Extracto
En determinados tipos de células como los queratinocitos, señalización Notch desempeña un importante pro-diferenciación y supresor de tumores función, con abajo de la modulación del gen Notch1 estando asociado con el desarrollo del cáncer. Además de ser controlada por p53, poco se sabe sobre la regulación de la expresión génica Notch1 en este contexto. Presentamos aquí que la transcripción de este gen es accionado por un TATA-menos promotor "pico agudo" y que la región funcional mínima de este promotor, que se extiende desde la posición -342 pb del codón de iniciación, es diferencialmente activo en normales frente a cáncer Células. Esta región rica en GC carece de sitios de unión de p53, pero se une Klf4 y SP3. Este hallazgo es probable que sea de importancia biológica, como Klf4 y, en menor medida, Sp3 están regulados en un número de células cancerosas donde la expresión Notch1 está abajo modulada, y Klf4 sobre-expresión en las células normales es suficiente para bajar -modulate la transcripción de genes Notch1. El derribo combinado de Klf4 y SP3 era necesaria para el efecto de aumentar la transcripción inversa Notch 1, en consonancia con los dos factores que ejerce una función represora superposición a través de su unión al promotor Notch1
Visto:. Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) diferencial de control de la transcripción del gen Notch 1 por Klf4 y SP3 factores de transcripción en queratinocitos normales frente Derivado-cáncer. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10.1371 /journal.pone.0010369
Editor: Joanna María Bridger, Brunel University, Reino Unido
Recibido: 24 Noviembre 2009; Aceptado: March 22, 2010; Publicado: 28 de abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Lambertini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Suiza, una subvención de la Unión Europea (Epistem, Sexto Programa Marco, LSHB-CT-2005 hasta 019067), y los NIH subvenciones AR39190 y AR054856 y para GPD Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Estos dispositivos juegan un papel clave en el control de la determinación del destino celular, crecimiento y diferenciación [1], [2]. También es un factor determinante de la carcinogénesis, ya sea con un papel positivo o negativo en función del tipo de célula y el contexto específico [3], [4]. La mejor caracterizada vía "canónica" de la activación Notch implica la escisión proteolítica y la translocación del dominio citoplásmico del receptor al núcleo, donde se asocia con el CSL proteína de unión a ADN convirtiéndolo de un represor en un activador de la transcripción [1], [ ,,,0],2]. se ha dado más atención al control de la vía de Notch en el nivel post-transcripcional, incluyendo el procesamiento y maduración de los receptores Notch, la activación por ligandos en la superficie celular, y la modificación de proteínas y la degradación de [1], [2]. Sin embargo, una forma principal de la regulación también puede ser a nivel de la transcripción génica. La expresión de los cuatro genes de los receptores Notch y sus ligandos se regula en contextos celulares específicos y puede ser modificada en el desarrollo del cáncer [3], [5]. Además, la activación de un receptor es susceptible de afectar a su propia expresión, así como de otros miembros de la familia, y también puede afectar, de una manera positiva o negativa, en la expresión de ligando [1], [2].
un ejemplo de este complejo modo de regulación de la expresión de Notch ha sido proporcionada por los estudios en los queratinocitos, donde esta vía desempeña un papel clave en la promoción de la diferenciación y la supresión de la tumorigénesis [3]. En la capa basal de la epidermis, se ha propuesto la regulación negativa recíproca entre los ligandos de la familia Delta y receptores Notch para controlar el equilibrio entre poblaciones de células madre de queratinocitos putativo y las células comprometidas con la diferenciación [6]. Por otro lado, la regulación de retroalimentación positiva entre los receptores Notch y ligandos de la familia Jagged ha sido implicado como un posible mecanismo para la sincronización de la transición de los queratinocitos de la proliferación basal de suprabasal diferenciadores capas de la epidermis [7]. Mientras tanto los receptores Notch1 y NOTCH2 se expresan en la epidermis interfollicular, su regulación y función sólo se superponen parcialmente. En particular, mientras que los niveles NOTCH2 se elevan de manera uniforme en las capas de diferenciación de la epidermis, la expresión de Notch1 se apaga en las capas más externas [7]. Esto puede ser de importancia funcional, ya que la actividad Notch1 elevada, mientras que se requiere para el compromiso y la entrada en la diferenciación, a continuación, puede suprimir los últimos pasos de este proceso [7], [8]. Del mismo modo, en los tumores de queratinocitos derivados, como los carcinomas de células escamosas (CCE), carcinomas de células basales (BCC) [9], [10] y de la etapa tardía carcinomas cervicales [11], la expresión de Notch1 se reduce en un grado sustancialmente mayor que Notch2 . Esto es de importancia funcional de probabilidades que, incluso en la presencia de Notch2, la deleción del gen Notch1 es por sí misma suficiente para promover el desarrollo de tumores de queratinocitos [9], [11], [12].
