Extracto
Antecedentes
interacciones recíprocas entre el epitelio y el estroma desempeñar un papel vital para el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión. secreciones mejoradas de citoquinas y factores de crecimiento de los fibroblastos asociados con cáncer en los tumores de próstata crean un microambiente favorable para las células cancerosas para crecer y metástasis. Nuestro trabajo anterior mostró que el receptor de progesterona (PR) se expresa específicamente en los fibroblastos del estroma de la próstata y células de músculo liso. Sin embargo, los niveles de expresión de PR y su impacto al microambiente tumoral en los tumores de próstata son poco conocidos.
Métodos
ensayos de inmunohistoquímica se aplican a las biopsias de tejido de próstata humano. ensayos de migración celular, invasión y proliferación se realizaron con células de la próstata humanos. PCR en tiempo real y ELISA se aplican para medir la expresión génica a nivel molecular.
Resultados
ensayos de inmunohistoquímica mostró que los niveles de proteína de PR se redujeron en el cáncer asociado estroma en comparación con estroma prostático normal emparejado. Con
in vitro y modelos de células del estroma de la próstata, que mostró que los medios condicionados recogidos de células estromales positivos PR inhibieron la migración de células de cáncer de próstata y la invasión, pero tuvo efectos supresores de menor importancia en la proliferación de células cancerosas. PR suprime la secreción de estroma derivadas del factor 1 (SDF-1) y la interleucina-6 (IL-6) por células del estroma independiente a PR ligandos. Bloqueo de la expresión de siRNA PR o la administración de suplementos de exógena SDF-1 o IL-6 a medios acondicionados de células estromales PR positivos contrarrestado los efectos inhibidores de PR a la migración de células de cáncer y la invasión.
Conclusiones
disminución de la expresión de la PR en el cáncer asociado estroma puede contribuir a la elevación de SDF-1 e IL-6 niveles en los tumores de próstata y mejorar la progresión del tumor de próstata
Visto:. Yu y, Lee JS, Xie N, e Li , Hurtado Coll-A, Fazli L, et al. (2014) Las células estromales de próstata expresan el receptor de progesterona al control de la movilidad Cancer Cell. PLoS ONE 9 (3): e92714. doi: 10.1371 /journal.pone.0092714
Editor: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de diciembre de 2013; Aceptado: February 24, 2014; Publicado: 24 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Yu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de los Institutos canadienses de Investigación en Salud de subvención de funcionamiento (MOP- 97934), Rising Star Award y Discovery subvención del cáncer de próstata Canadá a XSD y piloto de donaciones PNW cáncer de próstata SPORE a XSD y MG. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los tumores de próstata tienen múltiples poblaciones de células. Las células cancerosas están rodeados de ambiente celular no epiteliales consiste en fibroblastos, células musculares lisas y miofibroblastos. evidencias acumuladas muestran que recíprocas interacciones epitelio-estroma son críticos para el desarrollo de tumores, el crecimiento y la metástasis [1], [2]. Por ejemplo, la línea celular epitelial prostática benigna BPH-1 es por lo general no tumoral en ratones desnudos. tumores Sin embargo, cuando se combina con carcinoma asociado fibroblastos (CAF) e injertado en la cápsula renal, las células HPB-1 formado [3]. Estos hallazgos demuestran que las células del estroma juegan un papel crucial en la transformación maligna. A través de la secreción de citocinas y factores de crecimiento, CAF también proporcionan un microambiente de soporte para facilitar el crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis [4], [5]. Sin embargo, a pesar de estos papeles críticos del estroma en el cáncer de próstata (CaP), el estroma de próstata estrategia terapéutica de orientación es en gran medida poco apreciado. Esto refleja nuestro limitado conocimiento sobre las interacciones estroma-epitelio en los niveles celular y molecular.
