Extracto
metástasis óseas Antecedentes
Hasta el 80% de los pacientes que mueren de cáncer de próstata han desarrollado que son incurables. La castración se utiliza comúnmente para tratar el cáncer de próstata. Aunque la enfermedad inicialmente responde a andrógenos estrategias de bloqueo, a menudo se vuelve resistente a la castración (CRPC para el cáncer de próstata resistente a la castración). La mayoría de los modelos murinos de lesiones mixtas derivadas de células de cáncer de próstata andrógeno son sensibles. Por lo tanto, hemos establecido un nuevo modelo de CRPC (receptor de andrógenos (AR) negativo) que causa lesiones en la médula mixtos.
Métodos
PC3 y sus nuevas células PC3c clon de células derivadas se inyectan directamente en las tibias de ratones machos SCID. El crecimiento del tumor se analizó por radiografía e histología. Los efectos directos del medio condicionado de las dos líneas celulares fueron probados sobre los osteoclastos, osteoblastos y osteocitos.
Resultados
Hemos encontrado que las células inducidas PC3c lesiones mixtas 10 semanas después de la inyección intratibial.
En
in vitro
, PC3c medio condicionado fue capaz de estimular la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) -positivos osteoclastos. Osteoprotegerina (OPG) y endotelina-1 (ET1) fueron altamente expresado por PC3c mientras dikkopf-1 (DKK1) la expresión se redujo. Por último, PC3c altamente expresado ósea asociada marcadores osteopontina (OPN), Runx2, la fosfatasa alcalina (ALP), sialoproteína ósea (BSP) y produjo matriz mineralizada
en
in vitro Hoteles en condiciones osteogénicas.
Conclusiones
Hemos establecido una nueva línea celular CRPC como un sistema útil para modelar el cáncer de próstata metastásico humano que presenta el fenotipo mixto de metástasis ósea que se observa comúnmente en pacientes con cáncer de próstata con enfermedad avanzada. Este modelo ayudará a comprender los mecanismos independientes de andrógenos participan en la progresión del cáncer de próstata en el hueso y proporciona un modelo preclínico para probar los efectos de nuevos tratamientos para las metástasis óseas
Visto:. Fradet A, H Sorel, Depalle B, Serre CM, Farlay D, Turtoi A, et al. (2013) Un nuevo modelo murino de osteoblástica /osteolítica Las lesiones de cáncer de próstata andrógeno-resistente humano. PLoS ONE 8 (9): e75092. doi: 10.1371 /journal.pone.0075092
Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Junio, 2013; Aceptado: August 8, 2013; Publicado: 19 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Fradet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por el CNRS (Edith Bonnelye), Inserm, la Universidad de Lyon, "la Ligue contre le Régionale cáncer" (Isère) (EB) http://www.ligue-cancer.net/y "Asociación para la Investigación sobre les Tumeurs de la próstata (ARTP) "(Edith Bonnelye) http://www.artp.org/. Anais Fradet es apoyado por la Ligue Nationale contre le Cancer, http://www.ligue-cancer.net/Baptiste Depalle por una subvención de la región de Rhône-Alpes "Cible" del programa y Akeila Bellahcene es un investigador asociado del Fondo Nacional Superior de Investigaciones Científicas, Bélgica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Edith Bonnelye está en la lista de la revista PLoS One editores académicos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El hueso es el lugar más frecuente de metástasis de carcinoma de próstata con metástasis óseas en hasta un 80% de la enfermedad avanzada [1]. Las terapias quirúrgicas y hormonales han demostrado efectos beneficiosos sólo para la enfermedad sensible a hormonas en etapa temprana. De hecho, si la enfermedad en la mayoría de los casos responde inicialmente, a menudo progresa y se convierten en independientes de andrógenos. En esa etapa, los pacientes con enfermedad avanzada a menudo muestran lesiones osteoblásticas o mixtos en el hueso [2,3]. Los mecanismos por los que se inducen los cánceres de próstata a hacer metástasis al hueso se basan en una interacción compleja entre las células de cáncer de próstata y el microambiente de la médula [4]. El crecimiento de células de cáncer de próstata altera la remodelación ósea (formación y resorción) por factores que afectarán directamente los osteoblastos (células formadoras de hueso) y osteoclastos (células de resorción ósea) que secretan. RANKL (activador del receptor del ligando NF-kB) estimula la diferenciación y la acción osteoclastos mientras que la osteoprotegerina (OPG) actúa como un receptor señuelo para RANK (RANKL receptor). Por lo tanto el