Extracto
Antecedentes
El
crecimiento de transcripción-5 arresto específica gen gratis (
GAS5
) codifica un ARN no codificante larga (lncRNA) y alberga una serie de pequeños ARN nucleolar (snoRNAs), que recientemente se han implicado en múltiples procesos celulares y el cáncer. En este caso, se investiga la relación entre el daño del ADN, p53, y el
GAS5
snoRNAs para obtener una mayor comprensión del papel potencial de este locus en la supervivencia celular y la oncogénesis tanto
in vivo
y
in vitro
.
Métodos
Se utilizaron técnicas cuantitativas para analizar el efecto de daño en el ADN en
GAS5
expresión ARNsno y para evaluar la relación entre p53 y la
GAS5
snoRNAs en líneas celulares de cáncer y en las técnicas biológicas normales, pre-malignas, y de tejido colorrectal humano maligno y se utilizan para sugieren papeles potenciales para estos snoRNAs en la respuesta al daño del ADN.
resultados
GAS5
expresión ARNsno -derivado fue inducida por daño en el ADN de una manera dependiente de p53 en líneas celulares de cáncer colorrectal y sus niveles no se vieron afectados por Dicer. Por otra parte, los niveles de p53 fuertemente correlacionados con
GAS5
expresión ARNsno -derivado en el tejido colorrectal.
Conclusiones
En conjunto, estos datos sugieren que el
GAS5
snoRNAs -derivado están bajo el control de p53 y que tienen un papel importante en la mediación de la respuesta de p53 al daño del ADN, que no pueden estar relacionadas con su función en el ribosoma. Sugerimos que estos snoRNAs no son procesados por Dicer para formar pequeños ARN derivados-ARNsno con microARN (miARN) -al igual que las funciones, pero su papel exacto requiere una evaluación adicional. Además, puesto que snoRNAs anfitrionas GAS5 menudo se utilizan como controles endógenos en cuantificaciones qPCR nos muestran que su uso como genes de limpieza en los experimentos de daño en el DNA puede conducir a resultados inexactos
Visto:. J Krell, Frampton AE, Mirnezami R, Harding V, De Giorgio A, Roca Alonso L, et al. (2014)
Crecimiento niveles de transcripción 5 servicios asociados snoRNA Arrest-específicos están relacionados con la expresión de p53 y daño del ADN en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (6): e98561. doi: 10.1371 /journal.pone.0098561
Editor: Raffaele A. Calogero, Universidad de Turín, Italia |
Recibido: 28 Febrero, 2014; Aceptado: 5 Mayo 2014; Publicado: 13 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Krell et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores quisiera agradecer El Memorial Searle (2005) Charitable trust, Michael y Roberta Hunter, Peter y Marilyn Cooper, Steve Mobbs y Pauline Thomas y Denise y Edward Pincheson por su generoso apoyo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
snoRNAs son una clase bien caracterizada de expresión ubicua, los ARN no codificante (ncRNAs) que son 60-300 nucleótidos de longitud [1]. Predominantemente localizada en el nucleolo que clásicamente funcionan como guía RNAs para la maduración post-transcripcional y modificación de ARN ribosomal (ARNr) y snARNs involucrados en el spliceosome. secuencias guía snoRNA hibridan específicamente con su secuencia diana rRNA, y, a través de asociaciones con las proteínas, forman pequeños complejos de ribonucleoproteínas nucleolares (snoRNPs) y ejecutar modificaciones específicas de ARNr [1]. Por lo tanto, snoRNAs son cruciales para la función del ribosoma y la regulación efectiva de la traducción y, por tanto, como era de esperar, son altamente conservado durante la evolución [2]. Hay dos clases principales de snoRNAs, denominado C /caja de D snoRNAs y la casilla H /ACA snoRNAs, respectivamente. Se diferencian en términos de su secuencia y estructura, sus compañeros de unión y la naturaleza de las modificaciones post-transcripcionales que inducen [2], [3].
