Extracto
Los isotiocianatos de plantas del orden de
Brassicales
se consideran fitoquímicos quimioterapéuticos contra el cáncer prometedor. Sin embargo, su citotoxicidad selectiva sobre el cáncer de hígado se ha investigado apenas. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos estudiado sistemáticamente la potencia quimioterapéutico de isotiocianato de 4-methylthiobutyl (MTBITC). toxicidad selectiva se investigó mediante la comparación de su efecto sobre las células de cáncer de hígado y sus subpoblaciones chemoresistant a los hepatocitos primarios normales y cortes de tejido hepático. Además, en una primera evaluación, el
in vivo
tolerabilidad de MTBITC se investigó en ratones. detención del crecimiento en M y apoptosis de inducción /G2 fue evidente en todos los
modelos in vitro
con cáncer tratados con MTBITC, incluidas las poblaciones con características que inician el cáncer. Este se encontró independiente de TP53; sin embargo la muerte celular se retrasó en p53 células comprometidas en comparación con células wt-p53, que era probablemente debido a la diferencia de BH3 solamente la regulación de genes i. mi. Noxa y su antagonista A1. En los hepatocitos normales, sin apoptosis o necrosis podría ser detectado después de la administración repetida de hasta 50 M MTBITC. En ratones, aplica por vía oral MTBITC fue bien tolerado más de 18 días de tratamiento durante un máximo de 50 mg /kg /día, la dosis más alta probada. En conclusión, hemos podido demostrar aquí que el efecto letal de MTBITC tiene una selectividad definida por las células cancerosas sobre las células normales del hígado y su citotoxicidad se aplica incluso si hay células cancerosas iniciar chemoresistant. Nuestro estudio podría servir para una mejor comprensión de las propiedades quimioterapéuticos de isotiocianatos sobre las células de cáncer de hígado humanas derivadas
Visto:. Lamy E, Hertrampf A, C Herz, Schüler J, M Erlacher, Bertele D, et al . (2013) Evaluación preclínica de 4-Methylthiobutyl isotiocianato de cáncer de hígado y cáncer de las células madre con diferente estado de p53. PLoS ONE 8 (8): e70846. doi: 10.1371 /journal.pone.0070846
Editor: Manlio Vinciguerra, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: May 7, 2013; Aceptado: June 23, 2013; Publicado: 2 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Lamy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. EL es financiado por una beca académica de la Fond Social Europeo y el Ministerio de Ciencia, Investigación y Arte de Baden-Württemberg, Alemania. A. B. contó con el apoyo de este estudio realizado por una beca de la Fundación Alexander von Humboldt de becas para investigadores experimentados. El artículo de procesamiento cargo fue financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) y la Universidad Albert Ludwig, Freiburg, en la publicación de Financiación del Programa de Acceso Abierto. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Torsten Giesemann y Julia Schueler son empleados de Oncotest GmbH. Este empleo no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El carcinoma hepatocelular (HCC) es el cáncer más común del sistema digestivo en el sudeste asiático y el África subsahariana; un aumento de la incidencia también se está notando en el mundo industrializado [1]. El pronóstico para los pacientes con HCC mayor o multifocal es pobre, con la tasa de supervivencia de 5 años es menor que 5% [2]. Esto se debe principalmente a la falta de respuesta a la quimioterapia y la radioterapia en el tratamiento de HCC y deterioro de la función TP53 ha sido identificado como factor importante para este [3]. TP53 es un jugador clave en la detención del crecimiento y la apoptosis [4] y uno de los genes supresores de tumores más comúnmente mutado en HCC [5]. Además, el concepto de que las células madre del cáncer altamente resistentes al tratamiento (células iniciadoras del tumor, TIC) juegan un papel central en la patogénesis de HCC ha captado mucha atención recientemente. TIC son capaces de auto-renovación, diferenciación, y mantener el crecimiento del tumor y la heterogeneidad. tratamientos contra el cáncer comunes, tales como radiación y quimioterapia no erradican la mayoría de los altamente resistente TIC [6]. Por lo tanto, la búsqueda de estrategias de terapia alternativa que afectan de manera efectiva estas subpoblaciones, superando de esta manera la resistencia del tumor y no dependen de p53 intacta por la muerte de las células cancerosas es de suma importancia [7].
