Extracto
Antecedentes
Host respuestas de células T están asociados con resultados favorables en el cáncer de ovario epitelial (EOC), pero no queda claro cuál es la mejor para promover estas respuestas en pacientes. Con este objetivo, se evaluó un panel de citoquinas clínicamente relevantes para mejorar la capacidad de múltiples funciones efectoras de las células T (polifuncionalidad) en el ambiente del tumor nativo.
Metodología /Principales conclusiones
Los experimentos se realizado con células residentes CD8 + y CD4 + T en preparaciones de células de ascitis a granel de los pacientes EOC serosos de alto grado. Las células T se estimularon con α-CD3 en presencia de fluido de ascitis autólogo 100% con o sin IL-2 exógena, IL-12, IL-18 o IL-21, solo o en combinación. la proliferación de células T (Ki-67) y la función (IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCl4, y la expresión CD107a) se evaluaron por múltiples parámetros de citometría de flujo. En paralelo, 27 citocinas se midieron en sobrenadantes de cultivo. Mientras ascitis fluido tenía efectos variables sobre CD8 + y la proliferación de células T CD4 +, se inhibió la función de las células T en la mayoría de las muestras de pacientes, con CD107a, IFN-γ, y CCL4 que muestra la mayor inhibición. Esto fue acompañado por niveles reducidos de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, bFGF y en sobrenadantes de cultivo. proliferación de células T fue realzada por IL-2 exógena, pero otras funciones de las células T eran en gran parte no afectado por las citoquinas individuales. La combinación de IL-2 con citocinas que participan vías de señalización complementarios, en particular, IL-12 e IL-18, el aumento de expresión de IFN-γ, TNF-α, y CCl4 en todas las muestras de los pacientes mediante la promoción de respuestas de células T polifuncionales. A pesar de esto, otros parámetros funcionales se mantuvieron en general inhibido.
Conclusiones /Importancia
El entorno ascitis EOC interrumpe múltiples funciones de las células T, y citoquinas exógenas que participan diversas vías de señalización única revertir parcialmente estos efectos. Nuestros resultados pueden explicar la limitada eficacia de las terapias de citoquinas por COE hasta la fecha. La restauración completa de la función de las células T requiere la activación de las vías más allá de los que se dedican por la IL-2, IL-12, IL-18 e IL-21 de señalización
Visto:. Tran E, Nielsen JS, Wick DA , Ng AV, Johnson LDS, Nesslinger NJ, et al. (2010) Las respuestas de células T polifuncional se ven perturbadas por el cáncer de ovario ascitis Medio Ambiente y sólo parcialmente restaurada por citoquinas clínicamente relevantes. PLoS ONE 5 (12): e15625. doi: 10.1371 /journal.pone.0015625
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2010; Aceptado: 19 Noviembre 2010; Publicado: December 22, 2010
Derechos de Autor © 2010 Tran et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Columbia británica del cáncer, Departamento de Defensa de los Estados Unidos, y las Ciencias Naturales y de Investigación de Canadá. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Numerosos estudios en los últimos diez años han demostrado que el sistema inmunitario influye en los resultados clínicos en pacientes con cáncer de alto grado seroso de ovario epitelial (en lo sucesivo, EOC). Específicamente, la presencia de células T CD8 + que infiltran el tumor está asociado con prolongada libre de enfermedad y supervivencia global [1], [2]. Por otra parte, los números elevados de células T CD56 + en el compartimiento de ascitis se correlacionan con una mayor sensibilidad al platino [3]. niveles Más recientemente, fluido de ascitis que contiene elevados de IL-17 (una citoquina producida predominantemente por Th17 y otras células T efectoras [4]) se correlacionó con el aumento de la supervivencia general [5]. En conjunto, estos estudios sugieren que la mejora de la respuesta de las células T endógenas a EOC puede ser de beneficio clínico a los pacientes. Sin embargo, el ambiente del tumor de ovario contiene muchos tipos de células inmunosupresores y factores que pueden oponerse a las respuestas de células T anti-tumorales. En consecuencia, los números elevados de células asociados a tumores T reguladoras (Tregs) y los macrófagos se asocian con la supervivencia pobre en EOC [1], [2]. Muchos factores inmunosupresores solubles también se encuentran en la ascitis, incluyendo IL-10, TGF-β, VEGF, B7-H1 /PD-L1, B7-H4, SDF-1, EBAG9 /RCAS1, ligando Fas, y el receptor soluble de IL-2 [1], [2].