Se sabe que el cáncer de estroma asociado aumenta la secreción de varias citoquinas, que son componentes importantes del microambiente tumoral [6]. células estromales derivadas del factor-1 (SDF-1) es secretada por los fibroblastos del estroma y actúa mediante la unión a su receptor, CXCR4, en la membrana de las células epiteliales para activar múltiples vías de señal [7] - [10]. El SDF-1 /CXCR4 eje se ha demostrado que facilita la invasión de células de cáncer, la angiogénesis del tumor [11], [12], estimular la proliferación celular [13], [14] y proteger las células de la apoptosis quimioterapéutico inducida por fármacos [15] - [ ,,,0],17]. los niveles de ARNm de SDF-1 se incrementan en tejidos de cáncer en comparación con los tejidos benignos adyacentes [18] y son los más altos en el CaP metastásico [19]. Por otra parte, la expresión de CXCR4 también es elevada en los tejidos de CaP [19], lo que amplifica aún más las acciones del SDF-1. La interleucina 6 (IL-6) también es una citoquina importante que puede estimular las quinasas Janus /transductor de señales y activador de la transcripción 3 vía en células de cáncer [20]. Tanto SDF-1 e IL-6 pueden activar el receptor de andrógenos (AR) a bajos niveles de andrógenos en células de CaP y contribuir a la progresión del tumor a la etapa de la castración resistente [21] - [23]. IL-6 se informó para mejorar la proliferación celular CaP y proteger las células de la apoptosis en xenoinjertos de tumores [24], [25]. IL-6 niveles séricos elevados también mostraron ser un marcador de mal pronóstico [26], [27].
células del estroma de la próstata también expresan varios receptores de esteroides, incluyendo los andrógenos y los receptores de estrógeno. Se informó Estos receptores a ser importante para las células del estroma para dirigir el desarrollo PCa a través de modulación de la expresión de citocinas /quimiocinas [28] - [30]. Recientemente hemos informado de que ambas isoformas del receptor de progesterona (PR), PRA y PRB, se expresaron específicamente en el estroma de la próstata y la proliferación de células del estroma negativamente regulados [31]. En este estudio, hemos ampliado nuestros esfuerzos para medir los niveles de proteína PR en el CP y la regulación de relaciones públicas de SDF-1 e IL-6 expresión en las células del estroma de la próstata.
Materiales y Métodos
Los tejidos de la próstata humana La inmunohistoquímica y
Veintisiete secciones completas de montaje de biopsias de tejido de la próstata humana se obtuvieron de las prostatectomías radicales. La información detallada de cada muestra de tejido se enumeran en la Tabla 1. Todos los pacientes firmaron un consentimiento informado a un protocolo que fue revisado y aprobado por la Junta de Ética de Investigación Clínica de la UBC (Certificado #: H09-01628). Inmunohistoquímica (IHC) los ensayos se realizaron usando Ventana Descubrimiento XT de tinción automática (Ventana Medical Systems) con anticuerpos contra PR (AbCam) y PRB (Señalización Celular) como se informó [31]. Las imágenes digitales de tejido diapositivas fueron escaneados por un sistema de escáner BLISS (Bacus Lab Inc). Dentro de las zonas periféricas, 5 campos del estroma (& gt; 1000 núcleos) fueron elegidos por el patólogo (L. F.) adyacente a las células epiteliales benignas y otros 5 campos del estroma fueron a partir de células epiteliales cancerosas adyacentes. Otros cinco campos del estroma fueron de las zonas de transición. Las puntuaciones patológicas se lograron mediante el software Digital Image Hub (Leica Biosystem) para calcular el porcentaje de núcleos teñidos y la intensidad de la tinción. Los niveles relativos de PR y PRB se calcularon como el índice de HSCORE = Σpi (i + 1), donde i = intensidad de la tinción, y pi = el porcentaje de células teñidas. HSCOREs se utilizaron para comparar los niveles de PR y PRB entre estroma normal y el cáncer y entre las zonas periféricas y las zonas de transición.
próstata líneas celulares estromales
línea de células del estroma prostático humano (WPMY-1 ) y líneas de células de CaP LNCaP y PC-3 se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). C4-2B células LNCaP derivados fueron adquiridos de Urocore (Oklahoma City, OK, EE.UU.). LNCaP, C4-2B y células PC-3 expresan niveles detectables de ARNm y proteínas PR. fibroblastos asociados con el cáncer humano (hCAFs) fueron amablemente proporcionados por el Dr. Simon Hayward (Universidad de Vanderbilt). Ellos se derivaron de los fibroblastos asociados con el cáncer de cultivos primarios humanos [2]. las células del estroma de la próstata humanas primarias, HPS-19I, fueron generosamente proporcionadas por el Dr. David Rowley (Baylor College of Medicine) [4]. Exógenos PRA y PRB se introdujeron en WPMY-1, HCAF y HPS-19I por lentivirus como se describe [31]. los niveles de expresión de proteínas, así como la localización celular de PRA y PRB se confirmaron (Figura S1). Todos los experimentos utilizando hCAFs estaban dentro de 8-10 pases de células y las células HPS-19I estaban dentro de 5-6 pasajes sobre recibido de los proveedores.
cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total fue extraído por medio de Trizaol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Dos microgramos de RNA total se sometió a una transcripción inversa cebada aleatoriamente utilizando SuperScritpt 2 transcriptasa inversa (Invitrogen). PCR en tiempo real se llevó a cabo por triplicado usando Applied Biosystem 7900 HT con 5 ng de ADNc, 1 mM de cada par de cebadores y SYBR Green PCR master mix (Roche). El primer secuencias se enumeran en la Tabla S1. relativa niveles de mRNA se normalizaron a GAPDH. SiRNA dirigidos PR fue adquirido de Thermo Fisher (Cat N. J-003433-08-0005).
Colección de medio condicionado
El noventa por ciento hCAFs confluentes, WPMY-1 y HPS-19I del estroma las células se lavaron dos veces con tampón PBS y se repone con medio DMEM libre de suero en presencia de vehículo, P4 o PR RU486 antagonista durante 48 horas. Las concentraciones de proteína de medio condicionado (CM) se midieron mediante ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Scientific). Se usó la misma cantidad de CM de relaciones públicas positivas y negativas de las células para el tratamiento de células de CaP para ensayos de migración celular, invasión y proliferación.
Ensayo ELISA
SDF-1 e IL-6 en las concentraciones de CM se midieron mediante el kit ELISA comercial siguiendo el protocolo del fabricante (R & amp; D Systems, Cat #: DSA00 y D6050).
Curación de heridas Ensayo
células PC-3 se cultivaron en medio que contiene 5% de carbón vegetal despojado de suero en placas de 6 pocillos hasta 100% de confluencia. Una punta de pipeta 20 l se utilizó para cero para crear una herida en la monocapa confluente en el centro de platos. las células desprendidas se retiraron mediante lavado con tampón de PBS dos veces. Las células fueron rellenadas con 300 ug de CM de hCAFs ó 1400 ug de CM a partir de células WPMY-1. La migración de células fueron capturados posteriormente por un microscopio invertido (Axiovert 200 M, Alemania) a las 0 hy 24 h los valores post herida cero. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Ensayo de Migración Celular
PC-3 células (2,5 × 10
4 /pocillo) o células C4-2B (5.0 × 10
4 /pocillo) se suspendieron en medio DMEM libre de suero y se sembraron en la cámara de control BD sin Matrigel (BD Biosciences). Quinientos microgramos de CM de células WPMY-1 se añadieron a la cámara inferior. Después de la incubación de 37 C con 5% de CO2 durante 18 horas, las células no migratorias en la cámara superior se retiraron con cuidado por los hisopos de algodón. Las células que llegaron a la cámara inferior se fijaron, se tiñeron con medio de montaje que contiene DAPI (Vector Laboratories, EE.UU.) y se fotografiaron en un microscopio invertido (Axiovert 200 M, Alemania). El número de células se contaron por el software Image J. tasa de migración celular se calibra para el número de células incubadas con CM de células parentales WPMY-1 como uno. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
invasión celular Ensayo
PC-3 células (2,5 × 10
4 /pocillo) o células C4-2B (1,0 × 10
5 /pocillo) se suspendieron en medio DMEM libre de suero y se sembraron en Matrigel BD cámara de invasión (BD Biosciences). Cien microgramos de CM de hCAFs, 500 ug de CM a partir de células WPMY-1 o 375 ug de CM a partir de células HPS-19i se añadieron a la cámara inferior. Después de la incubación en 37 C con 5% de CO2 durante 18 horas, las células no invasora en la cámara superior se retiraron suavemente por hisopos de algodón. Las células que invadieron a través de la Matirgel y llegó a la cámara inferior se fijaron, se tiñeron con medio de montaje que contiene DAPI (Vector Laboratories, EE.UU.) y fotografiado por un microscopio invertido (Axiovert 200 M, Alemania). el número de células invadidas se contaron por el software Image J. tasa de invasión de la célula se calculó por el número de células invasoras a través Matrigel divide el número de células que migran a través de la membrana de inserción sin recubrir. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