Sorprendentemente poco es saber sobre el control de la expresión génica Notch1. En los queratinocitos, p53 endógeno se une al promotor Notch1, aumentando su transcripción, y la función de p53 comprometida puede explicar, al menos en parte, la baja modulación asociado a un tumor de la expresión de Notch1 [9], [13], [14]. Del mismo modo, la disminución de los niveles de p53 a través de la degradación de E6 dependiente viral puede explicar la ya mencionada baja regulación de la expresión de Notch1 en células de carcinoma cervical por VPH-positivo [14]. Control de la expresión de Notch1 por p53 es también pertinente a la respuesta de los queratinocitos a la luz UV, un agente etiológico importante de envejecimiento de la piel y el cáncer [13], [14]. Además de los queratinocitos, y sus homólogos malignos, la expresión de Notch1 está bajo control p53 positiva en células de cáncer de pulmón y de próstata, otros tipos de células en el que aumentaron Notch de señalización causas supresión del crecimiento [15], así como en células de leucemia linfocítica crónica de células B, donde la señalización de Notch mejora la supervivencia de las células [16]. En muchos de estos casos, se encontró que p53 de estar involucrados específicamente en el control del gen Notch1 con poco o ningún efecto sobre otros miembros de la familia [9], [14], [15]. Curiosamente, no tal regulación se encuentra en las células de carcinoma de colon, a pesar de la unión de p53 al promotor Notch1 incluso en estas células, que apunta a la probable interacción entre p53 y otra como determinantes aún no identificados de Notch1 la transcripción de genes [9].
La familia Sp /KLF de factores de transcripción consiste en proteínas con tres dominios de dedo de cinc de unión al ADN muy conservadas, que reconocen cajas CACCC GC /presentes en muchos promotores ricas en GC [17]. Estos factores juegan un papel importante en la transcripción de los genes de limpieza, así como genes con funciones más restringidas tipo específico de célula [18]. Entre los miembros de la familia Klf, Klf4 ha atraído recientemente la atención debido a su capacidad, en concierto con otros factores, para reprogramar la determinación del destino celular [19], así como promover o suprimir el desarrollo de cáncer en una forma dependiente de contexto [20]. Presentamos aquí que en los queratinocitos Klf4 se une al promotor Notch1 y, junto con Sp3, funciona como un regulador negativo de la transcripción de genes Notch1, afectar el reclutamiento del complejo de preiniciación PolII través de un mecanismo independiente de p53. La inhibición de la expresión de Notch1 por Klf4 es consistente con el papel esencial de Klf4 en las últimas etapas de la diferenciación de queratinocitos [21], para el que la expresión del gen Notch1 necesita ser desactivado [7]. Sin embargo, el mismo mecanismo de regulación también puede contribuir a la regulación negativa de la expresión de Notch1 en los tumores de queratinocitos derivados, donde Klf4 puede ser sobre-expresado de forma aberrante.