La heterogeneidad de los mecanismos inmunosupresores en el COE presenta un reto formidable para la inmunoterapia, ya que sugiere que podrían tener que ser invertido para restaurar la función de las células T de múltiples mecanismos inmunosupresores. Por ejemplo, el agotamiento de Treg está siendo evaluado como un medio para mejorar la inmunidad contra varios cánceres humanos [6], incluyendo EOC [7], pero en el mejor de sólo invertir un mecanismo de inmunosupresión, dejando intacto otras barreras inmunológicas. En lugar de intentar desactivar estas barreras uno por uno, un enfoque clínico más pragmático sería para entregar factores que en términos generales se pueden superponer barreras inmunosupresores en el ambiente del tumor. Por lo tanto, la identificación de las señales o condiciones que promueven las respuestas de células T en el medio ambiente EOC puede dar lugar a estrategias de inmunoterapia más eficaces.
Para este fin, hemos desarrollado previamente un modelo de ratón de la EOC que permita la evaluación funcional de los linfocitos T CD8 + respuestas de las células en el ambiente del tumor de ovario [8]. En concreto, hemos diseñado una línea tumoral murino EOC para expresar un epítopo de células T CD8 + del antígeno ovoalbúmina modelo. Los ratones portadores de tumores avanzados, ampliamente difundidos con amplias ascitis fueron tratados por transferencia adoptiva de células T CD8 + específicos para el epítopo de ovoalbúmina. Notablemente, las células T CD8 + adoptivamente transferidas fueron sometidos a la proliferación vigoroso no sólo en los ganglios linfáticos y sangre periférica, sino también en las ascitis y los compartimentos tumorales. De hecho, en el pico de la respuesta, las células T transferidas constituyen hasta el 40% de las células T CD8 + en sangre periférica, y hasta 96% de las células T CD8 + en la ascitis. Esta profunda respuesta proliferativa fue seguido por regresión rápida y casi completa del tumor en la mayoría de los animales, lo que demuestra que las células T eran funcionalmente activa. Es importante destacar que la actividad de proliferación y anti-tumor de las células T CD8 + transferidos era totalmente dependiente de IL-2 /IL-15 de señalización, como se demuestra por la interrupción genética del receptor alfa de IL-2 (CD25) o beta (CD122) subunidades [ ,,,0],8]. Por lo tanto, incluso en el entorno de los tumores de ovario avanzado, las células T CD8 + montados respuestas antitumorales potentes, siempre que la IL-2 /IL-15 vías de señalización estaban intactos.
Los resultados anteriores plantearon la cuestión de si las citoquinas tales como IL-2 puede de manera similar pasar por encima de los efectos inmunosupresores de ascitis en EOC humano. Anterior
in vitro
estudios en muestras con EOC humanos han demostrado que la IL-2 puede restaurar parcialmente activadas por linfoquinas killer (LAK) citotoxicidad de las células en presencia de fluido de ascitis 50%, mientras que la combinación de IL-2 con TCR estimulación [9] o IL-12 [10], [11] totalmente restaurado citotoxicidad de LAK. Sin embargo, el uso de fluido de ascitis 50% solo no recapitular completamente el ambiente del tumor de ovario, que también contiene tipos de células inmunosupresores tales como células T reguladoras y MDSCs [1], [2]. Por otra parte, LAKS están predominantemente compuestas de células NK, que pueden verse afectados de forma diferente por ascitis en comparación con las células T. Además, estos estudios anteriores miden la citotoxicidad por preparaciones de células LAK mayor y por lo tanto no dilucidar los efectos de las citoquinas en diferentes subconjuntos de células T. Por último,
in vitro
citotoxicidad es sólo un aspecto de la función de las células T y no siempre se correlaciona con las respuestas de células T eficaces
in vivo
[12].