se realizaron Inmunoprecipitación de cromatina
cromatina ensayos de inmunoprecipitación como se describe anteriormente [32], [33] con las modificaciones siguientes. cromatina reticulada formaldehído se inmunoprecipitó con anticuerpo acetilado histona 3 (AbCam). Los fragmentos de ADN eluidos fueron utilizados como las plantillas para realizar PCR en tiempo real en el PRISM 7900 HT sistema ABI (Applied Biosystems) utilizando el FastStart universal SYBR Green Master (Roche). Enriquecimiento de fragmentos de ADN inmunoprecipitadas se determinan por el valor de ciclo umbral (Ct). Los datos se calculan como un porcentaje de la entrada. ChIP datos se obtuvieron a partir de cuatro experimentos independientes con muestras por triplicado. Los datos se presentan como media ± E.E.M. Los cebadores para la SDF-1 promotor son 5 ': tggctctcccctctaagc y 3': ggctgacggagagtgaaagt. Los cebadores para GAPDH son promotor 5 ': agtgcctaggctccagatca y 3':. Ctcttcccacaaatgctggt
El análisis estadístico
Los datos se presentan como medias ± SEM que se calcula a partir de tres o más experimentos independientes. significaciones estadísticas se calcularon utilizando un modelo lineal y emparejados prueba t de Student utilizando GraphPad Prism (versión 4) con el nivel de significación de P & lt; 0,05 como *, P & lt; 0,01 como ** y P & lt; 0,001 como *** .
resultados
PR niveles de proteína se redujo en los tumores de próstata
Hemos recogido 27 secciones todo el montaje de las biopsias de tejido de próstata humano de los pacientes tratados con prostatectomía radical (Tabla 1) . Los pacientes son 46 a 88 años de edad, con puntuaciones de Gleason de 6 a 9 y estadios tumorales que van desde T2A a T3B. El uso de ensayos IHC, se detectaron tanto PR total y isoformas PRB en los núcleos de una parte de las células del estroma de próstata (figura 1A-B). Sin embargo, HSCORE de PR (cálculo combinado de intensidad y percentil de núcleos positivos) era 41% menor (P = 0,001) en el cáncer asociado estroma en comparación con estroma normal de emparejado en zonas periféricas de la próstata (figura 1C). Además, estroma HSCORE del PRB en el cáncer asociado era alrededor del 44% más bajo que en el estroma normal (p = 0,004) (Fig.1D). Actualmente, no hay anticuerpo específico para detectar PRA isoforma. Teniendo en cuenta el hecho de que tanto PR total y disminución PRB en grados similares, es probable que los niveles de expresión de ERP siguen la misma tendencia que el PRB. No hubo diferencias significativas en cualquiera de PR o PRB HSCORE entre zonas periféricas benignos y zonas de transición (figura 1C-D). No hubo diferencias estadísticamente significativas de relaciones públicas o de proteínas totales PRB niveles en asociación con la puntuación de Gleason y la concentración de PSA sérico entre estos 27 pacientes. En conjunto, estos resultados indican que los niveles de relaciones públicas se redujeron en el cáncer de estroma asociado.
secciones de todo el montaje de las biopsias de próstata humanos (n = 27) fueron a inmunotinción con el anticuerpo PR (AbCam) o anticuerpo PRB (Señalización Celular). se muestran imágenes IHC representativos de PR (A) y PRB (B) de las zonas periféricas benignas, las zonas periféricas de cáncer y zonas de transición. IHC tinción de PR (C) y (D) PRB los niveles de proteína en emparejado benigna
vs zonas periféricas
cáncer y en emparejado benigna periférica
vs zonas de transición
de 27 secciones todo el montaje de las biopsias de próstata humanos fueron anotados por digital Image Hub (Leica Biosystems). índices HSCORE se representaron como ± SE. Unidireccional prueba t de ANOVA y emparejado estudiante de calcular el nivel de significación.