equilibrio entre RANKL y OPG, que pueden ser ambos producidos por las células de cáncer de próstata, es crítica en el control de la actividad de los osteoclastos y la osteólisis en la metástasis ósea [4-6]. Por otro lado, las moléculas pro-osteoblásticas también pueden ser producidos por las células de cáncer de próstata. De hecho, los primeros estudios clínicos que se dirigen específicamente a los osteoblastos en pacientes con cáncer de próstata metastásico se basó en la endotelina-1 (ET1), un factor mitogénico para los osteoblastos que pueden promover el crecimiento de los osteoblastos en los sitios metastásicos [7,8]. Además, factor de crecimiento transformante β (TGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) se expresan abundantemente por las células de cáncer de próstata y tienen un efecto directo sobre la función de los osteoblastos [9,10]. La vía sin alas (WNT) que está implicada en la osteoblastogénesis ha sido también implicado en el desarrollo de metástasis osteoblástica en el cáncer de próstata [11]. Sobre regulación del ligando Wnt-familia WNT1 en células de cáncer de próstata y una disminución en el suero del antagonista WNT dikkopf-1 (DKK1) expresión se ha informado en pacientes con carcinoma de próstata metastásico avanzado y se asocia con lesiones osteoblásticas [12] . Finalmente las células del cáncer de próstata que inducen metástasis ósea también expresan gran cantidad de factores asociados óseas como la osteopontina (OPN), osteocalcina (OCN) o sialoproteína ósea (BSP) secretada en la matriz ósea y que contribuirán a promocionar sus propiedades osteomimicry [13].
la mayoría de las metástasis óseas mixtos derivados de modelos de ratón de cáncer de próstata andrógeno son sensibles y para el caso en realidad no imitan la situación clínica. Hemos descrito la caracterización de una nueva línea celular (es decir, PC3c) que inducen lesiones esqueléticas mixtos en los animales que se derivan del andrógeno humano PC3 línea celular AR-negativos independiente, se sabe que induce metástasis óseas osteolíticas puras.
Materiales Métodos y
declaración de Ética
los ratones utilizados en este estudio fueron manejados de acuerdo a las reglas del Decreto N ° 87-848 du 19/10/1987, París. El protocolo experimental se han revisado y aprobado por el Comité Regional de Rhône-Alpes en la Ética de Experimentación Animal (Lyon, Francia) (Número de registro: 0121). Los experimentos con animales fueron inspeccionados de forma rutinaria por el veterinario a cargo de asegurar el cumplimiento continuado de los protocolos propuestos. Los ratones SCID, 6 semanas de edad, fueron alojados en condiciones de barrera en campanas de flujo laminar aislados. Los animales que lleven xenoinjertos tumorales fueron monitoreados cuidadosamente en busca de signos establecidos de angustia y malestar y fueron sacrificados humanitariamente.
Cultivo de células
PC3 línea celular se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA , ESTADOS UNIDOS). Las células PC3c, una línea celular subcultura de PC3 se aisló en nuestro laboratorio
in vitro
después de la cultura de la población de células individuales. En consecuencia, a la derivación espontánea de las células, que finalmente obtuvo una línea celular subcultura llamada PC3c que fue elegido en base a su fenotipo epitelial (Figura S1) [14,15]. Las células de cáncer de próstata VCAP humanos dependientes de hormonas fueron un generoso regalo de Pr M Cecchini (Departamento de Investigación Clínica, Universidad de Berna, Berna, Suiza) y se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). VCAP se cultivaron en medio RPMI. células PC3 y PC3c fueron cultivadas en forma rutinaria mezcla F12K de nutrientes y medio DMEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), complementado, respectivamente, con un 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS; Perbio /Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU. ) y 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. PC3 y PC3c también se cultivaron en condiciones osteogénicas para tres semanas en el medio de osteoblastos suplementado con 50 g de ácido ascórbico ml /(Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza). Se añadieron diez mM β-glicerofosfato de sodio (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) durante 1 semana en el final del cultivo. PC3 y PC3c eran continuamente (día 1 a día 21) se expone a condiciones osteogénicas. Para la visualización de la mineralización, los pocillos se fijan y se tiñen con Von Kossa y para ALP [16].