se reconoce cada vez más la importancia de las células T polifuncionales (es decir, las células T que pueden realizar simultáneamente múltiples funciones) en las respuestas inmunitarias eficaces [13]. Específicamente, las respuestas de células T polifuncionales están asociados con la inmunidad protectora después de la vacunación contra la viruela (virus vaccinia) [14], la fiebre amarilla [15], la tuberculosis [16], [17], y la leishmaniasis [18]. números elevados de células T polifuncionales también se correlacionan con resultados favorables en una variedad de contextos de enfermedades, incluido el VIH /SIDA [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25] , [26], [27], [28], [29], la hepatitis C [30], y la coriomeningitis linfocítica [31]. En el contexto de cáncer, varios estudios han encontrado números mejoradas de las células T polifuncionales específicos de tumores en pacientes que respondieron favorablemente a varias formas de inmunoterapia, incluyendo la terapia adoptiva de células T, la terapia con anticuerpos α-CTLA-4, y las vacunas tumorales [32] , [33], [34], [35], [36].
en el presente estudio, se evaluó por primera vez los efectos del medio ambiente ascitis EOC humana en la polifuncionalidad de células T. También se evaluó la capacidad de la IL-2 y otros tres citocinas clínicamente relevantes (IL-12, IL-18 e IL-21) para restaurar una amplia gama de funciones de las células T. Se encontró que la ascitis inhibieron las respuestas polifuncionales por tanto las células CD4 + y T CD8 +, con algunas funciones que muestra una mayor inhibición que otros. Además, sólo un subconjunto de funciones de las células T fue restaurada por citoquinas exógenas entregados solo o en combinación. Por lo tanto, la restauración completa de la función de las células T en EOC requerirá activación de las vías más allá de los que se dedican por la IL-2, IL-12, IL-18 e IL-21 de señalización.
Resultados
ascitis EOC interrumpe múltiples funciones de las células T
muestras de ascitis primarios se obtuvieron de pacientes con alto grado EOC serosa (Tabla 1). Para modelar el ambiente del tumor ascitis nativo lo más cerca posible
in vitro
, se analizaron los sedimentos celulares ascitis a granel, que además de CD8 + y las células T CD4 +, contenían células tumorales residentes, Tregs, células B, células NK, y células CD14 + (Tabla 2). Además, las células se cultivaron en el líquido de ascitis autólogo 100% para incluir los factores solubles, tales como TGF-β, IL-10, y VEGF (Tabla 2), que pueden afectar la función de células T. Debido a la escasez de antígenos de células T bien definidos en el cáncer de ovario, que cultivos estimulados con anticuerpo α-CD3, que debería estimular tanto efector y subconjuntos regulatorios. Por lo tanto, se analizaron las células T de cada paciente en presencia del complemento completo de las células tumorales de origen natural, células inmunosupresores, y factores solubles.
Recientemente hemos demostrado en un modelo murino de EOC que el medio ambiente ascitis puede ser altamente permisiva para la proliferación de células T [8]. Para ver si esto también es cierto en muestras de EOC humanos, hemos probado el efecto del líquido ascítico en la proliferación de células T. Como se ve en la Fig. 1A, fluido de ascitis tuvo efectos muy variables sobre la proliferación de células T CD8 + (medido por Ki-67 expresión), que van desde la inhibición fuerte (1/5 pacientes) a la mejora de la proliferación (2/5 pacientes). En general, se observaron tendencias similares para las células T CD4 + (datos no presentados). Por lo tanto, según lo sugerido por nuestros estudios murinos [8], el medio ambiente ascitis EOC humano no es universalmente supresora y en algunos casos puede aumentar la proliferación de células T
.
células de ascitis granel fueron estimuladas con unido placa de α-CD3 en medios de comunicación o 100% ascitis autólogas fluidos para 48 h. (A) Proliferación y función de las células T CD8 + en la presencia de medios de comunicación o fluido de ascitis autólogo (panel superior) se evaluó midiendo la expresión de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, y IL-2 por citometría de flujo. (B) Efecto de la IL-2 (segundo panel), IL-12 (tercer panel), y IL-21 (cuarto panel) sobre la proliferación de células T CD8 + y diversas funciones en la presencia de fluido de ascitis autólogo. Los datos se han normalizado a alfa-CD3 células estimuladas en los medios de comunicación (es decir, los valores medios fueron restados de cada condición de estimulación). * No hubo un efecto significativo de la citoquina para mejorar la función indicada en comparación con las células estimuladas en los medios de comunicación (Test de Wilcoxon para la prueba t, p & lt; 0,05).