PR estroma inhibe la migración celular y la invasión CaP
Con el fin de estudiar las funciones de relaciones públicas a nivel celular, hemos aplicado varios modelos de células del estroma prostático humano incluyendo hCAFs, WPMY-1 y HPS-19I. Estas células expresan bajos niveles de mRNA PR, pero los niveles no detectables de la proteína PR. Introdujimos PRA exógeno o isoforma PRB en estas células por lentiviral enfoque según ha informado [31], lo que nos ha permitido estudiar la función de cada isoforma PR. Aunque las células WPMY-1 se derivan a partir de células estromales de cultivo primario de tejidos hiperplasia prostática benigna, estas células se inmortalizan por antígeno T grande de SV40. Tienen la capacidad tumorigénico similar a hCAFs, cuando se recombina con células de HPB-1 y se injerta bajo la cápsula renal de ratones (datos no publicados).
Curación
Para determinar el impacto de las relaciones públicas en las células del estroma de la migración de células de CaP, se realizó la herida ensayos. CM recogido de hCAFs PR-positivo y PR-negativas y células WPMY-1 en presencia de vehículo o 10 nM P4 se utilizaron para incubar con células PC-3. Los ensayos mostraron que la cicatrización de heridas CM de células positivas PR resultó en una disminución significativamente la migración celular (Figura 2A-B). tratamiento P4 a las células del estroma no tuvo impacto en la tasa de migración de células PC-3. La figura 2A-B mostró imágenes representativas de uno de tres experimentos independientes. También habíamos realizado ensayos de migración celular para confirmar aún más la acción independiente de ligando de PR en el control de la migración de las células cancerosas. PR células positivas WPMY-1 se trataron con dosis crecientes de P4, y se recogieron y se incubaron con 3 PC-células en ensayos de migración celular (Fig.2C) su CM. Hemos observado que P4 no tuvo impacto en PC-3 tasa de migración de las células, ni tampoco PR antagonista RU486 (Fig.2D). Estos resultados eran repetibles cuando sustituimos las células PC-3 con las células óseas metastásicas LNCaP derivados C4-2B (Fig.2E-F).
El medio condicionado (CM) se obtuvieron de hCAFs parentales, WPMY-1 o sus derivados que expresan las líneas celulares simulacro, ARP o PRB en presencia de vehículo o P4 10 nM. PC-3 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se incubaron con CM de hCAFs (A) o de células durante 24 horas en los ensayos de curación de heridas WPMY-1 (B). Imágenes representativas después del tratamiento CM 24 horas fueron capturados por un microscopio invertido. sus líneas celulares derivadas que expresan mock WPMY-1 y, PRA o PRB se trataron con 0, 10 nM y 100 nM de P4 durante 24 horas (C y E) o con vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 para 24 horas (D y F). CM se recoge y se incubó con células PC-3 (C-D) y C4-2B (E-F) en los ensayos de migración celular como se describe en la sección de materiales y métodos. ANOVA de una vía y la prueba t de Student pareado calcular la significación estadística de P & lt; 0,05 * y P & lt;. 0,001 *** como
Para determinar el impacto de las relaciones públicas en las células del estroma de CaP la invasión de células, que aplica los ensayos de invasión de Matrigel. CM se recogieron a partir de células PR-positivo y PR-negativas WPMY-1 tratados con vehículo, 10 nM o 100 nM de P4 (figura 3A). Hemos observado que la CM recogido de células positivas PR WPMY-1 como resultado 50-75% de disminución de la PC-3 invasión celular. Esta función PR no fue alterada por P4 o por RU486 (figura 3A-B). Además, también se observaron resultados similares cuando las células C4-2B se utilizaron en ensayos de invasión de Matrigel (Figura 3C-D). Por otra parte, también se repitieron los experimentos con CM recogidos de otras dos células del estroma de la próstata, hCAFs y HPS-19I. Demostramos que CM de PR hCAFs positivas o células HPS-19I resultaron en ~20-30% de disminución de la PC-3 invasión de células, que la función PR fue también independiente a P4 (Fig.3E-F). En conjunto, estos resultados indicaron que PR poseía función de supresión de la migración celular y la invasión CaP de una manera independiente de ligando
.