: Resultados de la
1. La transcripción del gen Notch 1 a partir de un "pico agudo 'TATA promotor sin
Además de la implicación de p53 [9], [13], [14], [22], poco se sabe sobre el control de la transcripción del gen Notch 1 . El gen Notch1 humano está localizado en el cromosoma 9 y estructurado en 34 exones, que codifican para una proteína grande de aproximadamente 270 kDa. Para más conocimientos sobre el control transcripcional de este gen, comparamos su secuencia no codificante aguas arriba en el ser humano en comparación con los genomas del ratón. Varios sitios de unión de p53 predicho están presentes en las 3,0 kb de secuencia aguas arriba del ratón y promotores Notch1 humanos, aunque en diferentes posiciones con respecto al codón de iniciación (Fig. 1A). Un gradiente creciente de homología de secuencia se encontró hacia los codones de iniciación humanos y de ratón, con & gt; 70% de identidad de secuencia en el dominio rico en GC desde la posición -500 pb hasta el ATG. El análisis de nucleótidos señaló además a un sitio de unión de TFIID-putativa alrededor de la posición -230 pb rodeado por elementos centrales distales, mientras que no hay cajas TATA pudieron ser identificados (utilizando los programas TESS, consite o Genomatix; www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /Tess /Tess; asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite;. www.genomatix.de) (figura 1B)
(A) comparación de la secuencia de nucleótidos de la 3.0. kb región aguas arriba de los genes de ratón Notch1 humana y, con el aumento de la homología hacia la región de codificación ilustrado por un gradiente de intensidad de gris. La posición de los sitios de unión a p53 putativo, como se predijo por un programa de bioinformática (MatInspector, http://www.genomatix.de) se indica, en relación con el codón de iniciación. "Canónicos" sitios de unión de p53 se componen de dos sitios con la mitad de la secuencia de nucleótidos RRRCA /T-T /AGYYY (con R = purina; y Y = pirimidina), separadas por un espaciador de 0-21 nucleótidos. Cuartos de sitios (RRRCW y WGYYY) pueden estar presentes en un mano a mano, o la cabeza con cola, como indican las flechas (→ o ←). Los números por encima y por debajo se refieren a la puntuación de coincidencia entre la secuencia de nucleótidos de cada sitio y la matriz se predijo, con una perfecta coincidencia = 1,00, y un "buen" partido de & gt; 0,80. (B) los elementos básicos promotor del gen Notch 1 humana con una indicación de la región proximal rica en GC, putativo sitio de TFIID unión y elementos básicos distales (DCE) [53] (identificados por el programa TESS) y Notch1 sitios de inicio de la transcripción ( TSS). (C) Determinación experimental de la Notch1 TSS por 5 'RACE. queratinocitos primarios humanos se utilizaron como fuente de ARN total para la amplificación de 5 'RACE usando GeneRacer y un cebador inverso específico situado en 242 pb desde el codón de iniciación. La clonación y secuenciación del producto de reacción de amplificación (tal como se muestra después de la electroforesis en gel) apuntaban a una importante TSS en la posición -262 y un segundo en la posición -259. La secuencia de la superposición de elementos de iniciador (Py Py Un (1) NT (3) Py Py), en nuestro caso TCA (1) CT (3) AG para la importante TSS, y CTA (1) GT ( 3) GC para el segundo TSS, se indica en negrita, mientras que los primeros nucleótidos de los dos TSS están en cursiva.
para establecer experimentalmente el sitio de inicio de transcripción (TSS) de la transcripción en Notch1 queratinocitos humanos primarios (HKC), se clonaron y secuenciaron los productos de 5'-RACE (amplificación rápida de ADN complementario extremos 5 ') reacción de estas células (Fig. 1C). Los resultados apuntan a una TSS principal del gen Notch 1 humana en la posición -262 pb desde el ATG, con un segundo TSS menor en -259 pb. Por lo tanto, la transcripción del gen Notch1 es impulsado por un promotor isla CpG, que, a diferencia de la mayoría de los promotores de esta clase [23], tiene las características de un promotor 'pico agudo', con TSSs precisa probablemente determinada por un iniciador de solapamiento (Inr) elemento [24].
2. Cartografía de la región promotora funcional en Notch1 normal de la expresión del ARNm frente a las células cancerosas
puede ser controlado en múltiples niveles, desde los primeros pasos de la transcripción (inicio /alargamiento) hasta el procesamiento del ARN y la estabilidad [25]. en tiempo real el análisis RT-PCR con cebadores específicos para los extremos 5 'y 3' de la transcripción Notch1 y el primer intrón mostró que la mayor expresión de Notch1 mRNA informó previamente en HKC frente a las células de cáncer de queratinocitos derivados de [9], [11] era mantenido con independencia de las regiones específicas de la transcripción Notch1 que fueron analizados (Fig. 2).