A continuación se determinó si otras funciones de las células T se vieron afectados de manera similar por la ascitis de ovario. Se utilizó el análisis de citometría de flujo para evaluar cinco marcadores de uso general de la función de células T: IFN-γ, TNF-α, IL-2, CCl4, y CD107a [13], [14], [19], [20], [ ,,,0],21]. Los primeros cuatro marcadores son citoquinas implicadas en la proliferación de células T o la función efectora, mientras que CD107a se expresa en la superficie de las células T se someten a la desgranulación celular y por lo tanto sirve como un marcador de la citotoxicidad [13]. En 4/5 muestras de pacientes, fluido de ascitis causó una inhibición de la expresión dramática CD107a por las células T CD8 + (Fig. 1A), que fue acompañado de niveles reducidos de la granzima B en sobrenadantes de cultivo (Supp. Fig. S1A), indicando el medio ambiente ascitis generalmente inhibe la degranulación de células T. CCl4 y la expresión de IFN-γ también fueron inhibidos por ascitis en la mayoría de las muestras de pacientes (Fig. 1A). células T que expresan IL-2 y TNF-α eran relativamente raros, y fueron mínimamente afectados por líquido ascítico en la mayoría de los casos (Fig. 1A). Se observaron resultados similares con células T CD4 + (datos no presentados). Curiosamente, los efectos de la ascitis en la proliferación de células T y otras funciones de las células T eran en gran parte desacoplada. Por ejemplo, con muestras de pacientes y IROC008 IROC036, fluido de ascitis reforzada, tanto CD8 + y la proliferación de células T CD4 +, pero inhibió la expresión de CD107a, CCl4, y IFN-γ (Fig. 1A, y los datos no presentados). De este modo, el líquido ascítico tiene efectos muy variables en las funciones de las células T entre muestras de los pacientes, de acuerdo con la naturaleza heterogénea de la EOC.
Para caracterizar mejor los efectos de líquido ascítico en la función inmunológica, sobrenadantes de cultivo de los experimentos anteriores se evaluaron por ensayos de talón múltiplex para la expresión de un amplio panel de citoquinas asociadas con los procesos inmunológicos e inflamatorios. De 27 citocinas probadas, nueve (IL-1, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, y bFGF) fueron inhibidas por líquido ascítico en comparación con los medios de comunicación en todas las 5 muestras de pacientes (Supp. Fig. S1B). El líquido ascítico tenía efectos variables sobre las citoquinas restantes (datos no mostrados). Aunque los ensayos multiplex de cuentas no proporcionan información sobre la fuente celular (s) de citoquinas, los resultados ponen de relieve, no obstante, los efectos generales de líquido ascítico en el entorno de citoquinas en la EOC.
A pesar de una evaluación sistemática de los factores inmunosupresores miríada en EOC [1], [2], fue más allá del alcance de este estudio, hicimos investigar la posible influencia de las células T reguladoras, TGF-β, IL-10, y VEGF. El porcentaje de células T reguladoras varió de 2,5% a 6,8% de las células totales, pero no mostró correlación significativa con el grado de inhibición de la proliferación de células T, o CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, y la IL-2 de expresión; Del mismo modo, los niveles de TGF-β, IL-10, y VEGF en el líquido de ascitis no se correlacionó significativamente con el grado de inhibición de las células T (Tabla 2; correlación de Pearson p & gt; 0,05 para todas las comparaciones). Estos resultados ponen de relieve el complejo de Inmunobiología del ambiente del tumor de ovario en las que el grado de inmunosupresión no se correlacionó con estos factores inmunosupresores comunes.
citoquinas exógenas solamente restaurar parcialmente la función de las células T en el entorno de la ascitis EOC
en nuestro modelo de ratón de EOC, la señalización de IL-2 /IL-15 era crítico para la proliferación de células T CD8 + y la función en la ascitis [8]. Sin embargo, los experimentos anteriores revelaron que la gran mayoría de las células T en la ascitis EOC no expresan niveles detectables de IL-2. Esto nos llevó a especular que la adición de IL-2 a los cultivos podría restaurar la proliferación y función de las células T. Para probar esto, las células de ascitis a granel fueron estimuladas con α-CD3 en presencia de fluido de ascitis 100% con o sin IL-2 exógena, y la proliferación y función de las células T se midieron 48 h más tarde. En 4/5 muestras de los pacientes, la IL-2 invierte completamente los efectos de la ascitis en la proliferación de células T y, de hecho indujo respuestas mayores que las observadas en los medios de comunicación completa (Fig. 1B). Por el contrario, IL-2 tuvo poco efecto sobre la expresión de CD107a, CCL4, IFN-γ, o IL-2 para la mayoría de las muestras de pacientes, a pesar de que causó un aumento débil pero estadísticamente significativa de la expresión de TNF-α (Fig. 1B). Por lo tanto, la IL-2 sola mejorado la proliferación de células T, pero, en general, tuvo efectos insignificantes sobre otras funciones.