En los genomas eucariotas, snoRNAs se codifican en su mayor parte en los intrones de la codificación de proteínas los genes del hospedador, pero algunos están bajo el control de promotores independientes [4]. En los seres humanos, la mayoría de los snoRNAs son intrónica y co-transcritos con sus transcripciones de genes de acogida, y luego procesado de los intrones extirpados [5]. Sin embargo, la transcripción de una minoría se produce a través de la ARN polimerasa II independiente o actividad III de una manera similar a muchos miRNAs [5], [6]. miembros de la familia snoRNA estrechamente relacionados por lo general se codifican en diferentes intrones del mismo gen huésped, pero algunos genes del huésped codifican numerosos snoRNAs no relacionados. Aunque algunos genes del huésped snoRNA parecen ser no codificante de proteínas, muchos están involucrados en la síntesis de la función y de la proteína nucleolar, y como tal no es a menudo un elemento de co-funcionamiento [5], [7]. El hecho de que en los seres humanos, la mayoría de snoRNAs se codifican en los intrones de la codificación de proteínas y no codificantes de proteínas genes dio lugar a la hipótesis de que estos genes del huésped actúan sólo como amas de casa celulares a través de sus secuencias snoRNA de codificación de [8], [9 ]. Sin embargo, estudios recientes han cuestionado este concepto y han implicado snoRNAs y sus genes del huésped en el control de la oncogénesis y destino de las células [10], [11]. La existencia de una serie de 'huérfano' snoRNAs sin objetivos de ARNr conocidos, y la demostración de su presencia en localizaciones subcelulares que no sean el nucleolo [12], apoya el concepto de que este grupo de pequeños ARN no codificantes puede regular otras moléculas y tener funciones celulares adicionales [13]. Por otra parte, una serie de estudios sugieren una relación evolutiva entre los miRNAs y snoRNAs [14] y otros informan que snoRNAs maduros pueden someterse a una transformación celular para formar pequeños ARN derivados-ARNsno (sdRNAs) con las funciones de los genes miARN-como [3], [14] - [17]. Además, la expresión ARNsno ha demostrado ser tan variables como la expresión de los genes miARN en muestras de tumores humanos y la normalización de la reacción en cadena de la polimerasa miARN (PCR) los datos de expresión de estos snoRNAs sesgo introducido en las asociaciones entre miARN y el resultado [18].
el
un crecimiento de detención específica transcripción 5
gen (
GAS5
), situado en 1q25, es una serie de genes snoRNA múltiples no codificante de la proteína que consta de 12 exones [19], [20] inicialmente descubierto durante la detección de posibles genes supresores de tumores expresados en niveles altos durante la detención del crecimiento. En los seres humanos, que codifica diez intrónica cuadro de C /D dos ARN maduros largos no codificantes (lncRNAs) isoformas snoRNAs y que se originan a partir de los sitios donantes 5 'de empalme alternativo en el exón 7 [20]. El marco de lectura abierto codificado dentro de
GAS5
exones es corto y no se cree que codificar una proteína funcional. Cartografía de su extremo 5 * demuestra que presenta una característica del tracto oligopyrimidine del oligopyrimidine * 5-terminal (5 * TOP) clase de genes que se acumulan durante la detención del ciclo celular, pero se degradan rápidamente por descomposición mediada por el antisentido durante el crecimiento celular. La clasificación de los
GAS5
como un gen TOP 5 * ofrece una explicación de por qué es una transcripción específica como la detención del crecimiento, mientras que el corte y empalme
GAS5
ARN se asocia normalmente a los ribosomas y se degrada rápidamente, durante el crecimiento celular detenidos se acumula en partículas mRNP. Curiosamente, las únicas regiones de conservación entre ratón y humano
GAS5
genes son sus snoRNAs y 5 * -Fin secuencias [20] lo que sugiere que estos son los componentes funcionales más importantes. Aunque
GAS5
juega un papel en la modificación post-transcripcional del ARN ribosomal a través de sus snoRNAs, varios estudios recientes han implicado este gen en otros procesos celulares importantes [10], [18], [21], [ ,,,0],22]. El GAS5 lncRNA ha demostrado interactuar con el dominio de unión a ADN del receptor de glucocorticoides, donde actúa como un riborepressor, que influyen en la supervivencia celular y actividades metabólicas durante la inanición por la modulación de la actividad transcripcional de este receptor [10]. Además, el mismo grupo mostró en las líneas celulares de próstata, que GAS5 mRNA secuestra el complejo receptor de andrógenos /andrógeno y previene su unión a secuencias de ADN diana [10], que es probable que desempeñe un papel importante en la modulación de los efectos de los andrógenos en la próstata . transcripciones GAS5 también se han demostrado ser importantes reguladores de la supervivencia celular y la apoptosis en células T humanas y líneas celulares de cáncer de mama y de próstata [21] - [23], y sus sobreexpresión sensibilizado líneas celulares de cáncer de mamífero a inductores de la apoptosis [21] . Además, la reducción de expresión de GAS5 y /o su snoRNAs se ha demostrado en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas [18], cáncer de mama [18], [21] y glioblastoma multiforme [24], mientras que la sobre expresión de U44, U76 y U78 se ha demostrado en NSCLC [25]. El aberrante
GAS5
expresión demostrada en cáncer de mama y de cabeza y cuello se asoció con un mal pronóstico [18].
