Extracto
Sitio específico de modificaciones de las histonas son importantes reguladores epigenéticos de la expresión génica. A medida que la desregulación de los genes a menudo resulta en trastornos complejos, la modulación correctivo de marcas de histona específicas del lugar podría ser una estrategia terapéutica o preventiva de enfermedades de gran alcance. Sin embargo, dicha modulación por compuestos de la dieta y el consiguiente impacto en el riesgo de enfermedad permanece inexplorado. Aquí examinamos phenethylisothiocyanate (fenil isocianato), un compuesto de la dieta común derivado de vegetales crucíferos con propiedades quimiopreventivos conocidos en condiciones experimentales, como un posible modulador de modificaciones de las histonas en células de cáncer de colon humano. El presente estudio informa novela, y específicos cambios químicos dinámicos a la histona H3 en forma gen promotor específico, asociados con la exposición fenil isocianato en las células epiteliales SW480 derivadas de tumores de colon humano. Además, PEITC atenúa la proliferación celular de una manera de la concentración y dependiente del tiempo, probablemente mediada por la señalización de apoptosis dependiente de caspasa. Los efectos de PEITC en modificaciones de las histonas y los cambios de expresión de genes se logran a bajas concentraciones, no citotóxicas, en contraste con las concentraciones más altas necesarias para detener la proliferación de células de cáncer. Una mayor comprensión de las alteraciones epigenéticas específicas de compuestos de la dieta puede proporcionar la mejora de las estrategias de quimioprevención para reducir la carga de la salud del cáncer y otras enfermedades humanas
Visto:. Liu Y, Chakravarty S, M Dey (2013) Phenethylisothiocyanate Altera y Site- modificaciones de las histonas cola promotor específico de células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e64535. doi: 10.1371 /journal.pone.0064535
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Septiembre, 2012; Aceptado: April 16, 2013; Publicado: 28 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo principal para este trabajo provino de los Institutos nacionales de Salud de subvención [R00AT4245] (a MD). apoyos adicionales vinieron de la Estación Experimental de Agricultura de Dakota del Sur otorga 328100/318000 (a MD) y 3AH386 (SC), el control biológico y análisis por Fotónica Aplicada: la Dakota del Sur 2010 Centro concesión 3SG163 (SC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer sigue siendo la segunda causa principal de las muertes en los Estados Unidos [1]. Afortunadamente, muchos compuestos dietéticos pueden modular de forma potente diversas dianas moleculares, lo que lleva a la prevención del cáncer de iniciación, promoción y progresión. En particular, las frutas y las verduras son fuentes ricas en compuestos biológicamente activos que a menudo tienen toxicidades bajas pero eficacias significativas [2]. En el pasado, el cáncer fue concebido estrictamente como una enfermedad de mutaciones, pero la investigación más reciente también asocia el estado de enfermedad con la perturbación de las redes de regulación celular, y la interrupción de la función del gen y la regulación de genes están ahora tanto reconocido como características del cáncer [3] , [4], [5]. Por lo tanto, las medidas de prevención de la morbilidad dirigidos a descubrir los elementos clave de las redes que regulan la función de genes, tales como la cromatina, podrían ser efectivas. Las alteraciones de la cromatina modificaciones específicas del lugar, conocidos como cambios epigenéticos, son relevantes para la oncología clínica, ya que están estrechamente asociados con la expresión génica y las perturbaciones de la red en el estado de enfermedad [6], [7]. Por lo tanto, dilucidar el papel de compuestos de la dieta en la reposición de los paisajes epigenéticos aberrantes responsables de la expresión de genes alterados pueden facilitar las prácticas médicas preventivas.
