Extracto
epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un evento crucial en la invasión tumoral y la metástasis. Sin embargo, la mayor parte de los estudios de EMT pasado se han llevado a cabo en el cultivo en monocapa convencional en dos dimensiones (2D). Por lo tanto, no está claro qué fenotipos invasivos son adquiridos por las células cancerosas EMT inducida. Para hacer frente a este punto, hemos tratado de caracterizar las células EMT en la cultura más fisiológica, en tres dimensiones (3D) de colágeno en gel. EMT fue inducida por el tratamiento de tres líneas celulares de carcinoma humano (A549, Panc-1 y MKN-1) con TGF-ß. El tratamiento TGF-ß estimuló estas células para sobreexpresar la γ2 marcadores de invasión laminina y MT1-MMP en cultivo 2D, además de la inducción de cambios morfológicos bien conocido y la expresión de marcadores de EMT. la inducción de la EMT mejora la motilidad celular y la adherencia a la fibronectina y colágeno en cultivo 2D. Aunque las células EMT mostraron crecimiento celular comparable al control de las células en cultivo 2D, sus tasas de crecimiento fueron muy reprimidas en cultivos de gel de agar y de colágeno suaves. Lo más característico, las células cancerosas EMT inducida extendieron comúnmente protuberancias y marcadamente invasoras en gel de colágeno. Estos salientes fueron apoyados principalmente por los microtúbulos en lugar de citoesqueleto de actina. -Caracol introducido, las células EMT mostraron estables protuberancias similares en condiciones en 3D sin TGF-ß. Por otra parte, estos salientes fueron suprimidos por la colchicina o inhibidores de la proteína de choque térmico 90 (HSP-90) y la proteína fosfatasa 2A. Sin embargo, los inhibidores de MMP no suprimió la formación saliente. Estos datos sugieren que EMT mejora la infiltración de células tumorales en el estroma intersticial mediante la extensión de los salientes basadas en microtúbulos y la supresión del crecimiento celular. La adhesión celular elevada a la fibronectina y el colágeno y la motilidad celular de alta también parece importante para la invasión tumoral
Visto:. Oyanagi J, Ogawa T, Sato H, Higashi S, Miyazaki K (2012) epitelio-mesenquimal transición Estimula Las células de cáncer humano para extender invasiva salientes y suprime el crecimiento celular microtúbulos basado en el gel de colágeno. PLoS ONE 7 (12): e53209. doi: 10.1371 /journal.pone.0053209
Editor: Olivier de Wever, Universidad de Gante, Bélgica
Recibido: 23 Agosto, 2012; Aceptado: 27 Noviembre 2012; Publicado: 31 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Oyanagi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Aid (23112517 y 23300351) para la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón. (Http://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Al igual que las células epiteliales normales, células de carcinoma ductal
In situ
mantener la polaridad celular, el cual con el apoyo de contacto célula-célula y la adhesión celular a la membrana basal. Durante la progresión del cáncer, algunas células de carcinoma pierden la polaridad celular y invaden a través de la membrana basal y luego en el tejido conectivo. Este fenómeno se conoce como transición epitelio-mesenquimal (EMT) y piensa que es un evento crucial de la progresión del cáncer [1] - [3]. EMT es crítico no sólo para muchos pasos de desarrollo tales como la gastrulación y la formación de la cresta neural, sino también para eventos patológicos tales como la herida fibrosis curación y el tejido [1], [3], [4]. EMT se caracteriza generalmente por la pérdida de epitelio marcador de E-cadherina, sobre regulación de marcadores mesenquimales tales como N-cadherina y vimentina, y la adquisición de la forma de células fusiformes similares a fibroblastos en cultivos monocapa [4].