WPMY-1 y sus líneas de células derivadas que expresan mock, PRA o PRB se trataron con 0, 10 nM y 100 nM de P4 durante 24 horas (a y C) o con vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 durante 24 horas (B y D). CM se recogieron entonces y se incubó con las células en ensayos de invasión de células PC-3 (A-B) y C4-2B (C-D). hCAFs (E), HPS-19I (F) las células y sus líneas celulares derivadas expresan simulacro, ARP o PRB fueron tratados con 0, 10 nM y 100 nM de P4 durante 24 horas. CM se recogieron entonces y se incubó con células PC-3 en ensayos de invasión celular. tasa de invasión celular se calculó como se describe en la sección de Material y Método. ANOVA de una vía y la prueba t de Student pareado calcular la significación estadística establecida en p & lt; 0,05 * y P & lt; 0,001 *** como
Para estudiar el papel del estroma PR, el crecimiento de las células CaP
in vitro
, hemos realizado ensayos de proliferación celular (Figura S2). células LNCaP expresan un AR mutante que puede ser estimulada por P4. El tratamiento de las células LNCaP directamente con P4 en medio de cultivo resultó en 3 veces de inducción de la proliferación celular. CM recogido de hCAFs positivos PR en ausencia de P4 tenía efectos inhibidores estadísticamente significativas pero muy leves sobre el crecimiento celular LNCaP. Del mismo modo, también se observaron efectos supresores suaves cuando se utiliza CM recogido a partir de células positivas PR WPMY-1 en presencia de P4.
PR reprime SDF-1 e IL-6 expresión en las células del estroma de próstata
Dado que el nivel de proteína PR está disminuida en cáncer asociado estroma y CM a partir de células estromales positivos PR inhibir la invasión de células de CaP y la migración
in vitro
, que postula que el PR puede funcionar para suprimir los factores de secreción sintetizadas por las células del estroma y regular de próstata epitelio de una manera paracrina. Para probar esta hipótesis, los datos de microarrays de genes re-visitado de perfiles de genes regulados PR en células estromales de próstata [31]. Al estratificar todas las citoquinas y factores de crecimiento, se identificaron SDF-1 e IL-6 como los mejor clasificados genes cuyos niveles de mRNA fueron inhibidas por PR. Para confirmar estos hallazgos, se realizó la PCR en tiempo real y demostramos que la ERP inhibió el 70%, mientras que PRB inhibe el 80% de la SDF-1 mRNA nivel en hCAFs (Fig. 4A-B). Esta acción PR fue ligando independiente, ya que ni P4 ni RU486 tenido ningún impacto en la supresión de relaciones públicas para SDF-1 mRNA niveles. Es importante destacar que, suprimidas SDF-1 mRNA niveles de PR generado una disminución en la secreción de SDF-1 por las células del estroma de la próstata cuando se mide por ELISA (figura 4c). Además, se observó PR acción inhibidora sobre la SDF-1 de expresión no sólo en hCAFs, sino también en WPMY-1 (Fig.4D-E) y células HPS-19I (Fig.4F). También observamos efectos inhibidores similares de PR a la IL-6 ARNm y los niveles de proteína de una manera independiente de ligando (Fig.5). Es importante notar que PR no presenta un efecto supresor en general a todas las citocinas o factores de crecimiento. Varios factores de crecimiento, incluyendo bFGF, HGF, VEGF y KGF son o bien hasta reguladas o no alterado por PR y /o tratamiento P4 (Figura S3).