(A) Organización del gen Notch1, con una indicación de la fase de lectura abierta (ORF) con codificación de exones e intervenir intrones (cajas negras gruesas y líneas, respectivamente) y 5 'y 3' regiones no traducidas (UTR). La posición de los diferentes conjuntos de cebadores utilizados para análisis en tiempo real RT-PCR también se indica (flechas finas). (B) El ARN total de queratinocitos primarios humanos (HKC), células de carcinoma de cuello uterino (HeLa, Caski y SiHa), y la piel (SCC13) y células orales (SCCO28) escamosas de carcinoma fue analizada por tiempo real RT-PCR con cebadores correspondientes a diferente región del gen Notch1 como se indica en (a). Por esta y todas las demás figuras, los valores se normalizaron a 36B4 y /o los niveles de 18S RNA, y se expresaron como relación con los de los queratinocitos primarios.
Estos resultados sugieren que la transcripción del gen Notch1 es diferencialmente controlada en normales frente a células cancerosas que ya están en las etapas iniciales de la transcripción. A fin de probar esta posibilidad, se determinó la región funcional mínima del promotor de Notch1 y evaluó si tal región es diferencialmente activo en normales frente a células cancerosas. Para este propósito, la región de 2,4 kb del promotor de Notch1 aguas arriba del codón de iniciación se clonó en un indicador de luciferasa, seguido por ensayos de actividad de promotor en HKCS frente a las células HeLa. Prueba de una serie de fragmentos con reducido progresivamente longitud desde el extremo 5 'mostró que una región de 342 pb desde el codón de iniciación retiene la actividad del promotor completo en HKCS, mientras que más de acortamiento del promotor Notch1 a las regiones -315 pb y -300 pb dio como resultado progresivamente reducción de la actividad (Fig. 3A). regiones promotoras Notch1 con plena actividad en HKCS fueron significativamente menos activa en las células HeLa, lo que refleja las diferencias en la transcripción de genes endógenos Notch1, mientras que la diferencia en la actividad del promotor se hizo menos con más cortos fragmentos de promotor Notch1 (Fig. 3A).
(a) los diferentes fragmentos del promotor Notch1 humano con la disminución de extremos 5 'se clonaron en un plásmido informador de luciferasa, seguido por transfección transitoria en queratinocitos humanos primarios y células HeLa (barras de color negro y gris, respectivamente) junto con un reportero mínimo Renilla para la normalización . La actividad del promotor se midió 48 horas después de la transfección. actividad relativa promotor de los diversos reporteros en HKC frente HeLa también se calculó (tabla derecha). (B) Los fragmentos del promotor Notch1 humana con una deleción parcial o total de la secuencia de la SAT para el codón de iniciación (que carece de los nucleótidos -159 a -1, y -262 a -1, respectivamente) fueron clonados en un plásmido informador de luciferasa, seguido de ensayos de transfección /actividad promotora transitorios en queratinocitos humanos primarios y células HeLa como en el panel anterior. promotor de la actividad relativa en comparación con HKC HeLa también se calculó. (C) El ARN total de queratinocitos primarios y varias líneas de células cancerosas, incluyendo PC3, Caski, y HeLa de dos fuentes diferentes (HeLa#1 y 2), se utilizó para la amplificación por RT-PCR de la región 5 'UTR de la Notch 1 gen (posición cebador -262 /-174). Nota de la banda que migra más rápido obtenido con las muestras HeLa. La clonación y secuenciación de la región genómica de solapamiento (desde la posición -392 pb a -1 del promotor de Notch1) mostraron una deleción de la posición -215 a -202 en células HeLa. (D) La misma región genómica Notch1 más /menos la eliminación anterior se clonó en un plásmido informador de luciferasa, seguido por ensayos de actividad de promotor en HKC frente a las células HeLa, medido como en (A) y (B).