EMT de las células cancerosas es inducida típicamente por TGF-ß [5], pero otros factores de crecimiento y factores microambientales, tales como HGF, EGF y FGF, también son capaces de inducir o promover cambios fenotípicos similares dependiendo de los tipos de células [1] , [3], [6]. TGF-ß ejerce múltiples actividades biológicas sobre el desarrollo y el crecimiento, la diferenciación, la producción de matriz extracelular y la apoptosis de las células normales y cancerosas [7]. TGF-ß es un regulador negativo del crecimiento de las células epiteliales normales. Considerando TGF-ß suprime el crecimiento de células tumorales en las primeras etapas de la carcinogénesis, promueve la progresión tumoral en etapas posteriores [7]. Desde hace tiempo se sabe que el TGF-ß en una combinación con otros factores tales como TGF-α y EGF, promueve el crecimiento independiente de anclaje de fibroblastos normales [8]. La actividad inductora de la EMT de TGF-ß es mediada principalmente por la vía Smad, una importante vía de señales de TGF-ß complejas, que promueve la expresión de los factores de transcripción relacionados con la EMT-incluyendo Snail, Slug, Twist, y ZEB 1/2 [ ,,,0],6]. Estos factores de transcripción se unen a la caja E elementos de secuencias de promotor vinculante y suprimir la expresión de E-cadherina en un nivel de transcripción [9], [10].
EMT en las células del cáncer aumenta la expresión de la invasión, o metástasis relacionadas con los genes, tales como las metaloproteinasas de matriz (MMPs). Nuestro estudio reciente mostró que la laminina γ2 marcador de invasión tumoral, así como la MMP-9, es inducida por la inducción de EMT de células de cáncer gástrico [11]. Otros estudios recientes han sugerido que las células cancerosas inducida por EMT tienen resistencia a los fármacos contra el cáncer y la radiactividad [12] y que tienen propiedades de células madre del cáncer [13]. A pesar de una serie de estudios anteriores sobre el EMT de las células cancerosas, sin embargo, no está claro cómo EMT contribuye a la invasión tumoral y metástasis y lo fenotipos invasivos son adquiridos por las células cancerosas inducida por EMT. Esto es al menos en parte debido al hecho de que la mayoría de los estudios de EMT se han realizado en el sistema de cultivo convencional de dos dimensiones (2D). Se ha hecho evidente que las células cultivadas en cultivo 2D plana difieren considerablemente de los que crecen en tres dimensiones-cultivo (3D) en la morfología celular, la proliferación, la diferenciación, la interacción célula-célula, la interacción célula-matriz y la expresión de genes [14], [15 ]. Con el fin de comprender la consecuencia patológica de la EMT de las células cancerosas, parece importante para caracterizar las células EMT inducida en un sistema de cultivo 3D más fisiológico.
En este estudio, nos caracterizamos EMT inducida por las células cancerosas tanto en 2D cultivo en monocapa y la cultura gel de colágeno en 3D, utilizando tres líneas celulares. Se encontró que las células inducidas por EMT mostraron extensión prominente de protuberancias invasivos basados en microtúbulos y la supresión del crecimiento en el cultivo de gel de colágeno 3D.
Resultados
EMT Inducción de líneas celulares de cáncer humano Tres
Para investigar los cambios fenotípicos inducidos por la EMT de las células cancerosas, se utilizaron modelos de tres líneas celulares de cáncer humano. Hemos informado anteriormente de que el TGF-ß y TNF-a inducen sinérgicamente EMT en cultivo libre de suero de MKN-1 en las células de cáncer gástrico humano [11]. Se ha informado de que la línea celular de adenocarcinoma de pulmón A549 [17] y la línea celular de cáncer de páncreas Panc-1 [16] someterse a EMT por el tratamiento con TGF-ß. En este estudio, primero a prueba tres citoquinas (TGF-ß, TNF-a, y EGF) para la inducción de EMT de las células A549 y Panc-1, el análisis de la expresión de algunos marcadores de invasión tumoral, así como marcadores de EMT. En ambas líneas celulares, sólo se requería TGF-ß para inducir EMT, a juzgar por el cambio morfológico mesenquimales (Fig. S1), así como la reducción de la expresión de E-cadherina y la inducción de la vimentina (Fig. 1A y B). TGF-ß también simula la expresión de dos marcadores de invasión tumoral, MT1-MMP y de la cadena laminina γ2, en ambas líneas celulares. Sin embargo, una combinación de TNF-α con TGF-ß aumentó aún más los niveles de la cadena laminina γ2 y MMP-9 en células A549 (Fig. 1A). La cadena laminina γ2 y MT1-MMP también fueron inducidos por TNF-α y /o EGF en células Panc-1 (Fig. 1B). Además, hemos encontrado que aunque se requiere tanto TNF-α y TGF-ß para la inducción de EMT de las células MKN-1 en cultivo libre de suero, sólo el TGF-ß era necesario en presencia de suero (datos no mostrados). Estos resultados indican que el TGF-ß es el inductor más común y potente de EMT para las tres líneas celulares de cáncer, pero también se requiere TNF-α para la expresión eficaz de algunos marcadores de invasión, dependiendo de los tipos de células.