Los isotiocianatos (ITC) de plantas de la para
Brassicales ¿Cuáles son actualmente de gran interés debido a su potencial aplicación en la prevención y tratamiento del cáncer. Numerosas investigaciones muestran que ocurren naturalmente ITC y sus análogos sintéticos retardan o inhiben el crecimiento de células tumorales, tanto
in vitro
y
in vivo
[8], [9]. Más importante aún, se ha demostrado recientemente que el CCI puede suprimir la aldehído deshidrogenasa (ALDH) -positivo TIC de la mama [10] y de próstata [11]. Sin embargo, la eficacia de la CCI contra TIC de otros órganos, incluyendo el hígado, está aún por determinar. En general, la información sobre el potencial citotóxico y citostático de ITC en las células tumorales del hígado es escasa [12] - [14]. Es una condición previa que los agentes terapéuticos potenciales exhiben una baja toxicidad para los tumores de tejido normal circundante, existe sin embargo, sólo una información muy limitada acerca de los efectos de la CCI sobre los tejidos sanos. Aquí se describe la actividad antineoplásica de isotiocianato de 4-methylthiobutyl (MTBITC, erucin) y su destrucción selectiva de las células tumorales y TIC través de un mecanismo independiente de p53. MTBITC se obtiene de la hidrólisis enzimática de glucoerucın, aislado de especies de plantas cohete (
Eruca sativa Mill
. Y
Diplotaxis tenuifolia L
.). Además, se deriva
in vivo
por reducción metabólica del sulforafano isotiocianato, que es característica de brócoli (
Brassica oleracea L.
). Para nuestros estudios, hemos utilizado un conjunto de
in vitro y modelos que consisten en líneas celulares de HCC, quimioresistente TIC, hepatocitos primarios normales y cortes de tejido hepático precisión de corte (PCLS) derivadas de pacientes para estudiar el cáncer citotoxicidad selectiva de MTBITC . Nuestros resultados fueron luego corroboradas por estudios sobre los mecanismos de activación de la vía diferencial TP53 tras el tratamiento MTBITC. Sobre la base de nuestra
in vitro
resultados que finalmente se investigó la tolerabilidad de MTBITC en un modelo de ratón.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
hepatocitos normales eran obtenida de los pacientes después de su consentimiento informado por escrito del Departamento de Cirugía de la Universidad de Friburgo Medical Center, Alemania. Esta parte fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Friburgo (Ethik der Kommission-Albert Ludwig-Universität Freiburg /Comisión de Ética de la Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). Para los experimentos de corte en lonchas de tejido humano, el hígado y resectates tumorales hepáticas se obtuvieron de los pacientes después de su consentimiento informado por escrito del Departamento de General, visceral & amp; La cirugía de trasplante del Hospital Universitario de Tübingen, Alemania. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética local (Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Clínica Universitaria de Tubinga /Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Eberhard-Karls-Universidad y el Tubinga Hospital Universitario Clínica). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Ley de Bienestar Animal Alemán (Tierschutzgesetz) y bajo los números de permiso del Regierungspräsidium Freiburg, Alemania G-10/05 y 35 a 9.185,64 /1. salud animal fue examinado antes de la aleatorización para asegurar que sólo se seleccionaron los animales sin ningún síntoma de la enfermedad para entrar en los procedimientos de prueba. Durante los experimentos, los animales se controlaron dos veces al día con respecto a la oferta estado general, alimentos y agua.