las secuencias de nucleótidos aguas abajo de los sitios de inicio de transcripción (TSS) desempeñan también un papel importante en el control de la actividad promotora, siendo requerido para la formación de la transcripción antes de la iniciación y de iniciación de complejos de [26]. En consonancia con la importancia de esta región, la actividad del promotor se redujo sustancialmente cuando fue borrado parcial o totalmente la secuencia del promotor Notch1 abajo de la SAT para el codón de iniciación (de -262 a -1) (con el promotor de construcciones que carecen de los nucleótidos -159 a -1 y -262 a -1, respectivamente) (Fig. 3B). Incluso en este caso, intrínsecamente disminución de la actividad del promotor fue acompañado por una diferencia menor entre las células normales y cancerosas (Fig. 3B).
amplificación por PCR de ADN genómico, el objetivo de la evaluación de su estado de metilación, como se muestra más adelante, reveló la existencia de una pequeña deleción en la región promotora Notch1 de dos cepas diferentes de células HeLa, que no estaba presente en otras células de cáncer como PC3 y Caski (Fig. 3C). Al clonar y secuenciar esta región, estudiamos la supresión de la posición -215 a -202 pb, justo abajo de la SAT. Funcionales ensayos de actividad promotora del promotor de la región promotora clonada en HKC frente a las células HeLa mostraron que esta deleción de 10 nucleótidos no afectó a la actividad del promotor ni su regulación diferencial en normales frente a células cancerosas (Fig. 3D).
3. Control negativo de Notch1 la transcripción de genes por Klf4 y Sp3
La actividad de transcripción diferencial de la región proximal rica en GC del promotor Notch1 puede estar vinculado a un estado de metilación diferente en HKCS frente a las células HeLa. Tire hacia abajo ensayos con anticuerpos contra el ADN metilado seguido de la amplificación por PCR apuntado a un nivel sustancial de metilación de la primera región intrónica (entre los nucleótidos + 1168 /+ 1798) en células HeLa pero no en HKCS, lo que podría contribuir a la diferente transcripción del Notch1 gen (Fig. 4A). Sin embargo, no metilación detectable se encontró en la región promotora Notch1 que puede dar cuenta de sus diferentes niveles de actividad en las dos células. Otra posibilidad es que el diferencial de la actividad del promotor Notch1 está ligado a factores de transcripción que se unen a esta región y controlar su actividad. Los factores de transcripción con la más alta probabilidad de obligar a GC dominios ricos como el que se presente en la región proximal del promotor Notch1 son proteínas de dedos de zinc de las familias y SP- KLF [27]. Uno o más de estos factores pueden ser expresadas diferencialmente en normales frente a células cancerosas. De hecho, el tiempo real de RT-PCR de HKCS frente a un panel de carcinoma de cuello uterino y SCC células de queratinocitos derivados mostró que, de los varios miembros de la familia Sp /KLF que se examinaron, Klf4 era firme y constantemente hasta reguladas en las células cancerosas (Fig . 4B). SP1 y SP3 también fueron hasta reguladas en estas células, aunque en menor medida que Klf4, mientras que la expresión de otros miembros de la familia, como KLF5 o KLF10a fue sólo ligeramente afectada y /o hacia abajo modulada (Fig. 4B). Se observaron diferencias menores en el nivel de proteínas, probablemente como resultado de eventos de desestabilización post-transcripcional y /o proteína (Fig. 4C).
(A) Nuclear extractos de queratinocitos primarios humanos (HKC) y células HeLa se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra ADN metilado, seguido por análisis de PCR del ADN precipitado con cebadores específicos para las regiones indicadas del promotor Notch1 y primera región intrónica. PCR con cebadores específicos para un gen metilado conocido se utilizó como control positivo. muestras (B) ARN total de queratinocitos primarios humanos (HKC) y las líneas celulares de cáncer indicados fueron analizados por tiempo real RT-PCR con cebadores específicos para Sp1, Sp3, Klf4, KLF5 y KLF10a. queratinocitos primarios, células HeLa y SCC13 (C) se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos contra Sp1, Sp3 y Klf4, con β-actina como control de carga igual.