A549 (a) y Panc-1 (B) las células se incubaron en medio libre de suero con 10 ng /ml de EGF, 10 ng /ml de TNF-α, 10 ng /ml de TGF-ß, o TNF-α + TGF-ß . Después de 48 h de incubación, los medios de comunicación acondicionado (CM) y los lisados celulares se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia para los marcadores de EMT (E-cadherina y vimentina en los lisados celulares), la gamma 2 marcador de invasión laminina (CMS), MT1-MMP (lisados celulares ), y la actina como control de carga interno (lisados celulares). Los paneles muestran más zimografía de gelatina de MMP-9 y MMP-2 en los CM. Los valores entre paréntesis indican el tamaño molecular aproximado en kDa. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
Efecto de la EMT de inducción de adhesión y migración celular en monocapa Cultura y EMT
Como puede observarse, el TGF-ß indujo de manera eficiente en los tres diferentes líneas celulares de carcinoma. A continuación, examinó lo fenotipos fueron adquiridos por la inducción de EMT de las células cancerosas para su crecimiento invasivo. En primer lugar, la actividad de adhesión celular de las células A549 se investigó después de la inducción de EMT, el uso de tres sustratos de adhesión celular, laminina-332, fibronectina y colágeno de tipo I. Las células se pre-trataron con TGF-ß durante 24 h y luego sembradas en estos sustratos. Como se muestra en las Figs. 2A y 2B, las células de control sin tratar adheridas de manera más eficiente a la laminina-332. el tratamiento de TGF-ß se redujo sólo ligeramente la adhesión celular a la laminina-332. Por el contrario, aumentó significativamente la eficiencia de la adhesión celular a la fibronectina sustratos del estroma y colágeno de tipo I. El ensayo de adhesión celular de lapso de tiempo eléctrica mostró claramente los cambios inducidos por la EMT en la actividad de adhesión celular de las células A549 a la fibronectina y colágeno tipo I (Fig. 2C). Estos cambios también se observaron en Panc-1 y las células MKN-1 (datos no presentados).
(A y B) Una placa de noventa y seis pocillos se revistió con 2 g /ml de laminina-332 (Lm332 ), 5 mg /ml de fibronectina (FN), y 2 mg /ml de colágeno I (Col I) a 4 ° C durante la noche, y después se bloquearon con 1,2% de BSA durante 1 hora a 37 ° C. las células A549 se incubaron con 10 TGF-ß ml /ng en medio libre de suero durante 24 h. Se suspendieron las células tratadas con TGF-ß (TGF-ß) y células no tratadas (control) y se inocularon en el plato. Después de incubación durante 30 min, se tomaron imágenes de contraste de fase de actividad (A) y la adhesión celular se midió (B). Una barra de escala indica 50 micras. Los números relativos de células unidas se determinaron como se describe en Materiales y Métodos. Cada barra indica la media ± desviación estándar de células adherentes en pocillos por triplicado. (C) Ensayo de adhesión celular eléctrico lapso de tiempo con los E-placas. La placa se recubrió previamente con fibronectina (○, •) y colágeno I (□, ▪) como se muestra arriba, y la adhesión de las células tratadas con TGF-ß (TGF-ß: •, ▪) y células no tratadas (control: ○, □) a la placa se monitorizó cada 5 min. Índice de Células indica unidad arbitraria que refleja unión y propagación de las células en matriz de microelectrodos en el fondo de los pocillos. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
En segundo lugar, la actividad de migración celular se investigó usando dos ensayos diferentes. En
in vitro
enrolla ensayo de curación, TGF-ß promovió significativamente la migración celular de A549 y células Panc-1 en ausencia de TNF-α en condiciones suplementado con suero (Fig. 3A y B). TNF-α no tenía efecto adicional en la actividad de migración de células (datos no presentados). Cuando la migración celular se ensayó mediante la microscopía de vídeo de lapso de tiempo, la motilidad celular mejorada por el tratamiento de TGF-ß se muestra más claramente con las dos líneas celulares (Fig. 3C). También confirmó que el tratamiento de TGF-ß aumentó la motilidad de las células MKN-1 en la herida ensayo de curación (datos no mostrados).