hCAFs y sus líneas celulares derivadas expresan simulacro, ARP o PRB eran tratados con vehículo, 1 (a) o el vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 (B) durante 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de SDF-1 con respecto a GAPDH. (C) hCAFs y sus líneas de células derivadas que expresan mock, PRA o PRB se trataron con vehículo o 10 nM de P4 durante 24 horas. CM se recogieron y se utiliza para medir los niveles de proteína SDF-1 por ELISA. sus líneas celulares derivadas que expresan mock WPMY-1 y, PRA o PRB se trataron con vehículo, 1 nM, 10 nM y 100 nM de P4 (D) o el vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 (E) para 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de SDF-1 con respecto a GAPDH. células (F) HPS-19I y sus derivados que expresan células Mock, PRA o PRB se trataron con vehículo o 10 nM de P4 durante 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de SDF-1 con respecto a GAPDH. ANOVA de una vía y seguido por la prueba t de Student calcular la significación establecida en p & lt; 0,01 como * y P & lt;. 0,001 *** como
hCAFs y sus derivados que expresan las células simulacro, ARP o PRB se trataron con vehículo, 1 (a) o el vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 (B) durante 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de IL-6 con respecto a GAPDH. (C) hCAFs y sus derivados que expresan células Mock, PRA o PRB se trataron con vehículo o 10 nM de P4 durante 24 horas. CM se recogieron y se utiliza para medir los niveles de proteína IL-6 por ELISA. WPMY-1 en las células y sus células derivadas expresan mock, PRA o PRB se trataron con vehículo, 1 nM, 10 nM y 100 nM de P4 (D) o el vehículo, 10 nM de P4 y /o 10 uM de RU486 (E) para 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de IL-6 con respecto a GAPDH. células (F) HPS-19I y sus derivados que expresan células Mock, PRA o PRB se trataron con vehículo o 10 nM de P4 durante 24 horas. PCR en tiempo real mide los niveles de ARNm de IL-6 con respecto a GAPDH. ANOVA de una vía y de la t de Student para calcular la significación establecida con P & lt; 0,01 como * y P & lt;. 0,001 *** como
Para confirmar PR mediada por la inhibición directa de la SDF-1 e IL 6 expresión génica, transfectadas transitoriamente las células del estroma de la próstata con siRNA contra PR (figura 6A-B). Aguda PR knockdown invierte drásticamente los efectos inhibidores de PR tanto a SDF-1 y IL-6 niveles de mRNA. Además, PR ejerce sus efectos inhibidores directamente a SDF-1 e IL-6 transcripción de genes y no requiere otra síntesis de proteínas, como PR permaneció supresor incluso en presencia de tratamiento con cicloheximida (Fig.6C-D). También se realizó el ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para mostrar que los niveles de acetilación de histonas en la región promotora SDF-1 se redujeron dramáticamente en las células del estroma positivos de relaciones públicas. Estos cambios fueron en contraste con el estado de acetilación de histonas en el promotor GAPDH (Fig.6E). En conjunto, estos resultados apoyan que la PR juega un papel directo en la represión de las actividades promotoras de SDF-1 e IL-6 genes e inhibe su transcripción de genes.
WPMY-1 células que expresan simulacro, ARP o PRB se transfectaron transitoriamente con Control de siRNA o siRNA contra PR. SDF-1 (A) y la IL-6 (B) los niveles de mRNA en relación con GAPDH fueron medidos por PCR en tiempo real. hCAFs que expresan simulacro, ARP o isoforma PRB fueron tratados con el control o 20 ug /ml de cicloheximida durante 16 horas. Los ensayos de PCR en tiempo real midieron los niveles de ARNm de SDF-1 (C) y IL-6 (D) con respecto a GAPDH. (E) WPMY-1 en las células y sus derivados que expresan células Mock, PRA o PRB se trataron con vehículo o 10 nM de P4 durante 24 horas. ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina se realizaron utilizando la histona acetil-3 de anticuerpos. Los fragmentos de ADN eluidos fueron sometidos a medir el enriquecimiento de acetil-histona 3 niveles en regiones SDF-1 y el promotor GAPDH. ANOVA de una vía y de la t de Student para calcular la significación establecida con P & lt; 0,01 como * y P & lt; 0,001 *** como
Con el fin de demostrar que la supresión PR-mediada de la SDF-1. e IL-6 expresión es el principal mecanismo que reduce la invasión de células de CaP y capacidad de migración, que transitoriamente hemos derribado PR expresión y cumplido los tipos de migración e invasión de PC-3 (figura 7A-C) y C4-2B (fig. 7B-D) las células se recuperaron. Además, cuando recombinante péptido SDF-1 o IL-6 se añadieron a CM, se observó que exógeno SDF-1 o IL-6 abolieron PR efectos supresores a PC-3 invasión de células (Fig.7E). En conjunto, estos resultados apoyan que la supresión PR-mediada de la movilidad celular CaP es principalmente a través de la inhibición de la SDF-1 e IL-6 expresión génica.