Los estudios en animales
Para los experimentos de xenoinjertos de tumores intra-óseos (Laboratorios Charles River, Wilmington, MA , EE.UU.), un pequeño agujero fue perforado con una aguja estéril de calibre 26 a través de la tibia derecha con la rodilla flexionada en 6 a 8 semanas de edad ratones SCID anestesiados. El uso de una aguja nueva estéril instalado en un 50-l jeringa estéril Hamilton (Hamilton Co .; Bonaduz, GR, Suiza), una suspensión de una sola célula (6x10
5 en 15-l de PBS) de las células PC3 o PC3c fue cuidadosamente inyectado en la cavidad de la médula ósea. Desde la semana 2 después de la inoculación de las células tumorales, radiografías de los ratones anestesiados fueron tomadas semanalmente con el uso de películas MIN-R2000 (Kodak, Rochester, NY, EE.UU.) en un armario del sistema de rayos X MX-20 (Faxitron X-ray Corp, Tucson , AZ, EE.UU.). Los animales fueron sacrificados después de 6 y 10 semanas para los ratones inyectados por las células PC3 y PC3c respectivamente. Microtomografía tomografía análisis se llevaron a cabo utilizando un escáner de micro-CT SkyScan 1174 (SkyScan; Kontich, Bélgica). El tubo de rayos X se fijó a una tensión de 50 kV y una corriente de 800 mu. Un filtro de aluminio 0,5 mm fue utilizado para reducir los artefactos de endurecimiento del haz. Las muestras fueron escaneadas en 70% de etanol con un tamaño voxel de 20 micras. Para cada muestra, 265 sección de imágenes se reconstruyeron con software NRecon (versión 1.6.1.8, SkyScan). modelado tridimensional y análisis de BV (volumen de hueso) /relación (Volumen Total) (porcentaje de tejido óseo) TV se obtuvieron con el CTAN (versión 1.9, SkyScan) y CTVol (versión 2.0, SkyScan) de software. Los huesos disecados fueron procesadas para análisis histológico e histomorfométrico.
inyecciones subcutáneas de células PC3c (10
6 en 100 pl de PBS) se realizaron también en de 6 a ratones SCID 8 semanas de edad. Los animales fueron sacrificados después de 12 semanas y los tumores se fijaron y se incluyeron en parafina.
histomorfometría de hueso y la histología
Tibia de los animales se fijaron, descalcificadas con EDTA 15% /0,4% PFA y embebidos en parafina. Cinco micras secciones se tiñeron con tricrómico de Goldner y procedieron para histomorfométrico analiza para calcular la TB (carga tumoral) /STV (volumen de tejido blando) relación (porcentaje de tejido tumoral). El
In situ
la detección de los osteoclastos se llevó a cabo en secciones de tejido óseo metastásico utilizando el fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) Kit de ensayo de actividad (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza).
osteoclastogénesis se obtuvieron de ensayo
células de médula ósea primaria después de la tibia y el fémur de médula lavado de ratones macho OF1 6 semanas de edad. Las células fueron cultivadas durante 7 días, en medio de diferenciación: a-MEM medio de suero que contenía 10% de ternera fetal (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), 20 ng /ml de M-CSF (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN , EE.UU.) y 200 ng /ml de RANK-L soluble recombinante en presencia o ausencia de medio acondicionado extraído de PC3 y PC3c (25μg de proteínas para cada condiciones) [17]. Medio era, en primer lugar, cambia cada dos días y luego desde el día 4 cada día. Después de 7 días, se obtuvieron y se tiñeron para la actividad TRAP (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) osteoclastos multinucleados maduros (AO), siguiendo las instrucciones del fabricante. células multinucleadas positivas para TRAP que contienen tres o más núcleos se contaron como los anticonceptivos orales.