La base epigenética de la regulación de genes se manifiesta en la unidad estructural de la cromatina, el nucleosoma, que es un conjunto de octámeros histonas envueltos por el ADN genómico. Las modificaciones de histonas constituyen un punto de control molecular importante en la regulación de la expresión génica, y estas modificaciones están frecuentemente alterado en el cáncer [6], [7]. Entre muchas modificaciones de la cola de aminoácidos de las histonas conocida, metilación y acetilación de los residuos de lisina en la histona H3 se han estudiado ampliamente en relación con el silenciamiento de genes y la regulación de genes. Dimethylation de H3 en la lisina 9 (H3K9me2) y trimethylation de H3 en la lisina 27 (H3K27me3) se asocia frecuentemente con la transcripción represión y silenciamiento de los genes [8]. metilaciones histona lisina específicas de sitio son catalizadas por transferasas histona metilo (HMTs), y la eliminación de los grupos metilo son catalizadas por desmetilasas. Del mismo modo, la desacetilación de las histonas en los promotores de genes catalizadas por las histonas desacetilasas (HDACs) se correlaciona con la condensación de dominios cromosómicas regiones de la incompetencia de la transcripción y la baja regulación de los genes asociados marcado [9]. Aunque existen estudios in vitro de la función de los fitoquímicos de la dieta en la modulación de los niveles de HMTs y HDACs en pequeñas cantidades [10], la modulación de la posición específica de modificaciones H3 lisina por compuestos de la dieta de una manera específica de gen sigue siendo relativamente inexplorada [11] . A continuación, se investigó H3-acetilación (H3-Ac) y metilaciones H3 lisina específicos del lugar (H3K27me3 y H3K9me2) en asociación con phenethylisothiocyanate (fenil isocianato) modulación de la expresión génica mediada por células de cáncer de colon en humanos. Esta es una continuación de nuestros informes anteriores sobre fenil isocianato como un compuesto alimenticio con potenciales funciones anti-inflamatorias en diversos modelos experimentales [12], [13].
fenil isocianato se produce de forma natural en la forma de su precursor glucosinolatos, gluconasturtina, en las verduras como la col, la coliflor, wintercress, y el brócoli. PEITC ha mostrado potencial antioxidante y actividad quimiopreventiva en modelos experimentales de varios tipos de cáncer [14], [15]. Se exhibió ninguna toxicidad evidente en los estudios de seguridad de drogas [16] y se encuentra actualmente en ensayos clínicos de tratamientos para el cáncer de pulmón (clinicaltrials.gov: NCT00005883, NCT00691132). En el ratón, previamente demostrado que PEITC atenúa la inflamación del colon y modula una serie de posibles marcadores biológicos relacionados con la inflamación y la carcinogénesis de colon. Estos biomarcadores incluyen genes relacionados con la respuesta inflamatoria, la apoptosis, la regulación del ciclo celular, la proliferación, citoquinas /quimioquinas actividad, y la regulación transcripcional [12], [13].
El cáncer colorrectal es la segunda causa principal de cáncer muertes relacionados con la PI en los Estados Unidos [21]. Curiosamente, una asociación mecánica entre la inflamación crónica y un aumento del riesgo de cáncer que surge de la inestabilidad genética y epigenética inflamación inducida está ahora bien aceptado [17]. Actores clave en esta asociación incluyen factores de transcripción, tales como el factor nuclear kappa B (NFKB) y transductores de señal y activadores de transcripción (STAT), citocinas /quimiocinas, y metaloproteinasas de matriz (MMP), una familia multigénica de Matriz extracelular dependiente de cinc la remodelación de endopeptidasas. Estos mediadores celulares, algunas de las cuales hemos estudiado previamente en modelos de ratón [12], [13], tienen importantes funciones relacionadas con la derivación de la inmunidad adaptativa, la proliferación, la supervivencia de las células malignas, el crecimiento tumoral, la angiogénesis, la invasión y la metástasis [17 ], [18], [19], [20]. El presente estudio investigó cambios en la cromatina en asociación con la modulación mediada por fenil isocianato de la expresión de estos mediadores en las células de cáncer de colon humano.