A pesar de estos datos, se sabe poco sobre el papel preciso de GAS5 específica en snoRNAs las vías en las que han sido implicados, y menos aún se acepta sobre los mecanismos subyacentes a los mismos. Dado el papel anteriormente descrita de
GAS5
en la regulación de la apoptosis y el papel bien documentado para p53 en el mismo proceso, que tuvo como objetivo investigar más a fondo la relación entre p53 y la GAS5 snoRNAs para ganar una mayor comprensión de su potencial papel en la supervivencia celular y la oncogénesis en el cáncer colorrectal tanto
in vivo
y
in vitro
. Además hemos demostrado que tanto U44 y U47 GAS5 derivan snoRNAs, que se encuentran entre los más comunes utilizados como snoRNAs genes de limpieza para la normalización en asociación con el análisis de expresión TaqMan miARN y debe ser evitado en los experimentos de daño en el ADN.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
la aprobación ética se obtuvo de la junta de revisión ética del Imperial College. El estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de la obtención de muestras de tejido para el propósito del estudio.
Colección, la manipulación y extracción de ARN a partir de láser capturado micro-disecados (LCM) muestras tumorales
Con la aprobación de nuestro consejo de revisión institucional, las muestras de tejido que representen el tejido normal de colon y adenocarcinoma de colon se obtuvieron inmediatamente después de la cirugía, cortados en bloques, y después se fijaron en formol e incluidos en parafina. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Antes de microdisección, se cortaron ocho secciones en serie 8 mm (-25 ° C) del mismo bloque de tejido y se colocan en portaobjetos (1 mm), que fueron entonces desparafinaron tiñeron con hematoxilina y eosina. Luego fueron microdissected usando el sistema de PALM Laser MicroBeam (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried, Alemania). Una superficie total de 200.000 m
2 se micro-disecados de cada diapositiva. La Figura 1 muestra imágenes de diferentes etapas del proceso de microdisección. a continuación, se extrajo el ARN de las muestras microdiseccionadas el Kit de Aislamiento de ARN RNeasy MinElute (Qiagen, Courtaboeuf, Francia).