osteoblastogénesis ensayo
Calvaria de 3 días de edad, DE-1 ratones fueron disecados a continuación, las células se aíslan por digestión enzimática secuencial con colagenasa, como se ha descrito anteriormente [18,19]. Las células obtenidas a partir de la última de cuatro de las cinco fases de digestión (poblaciones II-V) se sembraron en placas de 24 pocillos a 2x10
4 células /pocillo. Después de 24 horas de incubación, el medio incluyendo α-MEM medio que contiene suero bovino fetal 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se cambió y se suplementó con ácido ascórbico 50? G /ml (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y con o sin medio acondicionado (25μg de proteínas para cada condición) extraído de PC3 y PC3c. El medio se cambió cada dos días durante 15 días. Se añadieron 10 mM β-glicerofosfato de sodio (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) durante 1 semana en el final del cultivo. Al día 15, cuando se formaron nódulos mineralizados de hueso, las células fueron fijadas y teñidas con von Kossa para la cuantificación. ALP + y nódulos mineralizados de hueso se contaron después en una rejilla [16]. Los resultados se representan como la media del número de nódulos ± SD de tres pozos para los controles y cada condición (PC3, PC3c) y eran representativos de dos experimentos independientes. línea celular osteocitos MLO-Y4 fueron un generoso regalo de Pr L Bonewald (Facultad de Odontología de la Universidad de Missouri, Kansas City, MO, EE.UU.) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [20].
inmunocitoquímica
tumores PC3c y tibia metastásico se fijaron y se incluyeron en parafina. Cinco micras secciones fueron sometidas a inmunohistoquímica utilizando anticuerpos policlonales de conejo anticuerpo osteopontina contra el ser humano /ratón (Bachem, Bubendorf, Suiza), anti humana endotelina-1 anticuerpo (Abbiotec, San Diego, CA, EE.UU.) y anticuerpo anti OPG humana (Abbiotec, San Diego, CA, EE.UU.). anticuerpo BSP es un generoso regalo del Dr. L Malaval (Universidad de J Monnet, Saint Etienne, Francia). Las secciones se desparafinaron en methylcyclohexan, hidratado después se trataron con un reactivo de bloqueo de peroxidasa (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se incubaron con suero de ternera normal para 1 hora y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios (dilución: 1/100). Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con HRP de burro anti conejo (Amersham /GE Healthcare, Chalfont St Giles, Reino Unido) (dilución 1/300) durante 1 hora. Después del lavado, las secciones se revelaron por 3,3'-diaminobencidina (Dako, Glostrup, Dinamarca). Contratinción se realizó con hematoxilina de Mayer (Merck, Whitehouse Station, NJ, EE.UU.).
tiempo real RT-PCR
El ARN total se extrajo con el reactivo Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU. ) desde PC3, PC3c, OB, OC y las células MLO-Y4. Las muestras de ARN total (1 g) se transcrito de forma inversa usando hexámero aleatorio (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y el primer kit de síntesis de la cadena de superíndice
TM II (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Real-time RT-PCR se realizó en un módulo de Roche LightCycler (Roche, Penzberg, Alemania) con cebadores específicos para humanos y de ratón (ver Tablas S1 y S2). Real-time RT-PCR se llevó a cabo mediante el uso de SYBR Green (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con un paso inicial de 10 min a 95 ° C seguido de 40 ciclos de 20 segundos a 95 ° C, 10 seg a Tm (véanse los cuadros S1 y S2) y 10 seg a 72 ° C. Verificamos que se obtuvo un único pico para cada producto utilizando el software LightCycler de Roche. Amplimers estaban normalizados a valores L32 correspondiente. El análisis de datos se realizó mediante el método comparativo CT: en tiempo real cada replicar genes CT promedio se normalizó a la CT promedio de L32 restando el promedio de CT L32 de cada réplica para dar el Ct. Los resultados se expresan como log
-2 __CT con ΔΔCT equivalente a la Ct de los genes en PC3, PC3c o tratados OBs, OCS y células MLO-Y4 restando a la Ct del control endógeno (no tratado OB, OC y células MLO-Y4 respectivamente).