(A y B) Para medir la actividad de migración de las células, (paneles de la izquierda) A549 y Panc-1 células (paneles de la derecha) se sometieron a la
vitro
herida ensayo de curación en en presencia o ausencia (control) de TGF-ß, como se describe en el texto. micrografías de contraste de fases de los cultivos fueron tomadas después de 16 h de incubación. líneas de trazos negros indican los bordes de la herida inicial. Barra de escala, 50 micras. B) La zona de la migración celular se estimó mediante el análisis de la imagen de píxeles con J. Cada barra indica la media ± desviación estándar para las áreas de células migradas en 3 campos diferentes (paneles de la derecha). (C) Las células que habían sido tratadas previamente con o sin TGF-ß durante 24 h se incubaron en 1% de medio que contenía FBS con o sin TGF-ß en una placa de 24 pocillos durante 6 horas a 37 ° C. La migración celular se controló con un sistema de vídeo de lapso de tiempo durante 12 h. distancia de migración celular se midió por 15 celdas seleccionadas al azar. Cada barra indica la media ± SD de velocidad de migración de células de 15 celdas. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
Efecto de la inducción de EMT en Anchorage dependientes e independientes del Crecimiento Celular
En tercer lugar, se investigó la actividad de crecimiento celular de las células inducidas por la EMT bajo tres condiciones diferentes. En cultivo monocapa 2D, el tratamiento de TGF-ß no afectó el crecimiento de MKN-1 en las células y insignificantemente o solamente ligeramente suprimida la de A549 y células Panc-1 (Fig. 4A). Cuando la formación de colonias fue examinado en cultivos 2D Disperso (500 células /35 mm de plato) de A549 y células Panc-1, no hubo diferencia significativa entre los cultivos tratados con TGF-ß y no tratados (datos no mostrados). En cultivo en suspensión en placas no adhesivas, las tres líneas celulares crecieron lentamente formando agregados de células o esferoides en las placas. En tales condiciones, el tratamiento de TGF-ß suprimido el crecimiento de las células MKN-1, pero no tuvo efecto sobre la de A549 y células Panc-1 (Fig. 4B). Por el contrario, la formación de colonias de las tres líneas celulares en cultivo de agar blando fue fuertemente suprimida por el tratamiento de TGF-ß. Tanto el número de colonias totales y el área total de colonias fueron extremadamente reducidos en las líneas de células TGF-ß-tratada que los no tratados (Fig. 4c, 4d, y S2). células Panc-1 Sin embargo, el TGF-ß-tratada formados relativamente grandes colonias en comparación con las células no tratadas (Fig. S2). La falta de adhesión célula-célula E-cadherina mediada en las células TGF-ß-tratada podría suprimir los potenciales de la supervivencia celular y la proliferación en la condición de anclaje independiente.
(A) MKN-1 (1,0 × 10
4 células), A549 (0,5 × 10
4 células) y Panc-1 (1,0 × 10
4 células) se incubaron en cada 1% de medio que contenía FBS al pocillo que contiene sin (control) o con TGF-ß en placas de cultivo de 24 pocillos durante 7 días en cultivo en monocapa. Después de la incubación, se midió el número de células con un contador de células. Cada barra indica la media ± desviación estándar de los números de células en pocillos por triplicado. (B) Las células se cultivaron a una densidad de 1 × 10
4 células por pocillo en placas de cultivo de suspensión de 24 pocillos que contenían 1% de medio que contenía FBS sin (control) o con TGF-ß durante 7 días. El número relativo de células se midió usando el kit de recuento de células Dojindo 8. Cada barra indica la media ± SD de los valores de absorbancia a 485 nm en pocillos por triplicado. Las células (C y D) se inocularon a una densidad de 7.000 células por placa de 35 mm en 10% de FBS que contiene medio de agar blando y sin (control) o con TGF-ß y se incubaron durante 10 (MKN-1) o 14 (A549 y Panc-1) días. Después de la incubación, las células se tiñeron con
p
-iodonitrotetrazolium violeta, y el número de colonias totales (C) y superficie total de colonias (D) se determinaron por Image J y se muestra como el número con respecto al control ( 100%). Cada barra indica la media ± DE de pocillos por triplicado. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
comportamiento de las células de cáncer inducida por EMT en 3D del gel del colágeno Cultura y
La expresión génica
in vivo es diferente de
que en el sistema de cultivo monocapa (15). Como un sistema de cultivo que imita
in vivo
condiciones, se utilizó la cultura gel de colágeno 3D para caracterizar mejor las células cancerosas EMT inducida. Las células cancerosas se cultivaron dentro de la capa de gel de colágeno que contiene TGF-ß y /u otros factores durante 7 días. En el gel de colágeno 3D, las células MKN-1 mostraron extensiones de membrana prominentes o salientes cuando se trataron con TGF-ß (Fig. 5A y B). Un cambio morfológico similar se observó en A549 y Panc-1 líneas celulares (Fig. S3). La adición de TNF-α a la de cultivo que contiene TGF-ß-promueve aún más este cambio morfológico sólo en el caso de las células MKN-1 (Fig. 5B). solo EGF, que induce EMT en las células MKN-1, también indujo la formación saliente en esta línea celular, pero este efecto no se observó en las células A549 y Panc-1. Estos resultados sugieren que el cambio morfológico es específico para EMT inducción en lugar de la estimulación de TGF-ß.