Para evaluar las consecuencias funcionales de la expresión aumentada Klf4 Notch1 en la transcripción, se llevaron a cabo dos enfoques complementarios. En el primero, HKCS fueron transfectadas transitoriamente con un reportero Notch1; la actividad del promotor fue suprimida por transfección concomitante con un vector de expresión Klf4 (Fig. 5A). Como un segundo enfoque, HKC estaban infectados con un retrovirus que expresan Klf4. en tiempo real RT-PCR así como análisis de inmunotransferencia mostraron que la expresión endógena Notch1 se redujo significativamente en estas células como consecuencia de Klf4 la sobre expresión (Fig. 5B, C).
(A) queratinocitos primarios fueron co transfectadas con un reportero que contiene el promotor Notch1 funcional mínima (de -392pGL4) junto con un vector de expresión para Klf4 humano o control de vector vacío. Renilla mínimo reportero se utilizó para la normalización interna, y la actividad del promotor se midió 48 horas después de la transfección. Se muestran los resultados de dos experimentos diferentes. (B) queratinocitos primarios se infectaron con un vector retroviral que expresa KlfF4 (pMSKlf4) o un control de vector vacío y se recogieron después de 48 horas, seguido de la determinación de la expresión de mRNA Klf4 y Notch1 por PCR en tiempo real. La eficiencia de la infección con el virus pMSKlf4 también se evaluó por los cambios morfológicos generalizadas con aplanamiento de las células (paneles superiores). (C) los queratinocitos primarios se infectan con un retrovirus que expresa KlfF4 frente a un control de vector vacío como en el panel anterior, seguido de análisis de inmunotransferencia con anticuerpos contra Notch1, Klf4 y γ-tubulina como control de carga igual. Panel derecho: los datos se cuantificaron por densitometría de la autorradiografía y se expresan en unidades arbitrarias después de la normalización para la expresión γ-tubulina. Se obtuvieron resultados similares en un segundo experimento independiente.
A la inversa, para probar si la supresión Klf4 conduce a Notch1 regulación, HKC, así como células HeLa fueron transfectadas con siRNAs para Klf4. Efficient abajo de la modulación de este gen no tuvo efectos sobre la transcripción de genes Notch1, y se observó falta similar de efectos después de knock-down de Sp3 y Sp1 (Fig. 6A y datos no presentados). Sin embargo, la caída siRNA mediada combinado de Klf4 y Sp3 resultó en la regulación constante de la expresión de Notch1 en ambos HKCS y células cancerosas (células HeLa y SCC13), con la concomitante knock-down de Sp1 no tener efectos adicionales (Fig. 6B , C y los datos no presentados).
(a) queratinocitos primarios se transfectaron con dos conjuntos de siRNAs para Klf4, Sp1 o Sp3 en paralelo con controles de siRNA revueltos durante 48 horas, seguido de análisis de la expresión de los genes dirigidos por el tiempo real de RT-PCR e inmunotransferencia (a la izquierda y los del centro, respectivamente) también se analizaron las mismas muestras de ARN para los niveles de expresión de Notch 1 (panel derecho). (B) queratinocitos primarios, fueron transfectadas como en el panel anterior con dos conjuntos diferentes de siRNAs para Klf4 y SP3 (siRNA-1, siRNA-2) (columnas de la izquierda) o con siRNAs para Klf4, Sp1 y Sp3 (columnas de la derecha), seguido de análisis en tiempo real de RT-PCR de la expresión de Notch1. Se muestra el promedio calculado de cuatro experimentos diferentes utilizando 36β4 y 18S ARN para la normalización interna. células HeLa y SCC13 (C) se transfectaron con dos conjuntos diferentes de siRNAs para Klf4 y Sp3 (siRNA-1, siRNA-2) seguido de la determinación de la expresión de Notch1 en tiempo real por RT-PCR como en el panel anterior. queratinocitos primarios y células SCC13 fueron transfectadas con siRNAs contra los genes indicados, seguido de análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas Notch1 con γ-tubulina como control de carga igual. Panel derecho: los datos se cuantificaron por densitometría de la autorradiografía y se expresan en unidades arbitrarias después de la normalización para la expresión γ-tubulina
La caída combinada requerida de Klf4 y SP3 para la regulación de la expresión de Notch 1 de mayo. se explica por la unión de estos factores a la Notch1 promotor concomitante. De hecho, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos mostraron, en células HKCS y HeLa, que tanto Klf4 y Sp3 se unen a la región rica en GC proximal del promotor de Notch 1 (Fig. 7A-D). Curiosamente, en HKCS, Sp1 fue también encontró que se unen a esta región, pero a un grado mucho menor que a la región proximal del promotor de p21WAF1 /Cip1, un objetivo Sp1 bien establecida [28]. No vinculante para el promotor Notch1 Sp1 se encuentra en las células HeLa (Fig. 7B). ensayos de chip similares también se realizaron con anticuerpos contra un factor de transcripción de unión a GC-no relacionado, Maz [29]. Mientras Maz1 se encontró que se unen al promotor p21 de manera similar a Sp1, Sp3 y Klf4, hubo poca o ninguna unión de esta proteína a la región proximal del promotor de Notch1 (Fig. 7B, C).