N = colon normal, T = tumor, A = adenoma. 1: hematoxilina y eosina; 2: áreas a ser microdissected se han marcado; 3: ranura siguiendo la microdisección de las áreas marcadas; 4:. Microdisecado tejido tras catapultar hacia el interior de las tapas eppedORF
Colección, la manipulación y extracción de ARN a partir de tejido colorrectal-macro diseccionado
Hemos querido investigar si existía una relación entre la actividad de p53 y la expresión de
GAS5
-snoRNAs en el tejido colorrectal humano, y en particular en muestras de tumores colorrectales. Se recogieron muestras pareadas de tejido fresco congelado colorectal tumor y el tejido colorrectal normal correspondiente de 20 pacientes individuales y medimos miR-34a y niveles snoRNA y la expresión de p53 en estas muestras. Las muestras de tejido colorrectal normal adenomatosa y malignas se obtuvieron de individuos sometidos a cirugía colorrectal o colonoscopia entre 2011 y 2013 en el Hospital de Santa María, Londres, Reino Unido. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. Las muestras se macrodissected inmediatamente en el momento de la cirugía, se coloca directamente en el ARN
Más tarde
solución de estabilización (Qiagen, Hilden, Alemania), almacenado a temperatura ambiente durante 2-3 horas, y luego se congeló a -80 ° C. H & amp; E tinción se utiliza para la confirmación histológica del cáncer y para determinar la celularidad de secciones representativas. Un patólogo especialista colorrectal revisó los toboganes, y el tejido para el aislamiento de ARN fue verificado que contiene ≥60% de células neoplásicas. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes, y la aprobación ética fue proporcionada por el comité de ética de la investigación del hospital. tejido fresco almacenado en RNA
Más tarde
(Qiagen) fue aplastado en nitrógeno líquido y el polvo posterior se lisaron en Trizol (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y reactivo de aislamiento de ARN se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
cultivo de células y doxorrubicina tratamiento
p53 de tipo salvaje (WT) y las células HCT116 knockout (KO) y Dicer WT y desmontables (KD) líneas celulares fueron amablemente proporcionados por el Dr. Bert Volgestein [26], [ ,,,0],27]. Las células se sembraron en placas de 150 mm a una confluencia del 50% y se incubaron bajo a 37 ° C en un incubador humidificado de CO2 al 5%. Ellos fueron tratados con doxorrubicina a una concentración de 0,2 volumen ug /ml o equivalente de vehículo (ddh
20). Después de cada punto de tiempo de tratamiento, los platos se colocaron en hielo y medio se aspiró. Las células se lavaron dos veces con PBS frío, rasparon y se centrifugaron durante 5 minutos a 1300 rpm. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se procesó para el ARN utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) y /o la extracción de proteínas.
cuantificación de ARN y RT-qPCR Análisis
Cuantificación de extrajeron ARN se realizó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, EE.UU.) y su calidad fue analizada utilizando el ARN 6000 kit Pico LabChip y el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) o por medio de la no desnaturalización gel de agarosa electroforesis. El ARN total (10 ng) se transcribió de forma inversa en ADNc usando el kit TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems) usando un cebador específico para cada maduro miARN, snoRNA o snRNA.
U6
y
U19 gratis (pequeños ARN nucleolar) se utilizó como controles endógenos para la normalización como se describe anteriormente [28]. QRT-PCR se realizó a través de assaykit TaqMan microARN (Applied Biosystems). La mezcla de reacción consistía en 10 l de TaqMan 2x mezcla maestra universales, 1 l de mezcla TaqMan 20x, 1 ng de ADNc en un volumen final de 20 l. Quantitative PCR en tiempo real (qPCR) se realizó con un sistema de detección de secuencia ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Los datos fueron analizados utilizando el software qBasePlus (biogazelle). Niveles que se muestran son la media de tres repeticiones de ADNc independientes. La normalización se realizó mediante el método de Ct delta.
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y Western Blot
Los sedimentos celulares o muestras de tejidos frescos congelados fueron lisadas en 30 a 60 l de tampón de lisis NP-40 + se recogieron inhibidores de la proteasa solución cóctel (Roche) y la fase de proteína después de la centrifugación. La concentración de proteína se calculó utilizando el Kit Reactivo de Bradford (BioRad). Las lecturas de absorbancia se midió a 595 nm usando un espectrofotómetro Beckman DU 530 espectrofotómetro UV Ciencias de la Vida /Visible. Después de la recogida de datos, se determinó la concentración de las muestras desconocidas basado en el valor de absorbancia estándar. Las muestras de proteína fueron entonces expuestos a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa Hybond súper C (GE Healthcare) y luego se transfirieron para la proteína de interés. Las membranas se lavaron y se utilizó un aumento de quimioluminiscencia (ECL) sistema de detección (GE Healthcare) para la visualización. La fluorescencia emitida se detectó usando Hyperfilm ECL (GE Healthcare) el SRX-101A desarrollador de rayos x.
Análisis estadístico
análisis bioestadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante t-test o coeficientes de correlación de Pearson de Student.