Materiales y Métodos
Medicamentos y Productos Químicos
Dimetil sulfóxido (DMSO), lipopolisacárido (LPS, de
Escherichia coli cepa
O55: B5), penicilina /estreptomicina, y phenethylisothiocyanate (PEITC) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS), y TrypLE se adquirieron de Gibco (Grand Island, NY). Human interferón-γ (IFN) se adquirió de R amp y; D Systems (Minneapolis, MN). solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirió de Thermo Scientific (Rockford, IL). Para el Western Blot, un anticuerpo contra β-actina se compró a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), y anticuerpos contra STAT1 STAT1 y fosforilado (Ser727) se adquirieron de Millipore (Billerica, MA). DyLight 800 anti-conejo anticuerpo secundario fue adquirido de Li-Cor Biosciences (Lincoln, NE). Los anticuerpos utilizados para el ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) fueron anti-acetil-histona H3, IgG anti-trimetil-histona H3 (Lys27), y el conejo para las muestras de control negativo de Upstate Biotechnology (Billerica, MA) y anti-dimetil-histona H3 (Lys9) de Abcam (Cambridge, MA). Las enzimas utilizadas para el chip de ensayo fueron micrococcal nucleasa (MNase) de Señalización Celular (Beverly, MA) y proteinasa K de Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL). Los oligonucleótidos fueron sintetizados por IDT DNA Inc. (Coralville, IA). La aprotinina productos químicos de ensayo ChIP, DL-1, 4-ditiotreitol (DTT), y Nonidet-P40 (NP-40) se adquirieron de Thermo Scientific (Rockford, IL), mientras que el butirato sódico, se adquirieron de proteína-A-sefarosa, y sacarosa de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). tampón de incubación chip fue adquirido de Abcam (Cambridge, MA), y una suspensión de ADN purificador para la purificación de ADN chip-grado fue adquirido de Diagenode (Denville, Nueva Jersey).
Cell Cultura y
SW480 (ATCC CCL-228), HT-29 (ATCC HTB-38), y THP-1 (ATCC TIB-202) las líneas celulares obtenidas de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina (25 U /ml) /estreptomicina (25 mg /ml) en un 95% de aire /5% de CO ambiente
2-humidificado a 37 ° C. Tres líneas de células se cultivaron como se describe [24]. Brevemente, las células THP-1 se trataron con PEITC a una dosis pre-determinado por 8 h antes de elicitación con LPS (1 mg /ml). SW480 y las células HT-29 se cebaron con IFN (10 ng /ml) durante 12 h, se trató con PEITC de 5 h, y después se estimularon con LPS (10 o 50 ng /ml) durante 4 o 1 h, respectivamente. LPS y PEITC se disolvieron en DMEM y DMSO, respectivamente, con DMSO usado como vehículo. Para cada experimento, se incluyó un control positivo (células tratadas con DMSO y LPS /IFN) y un control negativo (células tratadas sólo con DMSO). Dos réplicas fueron hechas para cada tratamiento. tratamientos PEITC se realizaron a 2,5, 5, 10, y 15 mM concentraciones. Para análisis de la expresión dependientes del tiempo los cambios de STAT1 y otros genes de interés (GOI) en respuesta a PEITC, SW480 células fueron tratadas con 10 mM PEITC para 5, 8, 12, y 18 h. Todos los experimentos se repitieron un mínimo de tres veces.
Ensayo de viabilidad celular, Determinación de la dosis rango, y la proliferación celular
Un CellTiter 96 Solución acuosa Un kit de ensayo de proliferación celular (MTS, 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio, sal interna; Promega, Madison, WI) se utilizó para determinar el número relativo de células SW480 viables restante después del tratamiento PEITC, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo se realizó mediante el tratamiento de células SW480 con diferentes concentraciones PEITC, seguido de la adición de reactivo CellTiter 20 l directamente a los pocillos de cultivo, incubación durante 2 horas a 37 ° C y, a continuación el registro de la absorbancia a 490 nm con un lector de placas BioTek Sinergia H4 ( BioTek, Winooski, VT). Antecedentes 490 nm de absorbancia se corrigió mediante la preparación de un conjunto por triplicado de pocillos de control (sin células) que contiene el mismo volumen de medio de cultivo y el reactivo CellTiter como en los pozos experimentales. El mismo ensayo también se llevó a cabo usando concentraciones más altas de PEITC (hasta 80 mM) y la exposición de las células durante períodos de tiempo más largos de hasta 48 h para determinar los efectos anti-proliferación de PEITC en células SW480 (Figura 1). Cabe señalar que las concentraciones aún más bajas (por encima de 5 mM) de tratamiento PEITC por períodos de incubación más largos, tal como 48 h inducen la muerte celular significativa y la degradación del ARNm (Figura 1). Se seleccionaron concentraciones de PEITC en la que no hay pérdida significativa de la viabilidad celular se produjo (sin efectos citotóxicos) para todos los experimentos adicionales (Figuras 2, 3, 4, 5, 6). Por lo tanto, todos los ensayos de expresión génica (ARN y de expresión de proteínas) y los cambios epigenéticos reportados en este manuscrito se determinaron en el punto de tiempo de 5 h a menos que se indique lo contrario. Una exposición de 40 M de PEITC durante 12 h o menos no mostró una pérdida estadísticamente significativa en la viabilidad celular (Figura 1A). Para las observaciones dependientes del tiempo (Figura 5 y S1, S2, S3, S4, S5), células con 10 mM tratamiento PEITC se incubaron durante hasta 18 h, como una pérdida estadísticamente significativa en la viabilidad celular no se observó hasta que punto de tiempo ( Figura 1A).