A continuación pregunta si la participación de otras vías de señalización podría propiciar una mejor función de las células T. Mientras que la IL-2 se activa principalmente la vía STAT5, la citoquina relacionada IL-12 activa la vía de STAT4, que se ha demostrado para mejorar la función de células T en diversos entornos fisiológicos [37]. Cuando se añade a cultivos de EOC, IL-12 solo no tuvo efectos menores sobre la proliferación o función de las células T CD8 + en la mayoría de las muestras de pacientes (Fig. 1B). Seguidamente, evaluó la IL-21, que predominantemente activa las vías de STAT1 y STAT3 [38]. De manera similar a IL-12, IL-21 tiene efectos modestos sobre la proliferación de células T o de la función (Fig. 1B). . En general, se observaron tendencias similares con células T CD4 + (datos no presentados)
Razonamiento que un grado más amplio de la mejora funcional podría conseguirse mediante la activación simultánea de múltiples vías de STAT, se evaluó dos combinaciones de citoquinas: a) IL-2 + IL-12, y b) IL-2 + IL-12 + IL-21. Es importante destacar que la última combinación teóricamente activar todas las vías de STAT pertinentes a las respuestas de células T CD8 + (es decir, STAT1, STAT3, STAT4, y STAT5). En general, las dos combinaciones de citoquinas inducidas proliferación de células T similar a la observada con IL-2 (compárese la Fig. 2 con la Fig. 1B). Cabe destacar sin embargo, las células T CD8 + de IROC028, que no pudo proliferar en respuesta a una sola citocina (Fig. 1B), proliferaron en respuesta a ambas combinaciones de citoquinas (Fig. 2). Además, ambas combinaciones de citoquinas fueron modestamente más eficaz que las citoquinas individuales en la mejora de IFN-γ y TNF-α de producción (Fig. 2). A pesar de esto, ni combinación de citoquinas expresión de CD107a o IL-2 (Fig. 2) mejorada. Se observaron resultados similares con células T CD4 +, a pesar de los efectos de las citoquinas fueron en general más débil (datos no mostrados). En resumen, la adición de combinaciones de citoquinas participación de una amplia gama de vías de señalización STAT no pudo restaurar completamente la función de células T en el entorno de ascitis EOC.
células de ascitis granel fueron estimuladas con unido placa de α-CD3 en medios o 100% de fluido de ascitis autólogo durante 48 h. La proliferación y la función de las células T CD8 + en presencia de medios de comunicación, fluido de ascitis autólogo (panel superior), o fluido de ascitis en presencia de IL-2 + IL-12 (panel central), o IL-2 + IL-12 + IL -21 (panel inferior) se evaluó midiendo la expresión de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, y IL-2 por citometría de flujo. Los datos se han normalizado a alfa-CD3 células estimuladas en los medios de comunicación (es decir, los valores medios fueron restados de cada condición de estimulación). * No hubo un efecto significativo de la combinación de citoquinas para mejorar la función indicada en comparación con las células estimuladas en los medios de comunicación (Test de Wilcoxon para la prueba t, p & lt; 0,05).