La microscopía electrónica
PC3c células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio, a continuación, fijos durante 1 hora en un 2% de glutaraldehído en 0,1 M de tampón cacodilato sódico a pH 7 0.4. Después de tres enjuagues en 0,2 M de sacarosa en 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio, las células se fijaron posteriormente en 1% tetroxyde de osmio 0,15 M en tampón de cacodilato, se deshidrataron en etanol graduado, entonces embebido en Epon. Los cortes ultrafinos fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo, la examinó bajo un microscopio electrónico JEOL 1200 EX (Jeol, Tokio, Japón).
infrarrojo por transformada de Fourier microespectroscopía (FTIRM)
secciones no descalcificadas ( 2 micras de espesor) de la tibia incrustado en MMA se cortaron longitudinalmente con una Polycut microtomo (Reichert-Jung, Leica, Alemania), y se almacena entre 2 portaobjetos de vidrio. FTIRM se realizó con un PerkinElmer GXII auto-imagen Microscopio (Norwalk, CT, EE.UU.), equipado con un detector de teluro de cadmio mercurio amplia banda de nitrógeno líquido refrigerado (7800-400 cm
-1). mediciones de infrarrojos se realizaron en la matriz ósea (en el hueso cortical) alrededor del tumor y en el propio tumor. También se recogió la medición por infrarrojos de hueso cortical de los ratones farsa. Los espectros IR se recogieron en el modo de transmisión, a los 4 cm
-1 de resolución espacial, y 40 micras x 40 micras de resolución espacial. Contribución de aire y MMA se resta de la espectro original. la corrección automática de la línea de base se realizó en cada espectro IR con el software Spectrum (PerkinElmer, Inc.).
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como media +/- SD, y se analizaron estadísticamente mediante un análisis de una vía de varianza (ANOVA) seguido de post hoc t-pruebas o test t de Student para evaluar las diferencias entre los grupos para
in vitro y Hoteles en
in vivo
estudios. La significación estadística se tomó como p. & lt; 0,05
Resultados
Expresión de factores pro-osteoblásticas por células PC3c
A partir de próstata PC3 línea celular de cáncer andrógeno-resistente humana, obtuvimos después de la cultura de la población de células individuales
in vitro
unas nuevas células PC3c nombre de líneas celulares subcultura que se eligió en base a su fenotipo epitelial (Figura S1). Como era de esperar y de manera similar a las células PC3 parentales, AR no se pudo detectar por PCR en tiempo real en PC3c mientras que se expresa en la línea celular dependiente de hormonas VCAP utilizó como control positivo (Figura 1A). Por otra parte, los marcadores de la próstata P504S (alfa metilacil-CoA racemasa (AMACR)) y la fosfatasa ácida prostática (PAP) se expresaron en ambas líneas celulares que confirman el origen de próstata de las células (Figura 1B) [21].
detección por PCR en tiempo real de la expresión del RA mRNA en PC3, PC3c y VCAP células cancerosas líneas (a), AMACR, PAP (B) y DKK1, ET-1, FGF9, Noggin, OPN, OPG, Runx2 y expresión TGF mRNA (C y D) en PC3 y PC3c células de cáncer de líneas. expresión Los genes se evaluó mediante PCR en tiempo real en muestras por triplicado y se normalizaron frente a la de la gen de la proteína ribosomal L32 * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,001, *** p & lt;. 0,0001
Caracterización por PCR en tiempo real de las células PC3c indicaron que ET1 y OPG, dos factores que han sido implicados en la patogénesis de la osteosclerótico metástasis óseas de cáncer de próstata se sobreexpresa en comparación con el PC3 línea celular parental (Figura 1C-D), mientras que otros factores tales como el factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9) y TGF se expresan de manera similar en ambas líneas celulares [8,22,23]. Por otro lado, la expresión de DKK1 y, dos inhibidores de osteoblastos (respectivamente Wnts y proteína morfogenética ósea (BMP) inhibidores) Noggin, se reduce en comparación con PC3c PC3 (Figura 1 C-D) [24,25]. Por otra parte, PC3c de manera similar a las células PC3 factores conocidos expresados a estar implicado en osteomimicry cáncer de próstata tales como OPN y Runx2. Todos juntos, estos resultados sugieren que las células PC3c pueden potencialmente inducir lesiones osteoblásticas en comparación con células PC3 que se sabe que presentan predominantemente lesiones osteolíticas en el hueso.