(A) MKN-1 en las células se incubaron en colágeno 3D con o sin las citocinas indicadas en portaobjetos de cámara de 3 pocillos durante 7 días. El medio de cultivo se cambió cada 3 días. Barra de escala, 50 micras. (B) Después de 5 días de incubación-, el número de grupos de células totales y los que tienen protuberancias se contaron en un campo de centro bajo un microscopio, y se calculó el porcentaje de grupos de células de protrusión-positivo. Cada barra indica la media ± desviación estándar de los números relativos de grupos de células protrusión-positivas en pocillos por triplicado. (C) Después de 7 días de incubación, las células en gel de colágeno se tiñeron con el kit de recuento de células Dojindo 8 durante 4 h, y se midió la absorbancia a 485 nm de cada medio de cultivo. Cada barra indica la media ± desviación estándar de los valores de absorbancia en pocillos por triplicado. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
A continuación examinó si la inducción de EMT suprime el crecimiento celular dentro de gel de colágeno. Como se encuentra en cultivo de agar blando, TGF-ß suprime fuertemente el crecimiento de todas las líneas celulares examinadas en gel de colágeno (Fig. 5C). EGF nunca o sólo débilmente suprime el crecimiento de las tres líneas celulares en gel de colágeno 3D. TNF-α no tiene ningún efecto adicional significativo en estos cultivos. Estos datos indican que la inducción de EMT promueve la extensión prominente de protuberancias, pero suprime el crecimiento celular en los cultivos de gel de colágeno en 3D de las tres líneas celulares de cáncer.
Estructura basada en microtúbulos de protuberancias inducida por EMT en 3D del gel del colágeno
Para la caracterización de los salientes EMT inducida, se analizaron los cambios en el citoesqueleto después de la inducción de la EMT por el TGF-ß. actina filamentosa (F-actina) y los microtúbulos citoesqueletos de las células inducidas por EMT se tiñeron por fluorescencia con rodamina phalloidine y un anticuerpo de la tubulina específica, respectivamente. células MKN-1 fueron estimuladas con TGF-ß en cultivos 2D y 3D y luego se tiñeron para los citoesqueletos (figura 6A y B). En el cultivo 2D de las células inducidas por EMT, las fibras de estrés robustas de F-actina, así como los microtúbulos, con el apoyo de la forma de la célula única (Fig. 6A). En el gel de colágeno 3D, los filamentos de F-actina se detectaron con fuerza en la superficie de la estructura de esferoide en las células no estimuladas (Fig. 6B). En las células TGF-ß-tratada, se encontró que los filamentos de actina periférica alrededor del cuerpo celular y protuberancias, pero las fibras de estrés se encuentran raramente en los salientes. En contraste, muchos haces de microtúbulos se detectaron prominente en el centro de los salientes en las células EMT inducida. En las células control, los microtúbulos se distribuyeron uniformemente en el citoplasma. Estos patrones de citoesqueletos se encuentran comúnmente en las células MKN-1 y Panc-1 (datos no presentados).
células MKN-1 se incubaron sin (control) o con 10 ng /ml de TGF-ß en suero que contiene el medio de cultivo en 2D (a) o cultivo de gel de colágeno 3D (B) durante 3 días. Estas células fueron fluorescencia de manchado de α-tubulina (verde) mediante el uso de un anticuerpo específico, F-actina por faloidina rodamina (rojo), y DAPI (azul). Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un microscopio de fluorescencia confocal. Otras condiciones experimentales se describen en Materiales y Métodos.