Resultados
daño se incrementa de ADN inducida por doxorrubicina
GAS5
-deriveded expresión ARNsno de una manera dependiente de p53 en líneas celulares de cáncer colorrectal
Se han tratado p53 HCT116
WT y p53 HCT116
KO células con doxorubicina con el fin de inducir daño en el DNA, y se utiliza RT-qPCR para medir los cambios inducidos en los niveles de expresión de varios ARNs pequeños, en particular el
GAS5
-derivado snoRNAs U44 y U47. el tratamiento con doxorubicina en p53 HCT116
líneas de células WT condujo a una inducción significativa en la expresión de la
GAS5
-derivado snoRNAs U44 (P & lt; 0,01) y U47 (P & lt; 0,01) en comparación con el tratamiento con una vehículo de control, pero no hubo ningún cambio significativo en los niveles de la no
GAS5
-asociado snoRNA U19 (Figura 2) o la U6 snRNA que no derivan de la locus GAS5 cuando se compara con la expresión de GAPDH (datos no mostrado). el tratamiento con doxorubicina no aumentó significativamente
GAS5
expresión ARNsno -derivado de p53 HCT116
células KO (Figura 2), lo que sugiere que el daño del ADN inducido por la expresión de la
GAS5
snoRNAs en -derivado de una manera dependiente de p53. tratamiento doxorrubicina de p53 HCT116
WT células también aumentó significativamente la expresión de miR-34a (P≤0.006), utilizado como control positivo, aunque el tamaño de las veces el cambio variar dependiendo de que se seleccionó ARN pequeño para normalizar los niveles de expresión a (Figura 2 & amp; 3). Después de 24 horas de tratamiento con doxorubicina, la expresión de miR-34a aumentó significativamente por 2,8 veces y 2,6 veces (P≤0.006 para ambos) cuando los niveles se normalizaron a U6 y U19 respectivamente. Sin embargo, aunque sigue siendo estadísticamente significativa, los factores de cambio en los niveles de expresión de miR-34a eran mucho más pequeños (1,9 veces; p & lt; 0,01) cuando el
GAS5
-derivado snoRNAs U44 y U47 se utilizaron para la normalización (figura 3). Se observaron diferencias similares cuando se utilizó p21 como un control positivo (datos no mostrados). Análisis de p53 secuenciación inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP-seq) experimentos realizados en células HCT116 [29] indica la presencia de un pico significativo de la interacción p53 en dos experimentos independientes que implican la activación de p53 inducida por Nutlin3 o 5'fluorouracil (5FU)), en el misma posición, de aproximadamente 800 pb del sitio de inicio de la transcripción GAS5 (TSS), lo que indica que p53 controla directamente la transcripción GAS5.
los niveles relativos de (A) miR-34a, (B) U19 snoRNA, (C) U44 snoRNA y (D) U47 snoRNA se midieron por RT-qPCR en p53
líneas de células WT HCT116 y p53
líneas de células KO HCT116 tratados con doxorrubicina (a una concentración final 0,2 ug /ml) o vehículo para 24 horas. Los niveles se normalizaron a los niveles y los datos de ARNsn U6 se presentan con relación al vehículo células tratadas ± SEM (cada uno de ellos realizado por triplicado; prueba de la t de Student: * P & lt; 0,01, ** P≤0.006).