( A) los sitios de unión Klf4- y Sp1 /Sp3 en la -340 /-300 pb Notch1 región promotora predicho. Se muestra la secuencia de nucleótidos de esta región con, en la parte superior, los sitios de unión previsto para Klf4- y Sp1 /Sp3. (B y C) los queratinocitos primarios (HKC) y células HeLa se procesaron para la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) análisis con anticuerpos contra Sp1, Sp3 (B), Klf4 (C) o Maz, como se indica, seguido de la amplificación de dos regiones promotoras Notch1 situado entre pares de bases -740 /-262 (chip 1) y alrededor de -6600 pb (chip 2), que contienen y la falta, respectivamente, /SP3 y Klf4 sitios de unión putativos SP1. La amplificación de la región promotora proximal de la p21
gen WAF1 /Cip1 (Chip p21) se utilizó como control positivo. preparaciones de la cromatina-Un precipitados se utilizaron para reacciones de amplificación paralelas como los controles de ADN de entrada ''. ensayos (D) chip con anticuerpos anti-SP3 y Klf4 y las IgG no inmune como en los anteriores grupos fueron seguidos por tiempo real amplificación por PCR de región1 del promotor Notch1. La cantidad de ADN precipitado se calculó con relación a la cromatina de entrada total y se expresa como un porcentaje del total de acuerdo con la siguiente fórmula [54]: porcentaje total = 2ΔCt × 5, donde Ct = Ct (entrada) - Ct (inmunoprecipitación), y Ct es el ciclo umbral.
4. Control opuesto de Notch1 la transcripción de p53 frente Klf4 /Sp3
Una cuestión importante es si p53 y control Klf4 /Sp3 Notch1 la transcripción de genes a través de mecanismos separados o convergentes. Un paso regulador clave es la transcripción reclutamiento dependiente del factor del complejo de pre-iniciación de la transcripción, que contiene ARN polimerasa II (PolII), para orientar promotores [30]. Para evaluar si este paso inicial de Notch1 la transcripción se encuentra bajo el control de p53 y Klf4 /SP3, se llevaron a cabo dos enfoques complementarios. En células HeLa, donde los niveles de p53 son muy bajos debido a la degradación dependiente de E6, se evaluaron los efectos del aumento de p53 por la expresión excesiva mediada por adenovirus. En las células HeLa de control, ensayos de chip mostraron poca o ninguna unión de PolII al promotor y 3'UTR del gen Notch1, mientras que la unión tal era fácilmente detectable en las células con aumento de la expresión de p53 (Fig. 8A). En HKC, donde los niveles de Klf4 son normalmente bajos, se evaluó el efecto del aumento de la expresión Klf4 través de la infección retroviral. ensayos de chip mostraron unión de PolII para el promotor y el 3'UTR del gen Notch1 en HKCS de control, mientras que no unión tal era detectable en células con una mayor expresión Klf4 (Fig. 8B).