Para examinar si los microtúbulos es un citoesqueleto principio apoyar los salientes EMT inducida, se examinaron los efectos de algunos inhibidores del citoesqueleto en la extensión de células EMT inducida por colágeno gel. Citocalasina B y colchicina se sabe que inhiben tanto la polimerización y estabilización de F-actina y microtúbulos, respectivamente. Cuando las células fueron tratadas con estos inhibidores al mismo tiempo que el tratamiento de TGF-ß, la extensión de células se inhibe parcialmente por 1 M citocalasina B, pero completamente por 10 nM colchicina (Fig. 7A). Cuando estos inhibidores se añadieron 24 h después de la estimulación de TGF-ß, los salientes se retraen de manera significativa por la colchicina después del tratamiento 3-h, pero no por citocalasina B (Fig. 7B). Del mismo modo, otros dos inhibidores de microtúbulos vinblastina y taxol (paclitaxel) dependiente de la dosis bloquearon la extensión de células cuando se añade junto con el TGF-ß para la cultura 3D (Fig. S4). También se analizaron los efectos de algunos inhibidores de la señal sobre la extensión de células EMT inducida en gel de colágeno. La proteína fosfatasa 2A (PP2A) cantaridina inhibidor y el choque térmico de proteína-90 (HSP-90) inhibidor de radicicol, tanto que inhiben la estabilización de los microtúbulos, débilmente inhibieron la extensión de células (Fig. 7C). Cuando ambos cantaridina y radicicol se añadieron en combinación, la extensión de células fue suprimida de forma aditiva. Estos datos sugieren que los salientes de las células cancerosas inducida por EMT en gel de colágeno 3D son compatibles principalmente por los microtúbulos, y ambos PP2A y HSP-90 actividades son necesarias para la formación de protuberancia. Aunque se requiere citoesqueleto de actina para la extensión de los salientes, no parece necesario para el mantenimiento de las estructuras de protrusión.
células MKN-1 se incubaron con 10 ng /ml de TGF-ß en medio que contenía suero en cultivo de gel de colágeno 3D , como se describe en las figuras 5 y 6. Para la cultura de colágeno se añadieron varios inhibidores, y la formación saliente se cuantificó 24 horas más tarde (a, C y D) o 3 h después (B). (A) Las concentraciones indicadas de citocalasina B y colchicina se añadieron al medio de cultivo al mismo tiempo que la adición de TGF-ß. (B) La citocalasina B (5 mM) y se añadieron colchicina (1 mM) al medio de cultivo después de la incubación con TGF-ß para 24 h. (C) MKN-1 se trataron las células sin (control) o con cantaridina (1 M) y /o radicicol (1 M) como se describe en (A). (D) MKN-1 en las células se trataron previamente con 10 g /ml de cada anticuerpo neutral a 37 ° C durante 30 min, y las células pretratadas fueron embebidas en gel de colágeno que contiene 10 mg /ml del anticuerpo anti-integrina indicado y 10 ng /ml de TGF-ß. Todos estos inhibidores no eran citotóxicos al menos en las condiciones experimentales anteriores, según el análisis de la tinción con azul de tripano. Sin embargo, los efectos citotóxicos se volvieron evidentes cuando las células se incubaron con 5 M citocalasina B o 1 M colchicina para 24 h.
Los salientes formados en las células cancerosas inducida por EMT dentro de gel de colágeno en gran medida diferían en apariencia de la morfología de las células en el cultivo en monocapa. Esto implica que la interacción de las células con colágeno en el entorno 3D está implicado en la formación de protuberancia. Esta posibilidad se examinó mediante el uso de anti-integrina, anticuerpos neutros. Como era de esperar, los anticuerpos anti-integrina α2 y anti-integrina-SS1 bloquean eficazmente la extensión de los salientes (Fig. 7D). Una combinación de los dos anticuerpos inhibió más fuertemente la formación saliente de cada anticuerpo. Estos resultados demuestran que la formación de salientes basadas en microtúbulos requiere tanto de citocinas que inducen la EMT y colágeno /señales de integrinas.