Los niveles relativos de miR-34a normalizados para (a) U6 snRNA, (B) U47 snoRNA, (C) U44 snoRNA y (D) U19 snoRNA se midieron por RT-qPCR en p53
líneas de células WT HCT116 y p53
líneas de células KO HCT116 tratados con doxorrubicina (a una concentración final 0,2 ug /ml) o vehículo durante 24 horas. Los datos se presentan en relación con las células tratadas con vehículo ± SEM. (Cada uno de ellos realizado por triplicado; prueba de la t de Student: * P & lt; 0,01, ** P≤0.006) guía empresas
GAS5
expresión ARNsno -derivado varía entre el tejido fresco colorrectal normal y maligno no microdisecado de una manera dependiente de p53
Se encontraron diferencias significativas en los niveles de expresión de la
GAS5
snoRNAs -derivado entre emparejados muestras de tejido fresco congelado normal, colorrectal y tumor colorrectal del mismo paciente (P & lt; 0,01; Figura 4). niveles snoRNA fueron significativamente mayores en los tumores en comparación con el tejido colorectal normal correspondiente en el 85% de muestras de pacientes, pero fueron significativamente inferiores en 15%. No hubo diferencia significativa en los niveles U6 snRNA entre las muestras normales y tumorales emparejadas. Curiosamente, los niveles de miR-34a también fueron significativamente mayores en muestras de tumores de pacientes en comparación con sus correspondientes muestras de tejido colorrectal normales (P≤0.0006; Figura 4). A continuación, medir los niveles de expresión de p53 en el tejido colorrectal normal, emparejado y muestras de tumores colorrectales con Western Blot (Figura 5A-C). los niveles de p53 fueron significativamente mayores en los tumores de colon en comparación con sus correspondientes muestras normales de tejido colorrectal (P & lt; 0,01; Figura 5D).
Un diagrama de cajas que compara los niveles relativos de expresión de miR-34a, U44 snoRNA y U47 snoRNA entre tumor colorrectal emparejado (T) y frescas muestras de tejido congelado colorrectal normal (N). (Prueba de la t de Student * P & lt; 0,01, *** P≤0.0006) guía empresas
(A & amp; B). Niveles de p53 muestra de Western blot en los primeros 10 colorrectal normal (A) y el tumor colorrectal ( muestras B) de tejidos. GAPDH se utilizó como control de carga. (C) Gráfico de columnas que demuestra los cambios veces en los niveles de expresión de p53 que se muestran en las transferencias de Western (A & amp; B) normalizaron a GAPDH y se calcula utilizando el software ImageJ. (D) Un diagrama de caja comparar los niveles relativos de expresión de p53 entre los 25 pares de tumor colorrectal (T) y muestras de tejido colorrectal normal (N) (prueba de la t de Student * P & lt; 0,01).
Uso las mismas muestras, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson, la comparación de los niveles de expresión de p53 con U44 y U47 snoRNA niveles, para determinar si existía alguna relación entre el
GAS5
-derivado niveles snoRNA y p53
in vivo en
los seres humanos. Se encontró una fuerte correlación positiva entre los niveles de expresión de p53 y los niveles tanto de ARNsno U44 (Correlación de Pearson = 0,64; I
2 lineal = 0,41; p = 0,02) y ARNsno U47 (Correlación de Pearson = 0,69; I
2 lineal = 0,49; P = 0,01) en muestras de tumores colorrectales (Figura 6A). También se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para comparar los niveles de expresión de miR-34a con U44 y U47 snoRNA niveles, para determinar si existía alguna relación entre los niveles de
GAS5
snoRNAs -derivado y miRNAs regulados por p53 en humanos. Esto también se realizó para proporcionar evidencia en apoyo de la utilización de miR-34a como un marcador sustituto para p53 en este contexto para experimentos adicionales usando ARN derivado de microdissected muestras de tejido FFPE en los que los niveles de p53 no eran medibles mediante transferencia Western. Curiosamente, encontramos una fuerte correlación positiva entre los niveles de expresión de miR-34a y los niveles tanto de ARNsno U44 (Correlación de Pearson = 0,73; I
2 lineal = 0,53; p = 0,001) y ARNsno U47 (Correlación de Pearson = 0,66; I
2 lineal = 0,43;. P = 0,02) en muestras de tumores colorrectales (Figura 6B)
Gráficos que muestran los análisis de correlación de Pearson de la relación entre los niveles de p53 () a o B) los niveles de miR-34a (y la U44 y U47 snoRNAs en muestras de tejido tumoral colorrectal (a & amp; B).