Después de 12, 24, y 48 h de exposición PEITC y una posterior 2 h de incubación con el reactivo acuoso CellTiter (Promega), a
490 nm se midió en las células SW480 en una BioTek Sinergia H4 lector. porcentaje de viabilidad celular se muestra en relación al control (sin fenil isocianato) como la media ± SEM (A); efectos dependientes de la concentración de fenil isocianato a las 48 h en la fragmentación del ADN (B); la modulación dependiente de la concentración de la expresión de genes relacionados con la apoptosis y el ciclo celular por PEITC a las 48 h. GAPDH se utilizó como un control de limpieza para la cuantificación relativa de los cambios de expresión génica (C); para todos los experimentos n = 3. * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. No hay pérdida de la viabilidad celular en el grupo de 10 PEITC mu M en comparación con el grupo sin PEITC se observó hasta 12 h.
Seis genes se muestran para que asocia-PEITC también se observaron cambios en modificaciones H3 . Gois para los que no se observaron cambios H3-fenil isocianato de exposición asociada se muestran en la Tabla 3, pero no en la cifra actual. Los efectos de los tratamientos PEITC fueron medidos por la cantidad de ARNm en relación expresada por GoI en las células tratadas. La cantidad de ARNm se midió usando tiempo real de RT-PCR, con GAPDH como control interno. Los valores más bajos representan mayores efectos inhibitorios. Los valores son la media ± SEM (n = 6). * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. Cuando todos los valores por debajo de la línea de puntos que correspondan a la misma categoría de
valor de p
, estrellas individuales se han omitido para evitar el hacinamiento de la figura. significados estadísticos se miden en relación con el control positivo, que son las células tratadas con LPS y no PEITC, que muestra los niveles más altos de inducción de genes.
cambios en la metilación de histona H3 en las regiones promotoras de los genes de interés (GOI ) en las células SW480. Cromatina de las células SW480 se cosechó después de 5 h de tratamiento 10-M fenil isocianato. Los resultados de ChIP análisis utilizando (A) anti-trimetil-histona H3 Lys27 (H3K27me3) y (B) anti-dimetil-histona H3 Lys9 (H3K9me2) se muestran anticuerpos. De 13 Gois probados en células SW480, seis genes mostraron cambios estadísticamente significativas asociadas-fenil isocianato en estados H3K27me3 y un gen mostraron estadísticamente significativos cambios asociados-fenil isocianato en estado H3K9me2. Las secuencias de ADN fueron cuantificados por PCR en tiempo real usando cebadores de promotor. porcentaje de entrada media ± SEM (n = 3) de cada experimento se representa gráficamente. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001 en comparación con las células de control positivo
cambios acetilación de la histona H3 en la región promotora de los genes de interés (GOI) en SW480 Células. Cromatina de las células SW480 se cosechó después de 5 h de 10 mM tratamiento fenil isocianato. De 13 Gois probados en células SW480, dos genes mostraron cambios estadísticamente significativas asociadas-fenil isocianato en estado de H3-Ac. Los resultados de los análisis de chip usando un anticuerpo anti-acetil-histona H3 se muestran. Las secuencias de ADN fueron cuantificados por PCR en tiempo real usando cebadores de promotor. porcentaje de entrada media ± SEM (n = 3) de cada experimento se representa gráficamente. * P & lt; 0,05, *** p & lt;. 0,001 en comparación con las células de control positivo
Los resultados representativos que muestran los efectos dependientes del tiempo de 10 mM tratamiento PEITC sobre los niveles de ARNm de STAT1 y sobre el estado de metilación H3K27me3 . células SW480 se trataron con 10 mM PEITC en los puntos de tiempo indicados (A, B). Los niveles de ARNm de STAT1 se normalizaron a los niveles de GAPDH y se expresaron como un porcentaje relativo a las células de control positivo (A). Histona H3 cambios de metilación en la región promotora STAT1 en las células SW480 se determinaron utilizando un anticuerpo anti-H3K27me3 para el chip. Las secuencias de ADN fueron cuantificados por PCR en tiempo real (B). Los puntos de datos representan la media ± SEM (n = 4) de cada experimento. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 en comparación con las células de control positivo. Las líneas de puntos verdes indican una posible correlación inversa (para las marcas represivas) entre los cambios en los niveles de ARNm y estado de modificación H3 en las células. La presencia o ausencia de correlaciones similares para las cinco restantes GoI se muestran en las figuras S1, S2, S3, S4, S5.
