocompatibilidad de estos polímeros (Figura 7). Los resultados también demostraron que las células no pueden ser interferidas en presencia de ligandos
.
(n = 5).
En este estudio, la solución de DMSO de DTX (DDS) fue utilizado en lugar de Taxotere como control positivo porque Tween 80 en Taxotere es citotóxico y esto puede influir en los resultados [39]. De acuerdo con los resultados de los ensayos de MTT (Figura 8), después de una incubación de 48 h, la citotoxicidad de PMS1 era casi el mismo que el DSD. Sin embargo, PMS2 mostró una viabilidad celular LNCaP significativamente menor en todas las concentraciones. En las líneas celulares PC3, sin embargo, no se observó diferencia significativa en la viabilidad celular entre DSD, PMS1 y PMS2 (Figura 8). Esto indicó que la conjugación ligando es beneficioso para facilitar la absorción celular de micelas: como PMS1 y PMS2 mostraron perfiles de liberación similares, la disminución de la viabilidad celular podría ser atribuido a la acumulación intracelular de los fármacos mejorada a través de endocitosis mediada por receptor. Después de 72 h de incubación, tanto PMS1 y PMS2 mostraron diferencias significativas respecto a DSD en la línea celular LNCaP y PMS2 mostraron la mayor citotoxicidad. Además, se observaron importantes viabilidades celulares inferiores en las líneas celulares PC3 tratadas con cualquiera de PMS1 o PMS2 de DSD en la concentración de fármaco de 20 mg /ml, lo que significa que la captación celular inadecuada de micelas podría ser compensada por el aumento de tiempo de incubación y la concentración de fármaco. Sin embargo, no hubo diferencias significativas entre PMS1 y DSD después de la incubación de 48 horas para las células LNCaP. Este fenómeno ha confirmado el comportamiento de liberación sostenida de fármacos de DTX de PMS1
in vitro
(*) significativamente diferente de DSD.; (#) Significativamente diferente de PMS1; (N = 5). Nota: * P & lt; 0,01,
#P & lt; 0,01
La viabilidad celular de PMS2 a 20 mg /ml era casi la mitad que el de PMS1 de células LNCaP después de cualquiera de 48 h o 72 h. incubación. Estos datos demostraron que DTX-PMS2 fue menos eficaz en la mejora de la citotoxicidad en células PC3, mientras que inhibe selectivamente la proliferación de células LNCaP. En las otras palabras, estos resultados sugieren la alta afinidad de SMLP para PSMA podría mejorar la citotoxicidad en las células LNCaP. Después de 72 h de incubación en células LNCaP con la cantidad de DTX dado a una concentración fija de 20 mg /ml, la tasa de inhibición del crecimiento celular de DSD, PMS1 y PMS2 fueron 58,4%, 67,7% y 83,9%, respectivamente.
el IC50 para cada muestra se muestra en la Tabla 2. para las células LNCaP, la IC50 de DTX-PMS2 era mucho menor que la de DTX-PMS1 y DSD después de 48 h o 72 h de incubación. Sin embargo, la IC50 de DTX-PMS1 era casi la misma que la de DSD después de 48 h de incubación, pero era 5 veces más baja después de 72 h de incubación con las células LNCaP, este confirmó aún más el efecto de compensación en la citotoxicidad de micelas por tiempo de incubación prolongado. Aunque DTX-PMS2 (dirigida) exhibió la mayor eficiencia de destrucción celular, la DTX-PMS1 también muestra un efecto sobre las células LNCaP. Puesto que los dos micelas poseían perfiles de liberación similares, las diferencias en la citotoxicidad estaban relacionados con su diferente capacidad celular de entrada que se refleja en las diferencias en afinidades con PSMA.
Absorción celular
para estudiar el efecto de la orientación PSMA ligando en la captación celular de los PMs, microscopía de fluorescencia se llevó a cabo en las células LNCaP con ambos micelas (PMS1) dirigidos (PMS2) y no específica marcados con cumarina-6. Después de 4 h de incubación a 37 ° C, se tomaron imágenes HCSS de células LNCaP y se muestran en la figura 9A. La intensidad de fluorescencia de las células incubadas con micelas dirigidas (PMS2) fue significativamente mayor que la de su homólogo no específica (PMS1), y la intensidad de fluorescencia cuantificada se estimó en 5 veces (Figura 9C). La capacidad de SMLP conjugación en la mejora de la captación celular podría reflejarse en ensayos de viabilidad celular. A fin de verificar el papel de SMLP en la endocitosis, se llevó a cabo un experimento de ligando competitivo. Como se muestra en la Figura 8B, la adición de ligandos libres a diversas concentraciones disminuyó gradualmente la absorción de PMS2, y la cantidad de micelas endocitosis alcanzó un nivel similar al de su homólogo no dirigida a alta concentración de SMLP (100 g /ml, Figura 10B) , lo que indica la presencia de SMLP libre en el medio inhibió la endocitosis de PMS2 mediante la unión a la superficie PSMA de manera competitiva contra SMLP micela conjugado. A fin de verificar la mejora de ligando en la mediación de la endocitosis, se llevaron a cabo estudios de captación celular de ambas preparaciones con /sin ligando SMLP en la línea celular PC-3, que no expresan la proteína PSMA [40]. Como se muestra en la Figura 9 (B y C), las micelas targeted- y que no son objeto mostraron intensidad fluorescente intracelular similares, lo que significa la conjugación de SMLP es un factor clave en la promoción de la captación celular de micelas preparadas en células que expresan PSMA. También los resultados anteriores demostraron que PMS2 se endocitosis en células LNCaP a través de múltiples vías: parte de las micelas fue captado por las células LNCaP de manera SMLP mediada, mientras que hubo micelas que entran en las células a través de otras vías, incluyendo la endocitosis mediada por caveolina-o clathrin- y caveolina-independiente endocitosis [41] como la captación celular de micelas no se inhibió completamente por adición SMLP. Estos resultados explican la mayor citotoxicidad de las micelas dirigidas (PMS2) en ensayos de MTT y se indica el beneficio de PMs con un ligando de dirección en la terapia del cáncer de próstata.
La célula núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 con el canal azul, la cumarina de 6-MP son cargados en el canal verde. La captación celular se visualizó mediante la superposición de las imágenes mostradas por el canal de núcleos y el canal de MPs. El gráfico de la intensidad de fluorescencia /célula de 100 mg /ml cumarina 6-cargado PMS1 y PMS2 con una concentración de 200 g /ml después de 4 h de incubación con células LNCaP y células PC3 (C).
Conclusiones
En este estudio, se ha desarrollado un novedoso autoensamblaje de micelas DTX-PEG-PCL-SMLP atacar a las células LNCaP. Con la misma relación hidrófilo /hidrófobo de longitud de bloque, una serie de micelas poliméricas con un diámetro de menos de 60 nm se prepararon por diálisis. PMs que no son objeto estables y PMS específicas con contenido de fármaco de carga constante se obtuvieron mediante ensayos de estabilidad a corto plazo. la carga de fármaco fiable y sostenida comportamiento de liberación se obtuvieron debido a la eliminación de los fármacos sobre-cargados.