GAS5
expresión ARNsno -derivado varía entre el tejido colorrectal FFPE microdisecado normales, pre-malignas y malignas y los niveles se correlacionan con la expresión de miR-34a
Hay un gran debate en cuanto a la precisión de los estudios de ARN y la expresión de genes que utilizan muestras tumorales no microdissected, debido a los posibles efectos que los componentes celulares del estroma circundante puede tener sobre los niveles de la molécula de medida. Por lo tanto, nos propusimos llevar a cabo más experimentos en muestras de tejido microdissected para apoyar los resultados anteriormente. Hemos recogido 60 muestras de tejido colorrectal no apareados FFPE consistentes en la mucosa normal 20, 20 adenomas y 20 muestras de tumores. Nos microdisecado las porciones requeridas después de H & amp; E tinción, realizaron la extracción de RNA y medidos pequeños niveles de expresión de ARN por RT-qPCR (Figura 1). Se encontraron niveles significativamente más altos de miR-34a (P≤0.006), U44 snoRNA (P≤0.0005) y U47 snoRNA (P≤0.0005) en muestras de adenoma en comparación con muestras de mucosa normal (Figura 7A). Además, la expresión de los 3 ARNs pequeños fue significativamente mayor en las muestras tumorales en comparación con adenoma o muestras de mucosa normal (Figura 7a). Además, los niveles de p53 medidos por inmunohistoquímica y dan como una puntuación de p53 de 0-3, fueron mayores en las muestras de tumores (80% = puntuación de 3, 20% = puntuación de 2) y las muestras de adenoma (50% = puntuación de 3, 30% puntuación de 2, 20% puntuación de 1) que el tejido normal (100% = puntuación de 0).
a, RT-qPCR se utilizó para medir los niveles relativos de expresión de miR-34a, ARNsno U44 y snoRNA U47 en muestras de tejidos humanos microdissected correspondiente al tejido colorrectal normal (N), adenoma colorrectal (a) y los tumores de colon (T) (prueba de la t de Student * P & lt; 0,05, ** P≤0.006, *** P≤0.0005) . B, se realizó un análisis de correlación de Pearson para determinar la relación entre los niveles de miR-34a y la U44 y U47 snoRNAs en muestras de tejido tumoral colorrectal FFPE microdisecado.
El uso de las mismas muestras, que luego se calculó la correlación de Pearson para comparar los coeficientes de miR-34a niveles de expresión y U44 y U47 snoRNA niveles para determinar si la relación demostrada en muestras no microdissected entre
GAS5
-derivado niveles snoRNA y p53 (miR-34a se utiliza aquí como un marcador sustituto para p53) también se observó en los tumores colorrectales microdissected. Se encontró una fuerte correlación positiva entre los niveles de expresión de miR-34a y los niveles tanto de ARNsno U44 (Correlación de Pearson = 0,69; I
2 lineal = 0,47) y ARNsno U47 (Correlación de Pearson = 0,67; I
2 lineal = 0,45) en muestras de tumores colorrectales (Figura 7B).
La expresión de
GAS5
-derivado snoRNAs no se ve afectada en líneas celulares de cáncer colorrectal en la que Dicer ha sido derribado y por lo tanto no se puede hacer parecen ser procesados por Dicer
a la vista de los hallazgos descritos en estudios previos que demostraron que snoRNAs se puede convertir por Dicer para sdRNAs con las funciones de los genes miARN-como es posible que las moléculas de miRNA-como producidos a partir de snoRNAs GAS5 derivados están implicados en la respuesta al daño de ADN [3]. Para investigar la posible implicación de Dicer en este proceso se evaluó el efecto de Dicer knock-down en la expresión de
GAS5
snoRNAs -derivado tras el daño del ADN. Para lograr esto hemos utilizado RT-qPCR para comparar los cambios en la expresión de la U44 snoRNAs y U47 después del tratamiento con doxorubicina en las líneas celulares de cáncer colorrectal DLD1 y RKO en su tipo salvaje forma (WT) y en una forma en la que había sido Dicer de forma estable desmontados (KD). Curiosamente, encontramos que a pesar de Dicer knock-down condujo a una reducción estadísticamente significativa en los niveles de miR-34a (P≤0.006) en ambas líneas celulares DLD1 y RKO, como se esperaba, no hubo ningún efecto sobre los niveles de ARNsno U44 o U47 snoRNA (Figura 8), lo que sugiere que la función de la
GAS5
snoRNAs -derivado en la respuesta de p53-regulado al daño del ADN no implicó su conversión en sdRNAs con los genes miARN función similar.