Diferencias con otras protuberancias invasoras.
Es bien sabido que las células cancerosas malignas invaden en la matriz extracelular 3D mediante la extensión de algunos tipos de protuberancia o proyección. Invadopodium es un, saliente típico basado en actina producida por las células cancerosas invasoras [18]. MT1-MMP se cree que es un marcador de invadopodios y su actividad es necesaria para la formación de invadopodium. Para probar si los salientes observadas en las células de cáncer de EMT inducida por el interior del gel de colágeno son idénticos a invadopodios, hemos examinado el efecto de un inhibidor de amplio espectro de MMP (TAPI) en la extensión de la protrusión. Cuando TAPI se añadió simultáneamente con TGF-ß en la cultura de colágeno, se obtuvo poco o muy débil efecto sobre la extensión saliente en las tres líneas celulares ensayadas (Fig. S5, A-C). Esencialmente se obtuvieron los mismos resultados cuando TIMP-2, un inhibidor de MMP natural, se utilizó en lugar de TAPI (datos no mostrados)
.
Dado que la actividad Src quinasa también está asociada con la formación invadopodium, el próximo examinó los efectos de tres tipos de inhibidores de la quinasa Src, PP1 analógica, SU6656 y lavendustina C, sobre la formación saliente en gel de colágeno 3D. Cualquier tipo de los inhibidores no suprimió la formación saliente de MKN-1 en las células (Fig. S5, D). Estos resultados sugieren que el saliente EMT inducida es una estructura celular diferente de invadopodium.
salientes a base de microtúbulos en células EMT inducida por Snail dentro del gel del colágeno
Como se muestra arriba, TGF-ß estimularon las células cancerosas se extienden salientes comúnmente invasivos basados en microtúbulos en la cultura de gel de colágeno 3D. Para generalizar más este fenómeno, se estableció de forma estable células inducidas por la EMT mediante la introducción de un caracol vector de expresión de cDNA en células Panc-1 (Caracol-Panc-l). Al igual que las células TGF-ß-estimulado, células Panc-Caracol-l mostraron la morfología celular dispersa en comparación con las células control, transfectadas con el vector vacío (Mock-Panc-1) (Fig. 8A). De acuerdo con el cambio morfológico, la expresión de E-cadherina fue suprimido y la expresión de vimentina se mejoró en células Panc-Caracol-l, en comparación con las células de control (Fig. 8A). Cuando estas células transfectadas se sembraron en gel de colágeno 3D, Snail-Panc-l pero no Mock-Panc-1 células extendido, salientes robustos basados en microtúbulos en ausencia de TGF-ß (Fig. 8B). La extensión de los salientes en las células Caracol-Panc-L fue fuertemente inhibida por la colchicina pero apenas por citocalasina B (Fig. 8C y D). Estos datos también apoyan que la formación saliente de microtúbulos basado refleja EMT en gel de colágeno en 3D.
Panc-1 células fueron transfectadas con un vector vacío (Mock-Panc-1) o un vector de expresión de caracol (Caracol-Panc -1), y sus transfectantes estables fueron establecidas. Estas células fueron cultivadas sin TGF-ß en cultivo en monocapa cultura 2D o 3D gel de colágeno. (A) Morfología de Mock-Panc-1 (panel superior) y Caracol-Panc-1 (panel inferior) las células se incubaron durante 2 días en cultivo monocapa 2D, y la expresión de E-cadherina, vimentina y caracol en estas células (paneles de la derecha ). Véase la Figura 1 para las condiciones experimentales. Barra de escala, 50 micras. (B) Morfología de Mock-Panc-1 (panel superior) y las células se incubaron en la cultura gel de colágeno 3D durante 3 días Caracol-Panc-1 (panel inferior), y su formación saliente (figura de la derecha). Vea la Figura 5 para las condiciones experimentales. Barra de escala, 50 micras. Efectos de 1 cholchicine mu M (C) y 5 M citocalasina B (D) en la formación de protuberancia en la cultura gel de colágeno 3D (C y D). Estos inhibidores se añadieron al medio de cultivo después de 24 h de incubación con TGF-ß. Otras condiciones experimentales son las mismas como se describe en las figuras 5 y 7B.