PC3c células inducen lesiones mixtas osteoblásticas /osteolíticas hueso
a fin de probar la propiedad de PC3c para inducir lesiones óseas, las inyecciones intra-tibiales se realizaron en ratones SCID machos. Diez semanas después de la inoculación de las células tumorales, el análisis radiográfico reveló que los animales portadores de tumores PC3c tenían lesiones óseas que incluían componentes osteolíticas y osteoblásticas (Figura 2I), mientras que se observaron lesiones osteolíticas puras en los tumores PC3 cojinete animal después de 6 semanas (Figura 2E). La capacidad de PC3 y PC3c para inducir osteolítica puro y lesiones mixtas, respectivamente, se confirmó usando 3D reconstrucción micro-CT (Figura 2F-G y JK) (volumen de hueso, BV /TV, Tabla 1), la histología (Figura 2H y L ) y los análisis histomorfométricos de tibias (carga tumoral esquelético, TB /STV; Tabla 1). Como no se observaron lesiones esqueléticas que se espera después de la inyección de PBS (animales Sham) (Figura 2A-D, Tabla 1). Por inmunohistoquímica, se confirmó,
in vivo
, que la ET-1 y OPG fueron altamente expresado en los tumores PC3c (Figura S1, B, C) en comparación con el PC3 (Figura S2, A, C).
células PC3 y PC3c (a) se inocularon en ratones SCID machos; 10 semanas después de la inoculación, la radiografía reveló lesiones osteolíticas puras en ratones inyectados con células PC3 (n = 6) (E) y lesiones mixtas en ratones inyectados con células PC3c (n = 8) (I) en comparación con los ratones inyectados con PBS (n = 10) (A) (ver * (lisis) y flechas blancas (formación)). (B, C-F, G-J, K) reconstrucciones tridimensionales micro-CT de las tibias y (D, H, L) histología después de la tinción tricrómica de Goldner confirmó los resultados de la radiografía. T: El tumor; NB:. El hueso nuevo
BV /TV (%)
TB /STV (%)
Sham (n = 10) 22,4 +/- 2,90PC3 (n = 6) 3,6 +/- 4,1 +/- 6,6 72,6 *** *** PC3c (n = 8) 39,5 +/- 3,0 *
$ 36,6 + /- 4,5 ***
$ Tabla 1. El análisis histomorfométrico de la tibia con metástasis inducidas por la inyección de células PC3 y PC3c
BV /TV: volumen de hueso /volumen total.. TB /STV: volumen de tejido carga tumoral /suave. Sham se realizaron como control.
n
es el número de patas con metástasis óseas. * P & lt; 0,05; *** P & lt; 0,001 en comparación con el tratamiento simulado;
$ P & lt; 0,001 en comparación con el PC3. Descargar CSV CSV
Remodelación ósea estimulación por células PC3c
Ante estos datos, próxima pregunta si PC3c podría alterar el hueso células que reabsorben, los osteoclastos (AO) y la formación de células óseas, los osteoblastos (OB) . El tratamiento de células de médula ósea de ratón primario con RANKL, el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y con el medio de PC3c acondicionado estimulado más la formación de la fosfatasa tartrato resistente a los ácidos (TRAP) OC multinucleadas positivas a en comparación con la observada con el medio acondicionado de las células PC3 y las células no tratadas (Ct) (Figura 3A). Por otro lado, el tratamiento de células de calvaria de ratón primario cultivadas en condiciones osteogénicas con el medio de PC3c acondicionado tenía efecto inhibidor sobre la diferenciación menos OB de medio de células PC3 en comparación con células no tratadas (Ct) (Figura 3B) acondicionado. De hecho, un alto número de OB se visualizan mediante inmunotinción de OPN
in vivo gratis (Figura 4A a-b). Curiosamente, medio acondicionado PC3 estimulada OPG y RANKL expresión por OBs primarios mientras que el medio acondicionado PC3c disminución de la producción de OPG que conduce a un aumento más fuerte de la relación de RANKL /OPG por OBs tratados con medio PC3c acondicionado en comparación con la de las células PC3 (Figura 3C). En consonancia con estos
in vitro
resultados en, la tinción TRAP de secciones de tibia de patas metastásicas de los animales que llevan PC3c mostraron alto número de anticonceptivos orales multinucleadas TRAP positivas en comparación con la observada en PC3 y animales Sham (Figura S3). Por último, semi-PCR cuantitativa a cabo en la línea celular de osteocitos, MLO-Y4, permitido mostrar que esclerostina (SOST) y la matriz de dentina fosfoproteína ácida 1 (DMP1) expresión fue estimulada después de 24 horas de tratamiento con PC3 y medio PC3c acondicionado, respectivamente, mientras OPG y RANKL expresión no se vio afectada (Figura 3D)
.