Células
WPMY-1 que expresan simulacro, ARP o PRB se transfectaron transitoriamente con el control de siRNA o siRNA contra PR durante 24 horas. Las células se lavaron dos veces con tampón PBS y se rellenaron con medio DMEM libre de suero durante 48 horas. CM se recogieron y se incubaron con las células para ensayos de migración de células (A y B) y ensayos de invasión de Matrigel (C y D) como se describe en la sección Material y Método PC-3 (A y C) o C4-2B (B y D). (E) CM se obtuvieron de hCAFs en presencia de vehículo o 10 nM de P4 y luego se mezcla con vehículos, 10 ng /ml de SDF-1 o 10 ng /ml de IL-6 y se incubó con las células PC-3 en la invasión de Matrigel ensayos. ANOVA de una vía y la prueba t de Student pareado calcular el nivel de significación de P & lt; 0,05 * y P & lt; 0,001 *** como
Discusión
Nuestros estudios demuestran. que los niveles de proteína PR están disminuidos en cáncer asociado estroma y que PR ejerce efectos inhibitorios a la movilidad celular PCa a través de la modulación de la expresión de dos citoquinas importantes, SDF-1 e IL-6. Estas observaciones sugieren que la reducción de la expresión de PR en el cáncer asociado estroma altera el microambiente de la próstata equilibrada, lo que puede contribuir a la invasión de células de CaP y la metástasis.
La observación de que la disminución de la expresión de PR en el cáncer asociado estroma es similar a lo que se informó con otros receptores de esteroides tales como AR y ER-β [34] - [36], lo que sugiere un principio general de que la pérdida de los receptores de esteroides puede ser necesaria para estroma de próstata que ser re-activado y la construcción de un microambiente favorable para el CaP. En favor de esta hipótesis, estroma AR fue mostrado para suprimir la proliferación celular y la invasión CaP [37]. aumento de la apoptosis ER-β agonista del estroma de la próstata y las células epiteliales en ratones knock-out de la aromatasa [38]. Aunque PR y AR comparten una alta homología en sus dominios de unión a ADN, estudios de microarrays de genes han mostrado diferentes perfiles de genes regulados por estos dos receptores [31], [39]. Por otra parte, este riesgo se expresa como dos isoformas principales con dominios de unión de ADN idénticas. Sin embargo, regulan diferentes transcriptoma. Una explicación podría ser que el PR ejerce su actividad transcripcional a través de interacciones de proteínas con otros factores de transcripción [40], [41].
El mecanismo por el cual los niveles de expresión de PR se redujo en células de CaP es desconocido. Tanto la intensidad de la tinción de PR y el percentil de núcleos positivos de relaciones públicas son más bajos en los tejidos de CaP. Dado que no todas las células del estroma de próstata expresan PR, no está claro si la población de células del estroma PR negativo se convierte en dominante, o si las células de relaciones públicas positivas pierden su expresión durante la progresión tumoral. Nuestro trabajo previo mostró que las células del estroma positivo PR proliferaron mucho más lento que las células negativas PR [31]. Sin embargo, también podría ser posible que las células cancerosas podrían ejercer impactos paracrinos para volver a activar las células del estroma de próstata por suprimiendo su expresión PR. Estas posibilidades no se excluyen entre sí y pueden coexistir durante el desarrollo del cáncer.
Nuestro análisis IHC se aplicaron en las secciones de montaje enteras de las biopsias de próstata, en lugar de los microarrays de tejidos (TMA), para medir los marcadores de proteínas del estroma. La heterogeneidad de estroma de próstata requiere múltiples áreas por diapositiva paciente a ser analizados por el patólogo. Esta es una norma fundamental que no puede ser satisfecha si se utiliza TMA. Debido al pequeño tamaño de los núcleos de tejido en las TMA, es técnicamente difícil de capturar representante emparejado benigna y cáncer asociado estroma y realizar análisis de comparación patológica.
se reportaron acciones independiente de ligando de PR en la transcripción de genes en varios estudios [42], [43]. Tanto liganded y PR no ligado puede ser localizado en el núcleo celular, pero en diferentes sub-compartimentos nucleares [44], [45]. modificaciones postraduccionales tales como fosforilación o sumoylation también contribuyen a la activación PR en ausencia de progestina [46]. Curiosamente, se ha informado recientemente de que AR regula la expresión de c-myc-ligando de manera independiente, lo que contribuye a la castración progresión resistente de CaP [47]. Estos resultados juntos sugieren que puede ser una gama más amplia de genes, cuya expresión está regulada por receptores de esteroides independiente a ligandos.