relativa niveles de U44 snoRNA (rojo), U47 snoRNA (azul) y miR-34a (púrpura) se midieron por RT-qPCR en DLD1 Dicer
líneas de células WT, DLD1 DICER
líneas celulares KD, RKO Dicer
líneas de células WT, RKO DICER
líneas celulares KD trataron con doxorubicina (a una concentración final 0,2 ug /ml) o vehículo durante 24 horas. Los datos se presentan en relación con el vehículo tratada líneas celulares (línea punteada) ± SEM correspondientes (cada uno de ellos realizado por triplicado; prueba de la t de Student: * P & lt; 0,01, ** P≤0.006).
discusión
Nuestros resultados demostraron una relación entre la actividad de p53 y la expresión de la
GAS5
snoRNAs -derivado en líneas celulares de cáncer colorrectal y el tejido colorrectal humano. Además, sugirieron que la transcripción de la
GAS5
gen está regulada directamente por p53, aunque serían necesarios estudios de inmunoprecipitación de cromatina para confirmar esto. Aunque no se han realizado estudios funcionales, estos hallazgos sugieren un papel importante para los
GAS5
snoRNAs -derivado en la respuesta celular p53-regulado al daño del ADN y en las vías de señalización de p53 asociado en el tejido colorrectal humano y el cáncer colorrectal .
Hasta Chang
et al.
(2002) [30] describió por primera vez el papel potencial de snoRNAs en la tumorigénesis, había habido poca justificación para la evaluación sistemática de la función de los snoRNAs en este o cualquier otra condición patológica. Sin embargo los datos son acumulando que enlazan una desregulación de la expresión de diversos snoRNAs para el desarrollo de una serie de tumores malignos [11], [25], [31], [32]. A medida que el
GAS5
gen alberga diez snoRNAs intrónicas y un lncRNA y se ha implicado en la oncogénesis y la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis [21] - [23], y dado el papel bien documentado para p53 en el mismo procesos, que tuvo como objetivo investigar más a fondo la relación entre p53 y la GAS5 snoRNAs para ganar una mayor comprensión de su papel potencial en la tumorigénesis. Se encontró que, en líneas celulares de cáncer colorrectal, el
GAS5
snoRNAs -derivado fueron inducidos de manera dependiente de p53 tras DOX estimulada daño en el ADN, pero que esto afectará no se perdió cuando Dicer fue eliminado funcionalmente hacia abajo. Esto sugiere que estos snoRNAs no se procesaron en sdRNAs con los genes miARN función similar, y que su papel en la respuesta al daño del ADN no les obligan a ser procesados de esta manera. Esto indica que estos snoRNAs podrían estar involucrados en la coordinación de la respuesta mediada por p53 a través de su papel en la regulación del ribosoma. snoRNAs son cruciales para la función del ribosoma y la regulación efectiva de la traducción [2] y p53 es un mediador clave de la biogénesis de ribosomas especialmente en respuesta a la llamada de estrés nucleolar [33]. Además, p53 se ha demostrado que median el enlace de señalización entre la biogénesis de ribosomas y el ciclo celular [34]. Por tanto, parece lógico que el
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snoRNAs -derivado podría ser inducida directamente por la transcripción tras el daño del ADN mediada por p53 con el fin de afinar los de la maduración post-transcripcional y modificación de rRNAs y para asegurar una traducción más eficaz de los genes necesarios para coordinar una respuesta a una tensión tal. Esta teoría requiere claramente evaluación experimental adicional no menos importante, demostrando que hay un aumento en la localización de estos snoRNAs al ribosoma en lugar de un compartimiento celular alternativo después del daño de ADN. Es posible que estos snoRNAs no actuar en un lugar distinto del ribosoma y para que tengan sdRNA función de tipo pero que no requieren procesamiento de Dicer para permitir esto. Si estos daños en el ADN inducido
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snoRNAs -derivado simplemente funcionan para dar cabida a un aumento en la traducción de genes en el ribosoma o si realmente son procesados para sdRNAs y tienen la función adicional, independiente, su efecto sobre la expresión génica podría ser evaluado a través de sobreexpresión experimentos seguidos de los experimentos de genes de perfiles.