(A) HeLa células fueron infectadas con un adenovirus recombinante que expresa p53 de tipo salvaje (Adp53) o control GFP (AdGFP) y se procesaron para ensayos de chip con anticuerpos contra la ARN polimerasa II (α-PolII) y IgG no inmune como control. Se realizó amplificación por PCR de las regiones indicadas del gen Notch1, en paralelo con la amplificación similar del ADN de la cromatina de entrada. paneles de la derecha: para la cuantificación de los resultados, el material de la cromatina inmunoprecipitada se analizaron también por el tiempo real la amplificación por PCR de las regiones indicadas del promotor Notch1, en paralelo con el ADN de la cromatina de entrada, seguido por un cálculo de la unión de acuerdo con la misma fórmula utilizada en Higo. 7D. (B) queratinocitos primarios (HKC) fueron infectadas con un vector retroviral que sobreexpresan Klf4 (pMSKlf4) o control de vector vacío (Ctrl) durante 48 horas, seguido de ensayos de chip para PolII de unión como en el panel anterior, incluyendo la cuantificación de los resultados por PCR en tiempo real (paneles de la derecha).
Funcionalmente, para evaluar si el aumento de la expresión de p53 y Klf4 /Sp3 abajo de la modulación puede sinergizar, se llevaron a cabo dos enfoques complementarios. En la primera, las células HeLa fueron infectadas con un adenovirus que expresa p53 más /menos knock-down de Klf4 y expresión SP3. En el segundo, las células HeLa fueron transfectadas con siRNAs específicos para la proteína UBE3A, un regulador negativo de la estabilidad de p53, como un método para aumentar la expresión de p53 endógeno [14]. El aumento de los niveles de p53 por cualquiera de los enfoques causó la inducción esperado de expresión Notch1. La caída combinada de Klf4 y SP3 causó también un aumento de la expresión de Notch 1, pero sin efectos aditivos o sinérgicos se observaron por el concomitante aumento de p53 y el derribo de Klf4 y SP3 (Fig. 9A y B).
células (a) HeLa fueron transfectadas con siRNAs para Sp3 y Klf4 en paralelo con controles de siRNA revueltos seguido, 48 horas después de la transfección, por la infección con un adenovirus que expresa p53 (Adp53) o control GFP (AdGFP), durante 24 horas. Los niveles de expresión de Notch1 ARNm se determinaron por tiempo real RT-PCR. Los cambios esperados de p53, Sp3 y expresión Klf4 también se confirmaron por tiempo real de RT-PCR, con resultados similares a los mostrados en las figuras anteriores. células (B) HeLa fueron transfectadas con siRNAs para UBE3A, Klf4 y SP3 solo o en combinaciones, como se indica, en paralelo con los controles siRNA revueltos. UBE3A y expresión de Notch1 fue evaluada por tiempo real de RT-PCR. (C y D) los queratinocitos primarios (HKC) (C) y HeLa y SCC13 células (D fueron infectadas con un retrovirus que expresan Klf4 o control de vector vacío durante 48 horas, seguido por la infección con los virus Adp53 o AdGFP durante 24 horas. Notch1 mRNA se evaluaron los niveles por tiempo real RT-PCR.
Para evaluar si Klf4 puede suprimir los efectos inductivos de células p53, HKCS, HeLa y SCC13 fueron infectadas con el retrovirus que expresan Klf4 o control de vector vacío, seguido de la infección con el adenovirus que expresa p53 o GFP control. el aumento de los niveles de p53 causados inducción de la expresión de Notch1 en HKCS control, así como en HKCS donde el gen Notch1 fue abajo modulada-como consecuencia de una mayor expresión Klf4 (Fig. 9C). a inducción más sustancial de la expresión de Notch1 fue causada por la infección por Ad-p53 de las células cancerosas, como las células HeLa y SCC13, que comparten una ruta de p53 mutado o en silencio y bajos niveles Notch1 endógenos [9], [11]. En estas células, que expresan alto nivel de endógeno Klf4, más expresión de Klf4 no disminuyó la expresión de Notch1 y no interfirió con su inducción por p53 (Fig. 9D).
De este modo, p53 y Klf4 convergen en el control de la transcripción del gen Notch 1 en la etapa inicial de la contratación PolII, con la inducción de p53 se produce a través de un mecanismo independiente de Klf4 /Sp3 represión.
Discusión