células de médula ósea de ratón primaria (a) se cultivaron en presencia de RANKL y M-CSF y se tratan o no (Ct) con medio condicionado obtenido de PC3 y células PC3c. Más anticonceptivos orales (flecha blanca) se formaron en los cultivos tratados con medio acondicionado PC3c en comparación con los cultivos tratados con medio acondicionado PC3 y Ct (ANOVA, p & lt; 0,0001). (B) los cultivos celulares de la bóveda craneal de ratón primaria fueron tratados desde el primer día 1-21 con medio condicionado procedente de células PC3 y PC3c. nódulos óseos mineralizados estaban presentes y se visualizaron mediante tinción de von Kossa en el día 21 (ver mineral en blanco y negro, flechas). la formación de nódulos hueso mineralizado se redujo cuando las células primarias fueron tratadas con medio condicionado de cualquiera de las células PC3 /PC3c (en comparación con células no tratadas (Ct)); la disminución fue menos cuando se utilizó célula PC3c medio acondicionado (en comparación con PC3) (ANOVA, p & lt; 0,001 frente a Ct y frente PC3). (C) PC3 acondicionado medios estimularon la expresión de OPG y RANKL en OBs primaria en comparación con la no tratada (Ct), mientras que PC3c medio acondicionado sólo inhibe la expresión de OPG en comparación con Ct que conduce a una mayor relación RANKL /OPG en condiciones PC3c. (D) Detección por PCR en tiempo real de SOST, DMP1, OPG y RANKL expresión de ARNm en las células MLO-Y4 tratados con PC3 y medio PC3c acondicionado. Los resultados se representan como la media del número de OC ± SD nódulos y OB ± SD de tres pozos para los controles y cada condición y son representativos de dos experimentos independientes. expresión Los genes se evaluó mediante PCR en tiempo real en muestras por triplicado y se normalizaron frente a la de la gen de la proteína ribosomal L32 * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,001, *** p & lt;.
0,0001
(A) La inmunodetección de OPN en el OB en las metástasis ósea inducida por las células PC3c (VER OBS A y B aumentos de a; véase flechas negras) (a) y en células de tumores (B a). De manera similar a OPN, se detectó la expresión BSP en los tumores de células
en
in vivo gratis (B, b). (C) De manera similar a las células de calvaria de ratón primarios, PC3 y PC3c se cultivaron en condiciones osteogénicas para 21 días. ALP (a, c) y tinción de von Kossa (b, d) muestran una alta expresión de ALP (c) y la mineralización (flecha blanca) (d) en las células PC3c mientras que ninguna expresión de ALP (a) y la mineralización se detectaron en las células PC3 ( segundo). (D) La detección por PCR en tiempo real de OPN, ALP y la expresión de mRNA OCN en PC3c y células PC3 cultivadas en condiciones osteogénicas durante 21 días. La expresión génica se evaluó mediante PCR en tiempo real en muestras por triplicado y se normalizaron frente a la de la ribosomal L32 gen de la proteína ** p & lt; 0,001. Barra = 200μm T: Tumor; OB: los osteoblastos; NB:. Células de hueso nuevo
PC3c inducen fuertes reacciones osteoblásticas sobre las condiciones osteogénicas
Dado que las células inducidas PC3c nueva formación ósea
in vivo
, próximo a prueba si podría producir marcadores Obs. Después se encontraron inmunotinción de secciones de tejido metastásicas óseas, OPN y BSP se expresa en células PC3c
in situ
(Figura 4B a y b). Por otra parte después de 3 semanas de cultivo,
in vitro
, las condiciones osteogénicas incluyendo el ácido ascórbico y β-glicerofosfato (figura 4C B y D), las células PC3c resultaron ser la fosfatasa alcalina (ALP) -positivo (Fig 4CC ) y fueron capaces de formar una matriz calcificada positivo para la tinción de von Kossa (Fig 4C d), mientras que PC3 eran ALP-negativa y no indujo la mineralización de la matriz (Figura 4C a y b). La expresión de ALP después de tratamiento con ácido ascórbico se confirmó en células PC3c por PCR en tiempo real (Figura 4D). Del mismo modo, OPN fue altamente expresado en PC3c comparación con las células PC3 mientras OCN fue expresada por ambas líneas de células bajo estas condiciones experimentales (Figura 4D), lo que sugiere propiedad de alta osteomimicry