Finalmente, se evaluó si la activación de la no vías de señalización -stat podrían mejorar aún más la función de las células T. Con este fin, se evaluó la citoquina IL-18, que pertenece a la familia de las citocinas IL-1, activa la vía MyD88 /NFkB, y pueden mejorar directamente las respuestas de células T CD8 + en una variedad de ajustes de [39], [40] , [41]. IL-18 solo no tuvo efectos débiles sobre la proliferación y la función (Fig. 3A) de células T. Sin embargo, cuando se combina con IL-2 + IL-12, IL-18 expresión significativamente mayor de IFN-γ y, en menor medida, TNF-α (Fig. 3A). Por otra parte, la combinación de IL-2 + IL-12 + IL-18 aumentó significativamente la cantidad de IFN-γ producido en una base por célula, como se evidencia por el aumento de intensidad de fluorescencia media (MFI) (Fig. 3B, C). No obstante, la combinación de IL-2 + IL-12 + IL-18 no fue capaz de mejorar significativamente la expresión de CD107a o IL-2 (Fig. 3A) y la liberación de granzima B sólo modestamente mejorada (Supp. Fig. S2A). Del mismo modo, esta combinación no pudo restaurar la expresión de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, o bFGF en sobrenadantes de cultivo (Supp. Fig . S2B). Esta combinación, sin embargo, débilmente aumentar los niveles de IL-5 e IL-10 en los sobrenadantes de cultivo (Supp. Fig. S2C). Por lo tanto, la combinación de IL-2 + IL-12 + IL-18 restaura parcialmente la funcionalidad de las células T en el entorno de EOC.
células de ascitis granel fueron estimuladas con unido placa de α-CD3 en medios o 100% fluido ascítico autólogo durante 48 h. La proliferación y la función de las células T CD8 + en la presencia de medios de comunicación o fluido de ascitis autólogo (panel superior) se evaluó midiendo la expresión de Ki-67, CD107a, CCL4, IFN-γ, TNF-α, y IL-2 por citometría de flujo. (A) Efecto de la IL-18 (panel medio) y IL-2 + IL-12 + IL-18 (panel inferior) sobre la proliferación de células T CD8 + y diversas funciones en la presencia de fluido de ascitis. Los datos se han normalizado a alfa-CD3 células estimuladas en los medios de comunicación (es decir, los valores medios fueron restados de cada condición de estimulación). * No hubo un efecto significativo de IL-2 + IL-12 + IL-18 para mejorar la función indicada en comparación con las células estimuladas en los medios de comunicación (Test de Wilcoxon para la prueba t, p & lt; 0,05). (B) intensidad media de fluorescencia (MFI) de células positivas IFN-gamma T CD8 + se determinó mediante tinción intracelular de IFN-γ. * El efecto de la IL-2 + IL-12 + IL-18 fue significativamente mayor que las otras dos combinaciones de citoquinas (Test de Wilcoxon para la prueba t, p & lt; 0,05). (C) el flujo de Representante citometría de gráficos que demuestran el efecto de combinaciones de citoquinas en la producción de IFN-γ en una base por célula. Se muestran la media de fluorescencia de intensidad (eje Y) de la producción de IFN-γ y el porcentaje de células CD8 + que expresan IFN-γ (números). Todos los datos son para linfocitos CD8 +.
citocinas exógenos inducen nuevos perfiles polifuncional de células T
En teoría, la actividad mejorada de combinaciones de citoquinas en comparación con las citoquinas individuales podrían reflejar o bien (a ) diferentes citoquinas estimulantes distintas subpoblaciones de células T, o (b) las citoquinas que actúan sinérgicamente para inducir células T individuales para realizar múltiples funciones (es decir, la inducción de células T polifuncionales). Para investigar esta cuestión, hemos utilizado el análisis puerta de Boole para estudiar las diferentes permutaciones funcionales mostradas por las células T CD8 + y CD4 + bajo diferentes condiciones de estimulación. Como se ve en el panel superior de la figura. 4, cuando las células de ascitis a granel se estimularon en medio completo, se observaron sólo cinco permutaciones funcionales predominantes entre las células CD8 + T: (a) no funcional (es decir, la función de cero) células T (datos no mostrados); (B) las células T monofuncionales expresar CCl4 o CD107a (permutaciones 2 y 5), células de (c) bi-funcionales T que expresan tanto (d) las células T trifuncionales que expresan CD107a CD107a y CCl4 (permutación 13), y, CCL4 , y IFN-γ (permutación 24). En presencia de fluido de ascitis 100%, el número de células T no funcionales aumentó, mientras que las otras permutaciones funcionales se redujeron con la excepción de las células T que expresan monofuncionales CCL4 (Fig. 4, segundo panel). En general, la adición de citoquinas individuales no cambiar significativamente las permutaciones funcionales observados con ascitis solo, aunque IL-2 tuvo efectos débiles sobre varias permutaciones (Supp. Fig. S3). En contraste, la adición de combinaciones de citoquinas (IL-2 + IL-12 + IL-21, o IL-2 + IL-12 + IL-18) disminuyó notablemente el número de células T con cero y monofuncionales y generado tres nuevos permutaciones polifuncionales: a) CCL4 y IFN-γ (permutación 10); b) CCL4, IFN-γ, y TNF-α (permutación 17); y c) CCL4, IFN-γ, TNF-α, y CD107a (permutación 28) (Fig. 4, tercero y cuarto paneles). Se observaron tendencias similares para las células T CD4 +, aunque los efectos fueron en general más débil (datos no mostrados). Por lo tanto, estas combinaciones de citoquinas parecen actuar sinérgicamente para inducir respuestas polifuncionales por las células T individuales que en la estimulación de múltiples subpoblaciones de células T monofuncionales.