inmunotransferencia que muestra analiza la supresión de STAT1 celular total, así como pSTAT1 nuclear activada en respuesta a los tratamientos PEITC en las células SW480 de una manera dependiente de la concentración. (A) por inmunotransferencia. análisis (B) densitométrico de inmunoblot. Las células se pre-trataron con varias concentraciones de PEITC por 5 h antes de la activación LPS 4 h. células no estimuladas y células estimuladas sirvieron como controles negativos y positivos. Banda intensidades se normalizaron a ß-actina. Los valores se expresan como medias ± SEM (n = 3) de tres experimentos separados. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.01
Fragmentación Ensayo de ADN para la detección de apoptosis
SW480 células tratadas con diferentes concentraciones de PEITC se incubaron durante 48 h antes de la cosecha de ADN genómico utilizando DNAzol (Invitrogen, Grand Island, NY), siguiendo el protocolo del fabricante. La fragmentación del ADN se visualizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y tinción GelRed (Biotium, Hayward, CA).
Total RNA extracción, purificación y síntesis de cDNA
El ARN total fue extraído a partir de células utilizando TRIzol reactivo (Invitrogen, Grand Island, NY), siguiendo las instrucciones del fabricante. RNA se cuantificó mediante mediciones de absorción a 260 y 280 nm usando el sistema de NanoDrop espectrofotómetro (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). a continuación, el ARN se trató con DNasa I (Invitrogen Inc.), siguiendo las directrices del fabricante para eliminar cualquier traza de contaminación de ADN. Los ADNc se sintetizaron usando 3 g de ARN para cada muestra usando la alta capacidad de cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. La extracción de RNA, la purificación y la síntesis de ADNc se realizó como se describe anteriormente [13].
Real-Time PCR cuantitativa
Los ADNc sintetizados se diluyeron cuatro veces. Dos microlitros de cada muestra diluida se añadió a 0,5 l de cebadores específicos de genes y 12,5 l de potencia SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosciences, Foster City, CA) y el volumen final traído a 25 l añadiendo agua destilada estéril. Las amplificaciones por PCR se realizaron en un sistema de Mx3005P (Roche /Stratagene) utilizando un ciclo a 50 ° C durante 2 min, un ciclo de 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de 15 s a 95 ° C y 1 min a 60 ° C , y un último ciclo con 95 ° C durante 1 min, 55 ° C durante 30 s, y 95 ° C durante 30 s, tal como se describe [13]. NTC (sin control de plantilla), control sin RT, y PEITC controles de sólo fueron utilizados como apropiada para fines de control de calidad. Todas las muestras se procesaron por duplicado. , cebadores intrón-que abarca genes específicos utilizados en el presente estudio se describen en la Tabla 1 (para la expresión de ARNm PEITC dependiente de la concentración) y en la Tabla 2 (para los experimentos de ChIP). Los cálculos de los niveles relativos de expresión se realizaron utilizando el ΔΔC
t-método [25]. Los valores de datos son medias de al menos tres experimentos independientes y se expresan como la cantidad de ARNm relativa con respecto a un control positivo, que se normaliza a un valor de 1,0.