de PC3c comparación con las células PC3. Finalmente, Fourier Transform estudio InfraRed microespectroscopía (FTIRM) sobre los tumores obtenidos después de la inyección subcutánea de células PC3c reveló la presencia de amidas I (principalmente C = O estiramiento) y II (principalmente NH flexión) y III (principalmente CN estiramiento y NH de flexión) grupos de proteínas (Figura S4, ver I y II línea roja) que por lo general corresponde a la matriz orgánica (90% de colágeno tipo I) en el hueso (Figura S4, ver la línea azul y negro). No se encontraron fosfato o carbonato vibraciones moleculares, lo que indica la ausencia de minerales dentro del tumor PC3c
in vivo gratis (figura S4). Por otro lado, la matriz de hueso nuevo obtenido de ratones inyectados con células tibia PC3c mostró la presencia de mineral (figura S4). Concomitantemente a estos resultado, se encontró alta cantidad de colágeno tipo I que se expresa por PC3c en comparación con células PC3 por PCR en tiempo real
in vitro
(Figura 5A). Además, las células PC3c se muestra rodeado por tipo típico de las fibras de colágeno I
In situ
a juzgar por microscopía electrónica (Figura 5B ver flechas y un aumento mayor). En conjunto, estos datos sugieren mayores propiedades osteomimicry para PC3c en comparación con las células PC3, lo que explica al menos en parte, de su capacidad para inducir lesiones mixtas osteoblásticas /osteolíticas del hueso.
(A) Detección por PCR en tiempo real de colágeno de tipo I mRNA expresión en PC3c y células PC3 cultivadas en condiciones normales. La expresión génica se evaluó mediante PCR en tiempo real en muestras por triplicado y se normalizaron frente a la de la proteína ribosomal L32 * gen p & lt; 0,05. (B) La visualización de colágeno tipo I en las células cultivadas en PC3c cubreobjetos por microscopía electrónica (ver flechas negras).
Discusión
En este estudio, se han establecido y caracterizado una nueva línea de células andrógeno-independiente del cáncer de próstata (PC3c) que da rápidamente lesiones óseas mixtos en ratones SCID machos, 10 semanas después de la inyección células tumorales intra-tibial. Este modelo puede ser útil para estudiar los mecanismos celulares y moleculares que difieren entre los carcinomas de próstata andrógeno-dependientes e independientes de andrógenos cuando se metastatizan al hueso. En el cáncer de próstata, las estrategias de bloqueo androgénico se utilizan generalmente para el tratamiento de las metástasis óseas osteoblásticas. Sin embargo, las respuestas a estas terapias son a menudo breves, debido a modificaciones o mutaciones de AR postraduccionales que reducen la unión del ligando e inevitablemente conducen a la CRPC [26,27]. El papel de la vía de AR en la progresión del cáncer de próstata osteoblástica es poco conocida ya que los modelos disponibles de lesiones osteoblásticas mixtos y puros (C4-2B, PCa2B, VCAP) son principalmente los andrógenos sensibles como [28,29]. En consecuencia, se cree una vía de AR activa a estar implicados en la progresión del cáncer de próstata osteoblásticas. Sin embargo, en relación con nuestro modelo PC3c, este supuesto no se produce ya que ambas líneas celulares y células PC3 PC3c líneas no expresan AR. Por otro lado, los modelos negativos AR usan comúnmente como células PC3 y DU145 que deriva de pacientes CRPC inducidas lesiones osteolíticas pura y no reproduce lo que se observa en la clínica [30,31]. Entonces, a fin de satisfacer la necesidad de modelos clínicamente relevantes de las lesiones óseas asociadas con el cáncer de próstata, los modelos más recientes hormona independiente se han desarrollado como MDA PCa 118 y Ace-1 que al igual que el modelo PC3c no expresan AR e inducir mixto lesiones [22,32]. Sin embargo, la osteogénesis que fue inducida por FGF-9 en el modelo MDA PCa 118 no estaba implicado en la respuesta osteoblástica inducida por PC3c como FGF-9 expresión no fue estadísticamente significativamente modulada entre las células PC3 y PC3c.
Curiosamente, cuando se compara con PC3, las células PC3c altamente expresado ET-1, un factor mitogénico para OB [33,34].