células de ascitis granel fueron estimuladas con unido placa de α-CD3 en medios o 100% líquido ascítico autólogo durante 48 h en presencia o ausencia de la combinación de citoquinas indicada. Se realizó un análisis puerta Boolean para cuantificar el número de células T que expresan cada uno de 31 posibles permutaciones funcionales. Se muestran los resultados para las células T CD8 + estimuladas en los medios de comunicación, fluido ascítico, fluido de ascitis o suplementadas con las combinaciones de citoquinas IL-2 + IL-12 + IL-21 o IL-2 + IL-12 + IL-18. La frecuencia de células T que expresan una permutación dada se expresa como un porcentaje de células T CD8 + totales. * Para la permutación indicado, el efecto de la combinación de citoquinas fue significativamente mayor que la observada con los medios de comunicación (Test de Wilcoxon para la prueba t, p & lt; 0,05).
Discusión
Mostramos aquí que el entorno de ascitis en EOC humano tiene efectos variables en CD8 + y la proliferación de células T CD4 + y, de hecho, incluso puede aumentar la proliferación en algunos casos. Por el contrario, ascitis generalmente inhibe la expresión de IFN-γ, TNF-α, CCl4, y CD107a por las células T, lo que resulta en una preponderancia de por cero o monofuncionales células T. Por otra parte, el entorno de ascitis generalmente inhibe la expresión de IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, bFGF y en sobrenadantes de cultivo. Aunque la IL-2 podría restaurar la proliferación de células T, que era en gran parte ineficaz en la mejora de otras funciones de células T, al igual que otras citoquinas de agente único (IL-12, IL-18 e IL-21). Las combinaciones de citoquinas que activan vías de señalización complementarios (en particular IL-2 + IL-12 + IL-18) fueron capaces de aumentar la expresión de IFN-γ, TNF-α, y CCL4 pero tuvo efectos insignificantes sobre otras funciones de células T. Por lo tanto, las citoquinas exógenas pueden restaurar parcialmente la función de células T en el entorno EOC humana; Sin embargo, se necesitarán estrategias alternativas para restaurar completamente la función de las células T.
Una limitación de este estudio es el tamaño de la muestra relativamente pequeña, lo que era necesario, dado el número de citoquinas y funcionales lectura de los involucrados. A pesar del tamaño pequeño de la muestra, hubo un notable grado de similitud entre los perfiles funcionales generales de las cinco muestras de pacientes, tanto al inicio del estudio y después de la estimulación de citoquinas. Esto sugiere que los diversos mecanismos inmunosupresores presentes en el cáncer de ovario podrían finalmente convergen hacia un estado funcional común de células T se rige por un conjunto conservado de señales reguladoras.
La liberación de gránulos citotóxicos es un importante mecanismo por el cual las células T las células infectadas por el virus de matar y transformadas [42]. Se encontró que el líquido ascítico inhibió fuertemente la desgranulación de las células T, y esto fue restaurada sólo parcialmente por las citoquinas exógenas (como se evidencia por modesta mejora de la liberación de granzima B). Estudios anteriores han demostrado que la combinación de IL-2 con la estimulación de TCR [9] o IL-12 [10], [11] podría restaurar completamente LAK citotoxicidad en presencia de fluido de ascitis 50%. Esta discrepancia con nuestros resultados pueden reflejar las condiciones de cultivo más exigentes que empleamos, en que las células T se ensayó en presencia de 100% líquido ascítico y un complemento completo de otros tipos celulares asociados a tumores
.