Análisis de transferencia Western
para los análisis de inmunotransferencia, IFN-cebados, PEITC-tratados SW480 células se activaron con LPS durante 4 h y se recogieron usando tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Na 1
2EDTA, EGTA 1 mM, 1% NP-40, desoxicolato de sodio al 1%, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 1 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na
3Vo
4, 1 mg /ml de leupeptina). Para la preparación del extracto nuclear y la determinación de la concentración de proteína, los protocolos para NE-PER nucleares de extracción Reactivos y el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA del fabricante (Thermo Scientific, Rockford, IL) fueron seguidos. Las proteínas (50 g /carril) se separaron por 12% SDS-PAGE y los productos se electro-transferido a polyvinyldene difluoruro (PVDF) membranas (Thermo Scientific, Rockford, IL). Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 h, se lavaron tres veces en PBS, se incubaron con el anticuerpo primario (de conejo anti-β-actina de Santa Cruz Biotechnology y conejo anti-STAT1 y anti fosforilados STAT1 [Ser727] de Millipore) durante la noche, se lavaron tres veces en Tween-20 (0,1% en PBS), y se incubaron con 800 DyLight anti-anticuerpo secundario de conejo de Li-Cor durante 1 h, todas a temperatura ambiente. Después de lavado en Tween-20 (0,1% en PBS), se obtuvieron imágenes de manchas con un sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (Li-Cor).
cuantitativa Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Análisis
Las células se sembraron a una densidad de ~3-5 × 10
6 por pocillo en placas de 6 pocillos 18 a 24 h antes del tratamiento, después se aclararon dos veces con PBS frío y se cosecha después del tratamiento [26]. El chip de ensayo se llevó a cabo utilizando una versión modificada de un método publicado previamente [27]. Las células se suspendieron en tampón enfriado con hielo 1 (0,06 M KCL, NaCl 15 mM, MgCl 5 mM
2, 15 mM Tris-HCl pH 7.4 a 7.6, EGTA 0,1 mM, 0,3 M de sacarosa, 180 mg de aprotinina, 5 mM butirato de sodio, mM PMSF 0,1, DTT 0,5 mM) y tampón 2 (0,8% NP40 + Buffer 1) durante 10 min en hielo. Las suspensiones celulares se añaden a nuevos tubos que contenían tampón 3 (0,06 M KCL, NaCl 15 mM, MgCl 5 mM
2, 15 mM Tris-HCl pH 7.4 a 7.6, EGTA 0,1 mM, 1,2 M de sacarosa, 180 mg de aprotinina, 5 butirato de sodio mM, PMSF 0,1 mM, DTT 0,5 mM). Después se centrifugaron las muestras, se recogieron los núcleos y se resuspendieron en tampón de digestión MNase (0,32 M de sacarosa, 50 mM Tris-HCl pH 7,4-7,6, MgCl 4 mM
2, 1 mM de CaCl
2, 0,1 mM PMSF, butirato de sodio 5 mM), se incubaron en un 37 ° C baño de agua durante 6 minutos, y 20 l de 0,5 M EGTA añadió para detener la reacción. De esta manera, la cromatina se digirió con una longitud media de ADN de 300 a 800 pb. Después de la centrifugación, el sobrenadante contenía la primera fracción soluble de la cromatina, S1. El sedimento se resuspendió en tampón de diálisis (1 mM Tris-HCl pH 7.4 a 7.6, EDTA 0,2 mM, PMSF 0,2 mM, butirato de sodio 5 mM), colocado en hielo durante 1-2 h, y se centrifugó. El sedimento resultante fue la segunda fracción de la cromatina soluble, S2. Las alícuotas de las dos fracciones de cromatina (10-20 g S1 y S2 10-20 g) se mezclaron, el volumen diluido a 1 ml con tampón de incubación ChIP (Abcam), y la mezcla se sometió a inmunoprecipitación con anticuerpos específicos, con la rotación durante la noche a 4 ° C. cromatinas inmunoprecipitadas se extrajeron mediante el uso de proteína-A Sepharose y se purificaron mediante el uso de una suspensión de ADN purificador (Diagenode, Denville, NJ). Una alícuota de cada molde de ADN inmunoprecipitado (100-150 ng) se utilizó para el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real utilizando la secuencia específica de promotor del gen cebadores (Tabla 2). La señal de ADN inmunoprecipitado amplificado por PCR se normalizó a la señal de PCR a partir de ADN de entrada no inmunoprecipitaron [28]. Las señales obtenidas por precipitación con IgG de control se restaron de las señales obtenidas con los anticuerpos específicos. Los cálculos se basan en la media de al menos tres experimentos independientes, y los resultados se expresan como un porcentaje de la entrada (Figuras 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5).