También compararon los potenciales de crecimiento en las condiciones dependientes de anclaje e independientes entre las células Caracol-Panc-L Mock-Panc-1 y. No hubo diferencia significativa en la tasa de crecimiento entre los dos tipos de células en cultivo monocapa (Fig. 9A). En la cultura de agar blando, tanto el número total de colonias y el área total de colonias eran claramente más baja en Caracol-Panc-l células que las células Mock-Panc-1 (Fig. 9B y C), pero las grandes colonias fueron más abundantes en Caracol-Panc-l células que las células de control (Fig. 9D). La proliferación celular en gel de colágeno fue ligeramente, pero significativamente menor en Caracol-Panc-l células que las células de control (
p
& lt; 0,05) (Fig 9E.)
(A) monocapa. cultura. Mock-Panc-1 (columna abierta) y Caracol-Panc-1 (columna cerrado) se sembraron a una densidad de 1,0 × 10
4 células por pocillo de placas de 24 pocillos en 10% de medio que contenía FBS y se incubaron durante 7 días. Después de la incubación, se midió el número de células con un contador de células. (B-D) de cultivo de agar blando. células Caracol-Panc-1 Mock-Panc-1 y se cultivaron en medio de agar blando durante 14 días. Después de la incubación, el número de colonias totales (B) y el área total de colonias (C) se analizaron por Image J. fueron fotografiados Los cultivos de agar blando y cada imagen típico se muestra en (D). Barra de escala, 500 micras. Otras condiciones experimentales fueron las mismas como se describe en la Figura 4. cultivo (E) de colágeno. Mock-Panc-1 y las células Caracol-Panc-1 se cultivaron en gel de colágeno 3D durante 7 días como se describe en la figura 5. Después de la incubación, se midió el número relativo de células utilizando el kit de recuento de células Dojindo 8.
Discusión
en este estudio, hemos utilizado modelos de EMT de tres líneas celulares de carcinoma humano (A549, Panc-1 y MKN-1) para caracterizar las células EMT inducida en sistemas de cultivo 2D y 3D . De acuerdo con otros estudios [16], [17], las células A549 y Panc-1 exhibieron fenotipos típicos EMT después del tratamiento con TGF-ß solo en cultivos monocapa en 2D. células MKN-1 requiere de TGF-ß más TNF-α en el medio libre de suero para la inducción de la EMT como se informó anteriormente [11], pero sólo se requirió TGF-ß en medio que contenía suero. La expresión de los dos marcadores de invasión γ2 laminina y MT1-MMP se asoció con la inducción de EMT de estas líneas celulares. Sin embargo, la expresión de MMP-9 y la laminina γ2 fue mucho mayor con TGF-ß más TNF-α de TGF-ß por sí sola [11]. Estos resultados sugieren que la adquisición de fenotipos invasivos de células de cáncer requiere de TNF-α y /u otros factores además de TGF-ß, incluso si el TGF-ß sí sola es suficiente para la inducción de EMT morfológica.
El presente estudio reveló que las células A549 EMT inducida adheridas de manera más eficiente a la célula estromal sustratos de adhesión de fibronectina y colágeno de tipo I que las células de control no inducidas, aunque la adhesión de las células al sustrato de la membrana basal laminina-332 no se cambió por la inducción de EMT. Esto es consistente con el hecho de que la expresión de proteínas de matriz extracelular del estroma, tales como fibronectina y colágeno de tipo I se ve reforzada por EMT inducción [16]. También confirmó el aumento de la producción de fibronectina en las células EMT inducida en cultivo 2D (datos no mostrados). Es altamente espera que el cambio EMT inducida de la actividad de adhesión celular depende de la de la expresión de la integrina. Además, demostramos que los potenciales de la migración celular de las tres líneas celulares en cultivo 2D se incrementaron significativamente por la inducción de EMT, de acuerdo con los resultados para las células Panc-1 reportados por Horiguchi et al. [17]. Estos cambios fenotípicos, que son coherentes con el concepto general de la EMT, parecen ser necesarios para la invasión de células de cáncer a través de los tejidos intersticiales del estroma.
El presente estudio reveló grandes diferencias en los fenotipos de las células cancerosas inducida por EMT entre 2D y 3D culturas. En primer lugar, el crecimiento de las células en respuesta a TGF-ß era completamente diferente entre los dos sistemas de cultivo.