La falta de IL-2 de producción tanto por las células T CD8 + y CD4 + en estos experimentos también es consistente con una respuesta anti-tumor deteriorada. En nuestro modelo de ratón de cáncer de ovario [8], la regresión del tumor era totalmente dependiente de IL-2 /IL-15 de señalización. Del mismo modo, Gattinoni y colegas demostraron que la actividad anti-tumor de células efectoras CD8 + T capaces de potente
vitro
citotoxicidad en anti-tumor y la producción de IFN-γ, pero no IL-2 de producción, se había limitado
in vivo
, mientras que las células T que tenían bajo
in vitro
citotoxicidad, pero de alta producción de IL-2, con la mediación superiores respuestas antitumorales [12]. Como las células T CD8 + en general, pierden la capacidad de producir IL-2 en la diferenciación, el fracaso de citocinas para aumentar la producción de IL-2 sugiere que la mayoría de células T asociados a tumores pueden ser efectores terminales diferenciadas [13]. Si es así, los futuros esfuerzos deben dirigirse a aislar y amplificar las subconjuntos menos diferenciadas de células T con mayor pluripotencia.
Además de no producción de IL-2, se encontró que el fluido ascitis inhibe la expresión de numerosas otras citoquinas ( IL-1β, IL-1ra, IL-9, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, PDGF-BB, y bFGF) en sobrenadantes de cultivo. Aunque el ensayo de citoquinas multiplex hemos empleado no puede discriminar el tipo (s) celular se inhibe la producción de estas citoquinas, muchas de estas citoquinas han documentado papeles en las respuestas de células T y por lo tanto se espera que sus niveles reducidos de impactar la función de células T. En particular, IL-17 se produce por el subconjunto Th17 de las células T CD4 + en condiciones inflamatorias y se ha correlacionado con la mejora de la supervivencia global en EOC [5]. Teniendo en cuenta que la combinación de IL-2 + IL-12 + IL-18 no pudo mejorar IL-17 de producción, se necesitarán estrategias alternativas para promover esta vía efectora dentro del ambiente del tumor. Por ejemplo, IL-1β, IL-6, TGF-β, IL-23, y ICOS, han demostrado influir en la diferenciación, la expansión o la función de las células Th17 [4], [43], y por lo tanto podría ser potencialmente manipulado para promover la producción de IL-17
in vivo
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a diferencia de estos otros defectos de citoquinas, la combinación de IL-2 + IL-12 + potentemente mayor producción de IFN-γ IL-18 por células T CD8 + (Fig. 3B, C). IFN-γ juega un papel central en la inmunidad anti-tumor por la proliferación de la inhibición del tumor y la angiogénesis, y la presentación de antígenos tumor upregulating. Endógeno IFN-γ protege contra el desarrollo de tumores y, en un número de modelos de tumores, es fundamental para la inmunidad anti-tumor [44]. Por otra parte, IFN-γ y la expresión del receptor de IFN-γ, así como varios genes aguas abajo de IFN-γ, se asocian con aumento de la supervivencia en EOC humana [1]. ¿Cómo pueden IL-2, IL-12 e IL-18 mejorar cooperativamente la producción de IFN-γ? En primer lugar, estas citoquinas recíprocamente upregulate expresión de sus respectivos receptores, lo que resulta en una mayor sensibilidad de las células T a las tres citoquinas [45], [46], [47], [48]. En segundo lugar, estas citocinas pueden mediar eventos de señalización sinérgicos y complementarios [37], [49], [50]. Por ejemplo, IL-2 e IL-12 activar sinérgicamente la vía de p38 MAPK para mejorar la expresión de IFN-γ [51]. De la misma manera, IL-12 y IL-18 activan los factores de transcripción STAT4 y AP-1, respectivamente, que pueden mejorar sinérgicamente IFN-γ promotor de la actividad [52]. Por lo tanto, la activación coordinada de ambas vías de señalización STAT y no STAT parece importante para la expresión máxima de IFN-γ. Es de destacar, sin embargo, que estas señales no fueron suficientes para restaurar la expresión de muchas otras citoquinas. Esto sugiere que, en el futuro, las citoquinas distintas de IFN-γ se deben utilizar como-outs leer si se quiere optimizar la gama completa de funciones de las células T para la inmunoterapia del cáncer.
La combinación de IL-2 + IL -12+ IL-18 también indujo cambios significativos en las permutaciones de células T polifuncionales.