Estadística análisis
la significación estadística de los grupos de tratamiento se evaluó mediante ANOVA de una vía seguido por un análisis post hoc de Dunnett para la comparación de grupo de tratamiento individual con el control. Los datos se expresan como medias ± SEM. Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Una probabilidad (
p
) valor de 0,05 o menos se consideró que era el criterio para una diferencia significativa.
Resultados
Efecto de fenil isocianato en la expresión génica en las células humanas
para reexaminar los resultados de la expresión génica en respuesta a los tratamientos fenil isocianato obtenidos en nuestro estudio previo de los macrófagos de ratón [12], se llevó a cabo optimizaciones de ensayo usando tres líneas celulares humanas: la línea celular de monocitos humanos THP-1 y la humana líneas de células epiteliales de colon HT-29 y SW480. Optimización incluye parámetros de inducción de la respuesta inflamatoria en las células tratadas con LPS o LPS + IFN y el rango de concentraciones PEITC no citotóxicas y las duraciones de exposición. La información no existía en la literatura sobre los efectos fenil isocianato en SW480 y células THP-1. En el estudio anterior [12], 21 genes inducidos por LPS fueron suprimidos de tres veces o más por 10 M PEO (fenil isocianato aceite esencial) en comparación con la activación de LPS solo en RAW 264,7 macrófagos de ratón. (PEO es PEITC obtiene a partir de
Barbarea verna
semillas [15] Tanto PEO y comercialmente adquirida PEITC se componen de & gt;.. 95% puro PEITC En el estudio actual con THP-1, HT-29, y SW480 células, que incluyen dos genes adicionales, MMP7 y MMP9, para un total de 23 finales genes de interés (GOI) fenil isocianato suprimida 9, células 3, y 13 de los 23 genes en células THP-1, HT-29 y SW480. , respectivamente (Tabla 3). los resultados también mostraron que las células SW480 fueron las más sensibles a la inducción de LPS cebado-IFN entre las tres líneas celulares probadas. los 13 genes regulados por el tratamiento PEITC en las células SW480 representan jugadores celulares clave en la inflamación y cáncer. por lo tanto, todos los experimentos de expresión génica posterior se llevaron a cabo utilizando estos 13 genes en las células SW480. los 10 genes que fueron seleccionados pero no fueron inducidos /expresado en las líneas celulares humanas no se discuten en este manuscrito. Después de los análisis de la expresión génica , se investigaron los cambios en las modificaciones de histonas (H3K27me3, H3K9me2, y H3-Ac) en las regiones promotoras de cada uno de estos 13 genes. Hemos observado diferenciales-H3 modificaciones respecto a los controles de sólo seis de estos 13 genes, que se discuten en detalle en el manuscrito. Todos los 13 genes, o no se observaron modificaciones H3 en sus regiones promotoras en asociación con la exposición fenil isocianato, se enumeran en la Tabla 3.
Efecto de fenil isocianato de cáncer de colon (SW480) de proliferación de células
Varios de los genes seleccionados observado que es modulada por PEITC en las células SW480 regular la proliferación celular durante la carcinogénesis (Tabla 3). Por lo tanto, se investigó si PEITC tuvo un efecto antagonista sobre la proliferación de células tumorales, encontrando que PEITC atenuada viabilidad en las células SW480 de una manera tiempo y dependiente de la concentración (Figura 1A). Curiosamente, las concentraciones PEITC y tiempos de exposición necesarios para detener la multiplicación de células de cáncer son más altos y más largo, respectivamente, de las necesarias para inducir cambios en la química de la cromatina (Figuras 3, 4, 5, S1, S2, S3, S4, S5) y el gen de expresión (figuras 2, 6, S1, S2, S3, S4, S5). Para concentraciones inferiores a 80 mM, al menos una exposición de 24 h era necesario para inducir significativamente la muerte de células de cáncer (Figura 1). Para la mayoría de los experimentos restantes (figuras 2, 3, 4 y 6), se utilizó una exposición PEITC de 5 h en o debajo de 15 mM. En las figuras 5 y S1, S2, S3, S4, S5, 10 mM PEITC se utilizó en diversos puntos temporales en las células SW480 de hasta 18 h de tiempo de exposición PEITC. Una concentración 10 mM de PEITC viabilidad celular afectado significativamente en o más allá de 24 h (Figura 1A), y un ensayo de fragmentación de ADN (figura 1B) reveló que los efectos antiproliferativos de PEITC pueden deberse a apoptóticas regulación como también se evidencia por una mayor expresión de la caspasa 3 y 8 (Figura 1C). La ausencia de cambios significativos en la proteína del ciclo celular CyclinD1 (CCND1) indica que PEITC no inhibe directamente el ciclo celular (Figura 1C).
Modulación de quimiocinas por PEITC en células de colon humano
las quimioquinas juegan un papel importante en el mantenimiento de procesos inflamatorios en el intestino grueso. La producción de quimiocinas en el intestino establece un gradiente quimiotáctico capaz de aumentar la migración de monocitos /macrófagos, granulocitos y linfocitos de la sangre a través del endotelio tanto en la mucosa y submucosa durante enfermedades crónicas inflamatorias del intestino (EII) [29]. Anteriormente, se observó que PEITC redujo la inflamación, el agotamiento de las células caliciformes, y la infiltración de células inflamatorias en la mucosa y submucosa de ratón [12]. En el presente estudio, se observó una atenuación mediada fenil isocianato dependiente de la concentración de los niveles de mRNA de cuatro quimiocinas proinflamatorias /citoquinas (CCL2, CSF2, CXCL10, y IL8) en las células SW480 (Tabla 3, Figura 2). chip experimentos individuales en estos promotores de quimioquinas reveló hiper-trimethylation de H3 en la lisina 27 (aumento de estados H3K27me3) que rodean las regiones promotoras de IL8 y CCL2 y un adicional de disminución de acetilación que rodea las regiones promotoras de IL8 asociados con 10 mM de exposición PEITC (Tablas 3- 4, las figuras 3A y 4). Sin embargo, se observó una correlación inversa dependiente del tiempo para H3K27me3 (marca represiva), pero no H3-Ac con los niveles de expresión de ARNm de IL-8 (Tabla 4, Figura S5). En el caso de CCL2, se observaron niveles de mRNA y los estados H3K27me3 a variar conjuntamente, descartando una posible relación causal (Tabla 4, Figura S4). Aunque polycomb represivo complejo 2 (PRC2) -catalyzing trimethylation H3K27 está involucrado en la reprogramación de genes de citoquinas en respuesta a estímulos inflamatorios [30], [31], la selectividad aparente de PEITC en el contexto de las modificaciones de histonas que rodean las regiones promotoras de las quimiocinas dirigidos /citoquinas nos lleva a creer que fenil isocianato es poco probable que afecte directamente la PRC2.
fenil isocianato exposición perturba factor de transcripción Actividades en células de colon humano
los NFκBs y las estadísticas son dos familias importantes de factores de transcripción activados en respuesta a una variedad de estímulos para regular múltiples procesos celulares, incluyendo la respuesta inmune y la carcinogénesis. Los NFκBs y las estadísticas tienen distintos efectos, así como aguas abajo sinérgicos sobre la inducción del gen efector [32]. El papel de NFKB en la EII [33], así como el efecto de PEITC sobre la actividad de NFkB [34], [35], [36], [37] se han estudiado bien. Aquí observamos regulación a la baja mediada por fenil isocianato de varios miembros de la familia, a saber, NFkB NFκB1, NFκBiα y proteínas REL, que no se informó previamente para células SW480 (Tabla 3, Figura 2). Curiosamente, un aumento dependiente del tiempo en el estado H3K27me3 se asoció con una disminución dependiente del tiempo en la expresión en las células expuestas NFκB1-PEITC, lo que sugiere potencial regulación epigenética de la NFκB1 que merece futuro validación (Tabla 4, las Figuras 3A, S1).