Químicos
DMSO, verapamilo clorhidrato, dexametasona, erysoline, etanol, yoduro de propidio (PI) y neutral rojo (NR) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemania). Dulbecco medio esencial mínimo (DMEM), suero de ternera fetal (FCS), tripsina 10 × (25 mg /ml), tripsina-EDTA 10 × (5 mg /ml), Hanks equilibrada tampón de sal (HBSS, sin Ca y Mg) y salina tamponada con fosfato (PBS, sin Ca y Mg) eran de PAA Laboratories GmbH (en Cölbe, Alemania). Penicilina-estreptomicina (/S P) y solución de Hoechst 33342 de solución (10 mg /ml), RPMI 1640, la insulina-transferrina-Selen (ITS), colagenasa de tipo IV, y 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1 , 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro (JC-1) eran de Invitrogen Life Technologies (Darmstadt, Alemania), reactivo WST-1 de Roche (Mannheim, Alemania). Accumax se adquirió de eBioscience (Frankfurt, Alemania), colágeno G de Schubert & amp; Weiss (Munich, Alemania), colagenasa CLS II de Biochrom (Berlín, Alemania) y EDTA de Serva Electrophoresis (Heidelberg, Alemania). CaCl
2, glucosa, EGTA, ácido acético (pureza 100%), Roti®-fenol /cloroformo /Isoamylalkohol y cloroformo /Isoamylalkohol fueron adquiridas de Carl Roth (Karlsruhe, Alemania), camptotecina (CPT) a partir de Tocris (Eching, Alemania), caspasa 3/7 reactivo GLO de Promega (Mannheim, Alemania) y Triton X-100 de Merck (Mannheim, Alemania). Rompun 2%, y xylazinchloride fueron adquiridos de Bayer (Leverkusen, Alemania), Ketanest 10% y ketaminiumchloride de Essex Tierarznei (München, Alemania). isotiocianato de 4-methylthiobutyl (MTBITC, erucin) se sintetizó por el Inst. de Química Orgánica de la Universidad de Giessen, Alemania, como se describe antes [15]. Valinomicina se adquirió de Fluka, (Buchs, Suiza). ITC se disolvieron en DMSO estéril.
Las líneas celulares de HCC, aislamiento y cultivo de explantes de HCC y hepatocitos
líneas celulares de HCC.
HepG2 (WT-53) y Hep3B ( null-p53) las líneas celulares se obtuvieron de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ), Braunschweig, Alemania. Huh-7 células (mut-p53) establecidas originalmente por Nakabayashi et al. [16] fueron amablemente proporcionados por H. Blum (Centro Médico de la Universidad de Friburgo, Alemania). Las células se cultivaron en DMEM bajo de glucosa suplementado con 15% (HepG2) o 10% (Huh7, Hep3B) de FCS y 1% P /S en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C hasta 70% de confluencia y se posteriormente recolectadas con tripsina. verificación de línea celular se hace comprobando microscópicamente la morfología de las células y la realización de análisis de la curva de crecimiento en una base regular. Sólo las células en el paso número nueve y cincuenta y seis fueron utilizados. El cultivo celular fue, además, resultaron negativos a la contaminación por micoplasma.
explantes HCC.
tumor en el hígado humano engraftments (LIXF, xenoinjerto de cáncer de hígado Freiburg), originalmente establecido por Oncotest GmbH, Alemania, se cultivaron subcutáneamente en ratones desnudos tal como se describe en otra parte [17]. Los explantes fueron enviados a nuestro laboratorio inmediatamente después de la cirugía, evitando la refrigeración u otras manipulaciones. El procedimiento para la preparación de los cultivos estaba de acuerdo con Patrawala
et al.
[18].
hepatocitos humanos primarios.
hepatocitos normales fueron aislados dentro de 2 h. Evaluación del parénquima hepático no tumoral fue realizada por un patólogo de alto nivel con experiencia en patología hepática. Los hepatocitos se aislaron utilizando la técnica de dos pasos colagenasa perfusión de acuerdo con un protocolo modificado de Guguen-Guillouzo
et al.
[19] y Strom
et al.
[20]. Después las células se resuspendieron finalmente en medio RPMI-1640 suplementado con 15% de FCS, 2 mM L-glutamina 1% P /S, 1% ITS, 100 nM de dexametasona y se cultivaron en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C durante 20 h.
hepatocitos murinos.
hepatocitos murinos eran recién aislados con una técnica de perfusión similar a la descrita para los hepatocitos humanos y se cultivaron en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C durante 10 h.
Tejido precisión de corte rebanar (PCLS)
el rebanar comenzó una hora después de la resección en un vibratome VT1200S (Leica, Wetzlar, Alemania) como se describe antes [21] Las rebanadas se incubaron en oxigenada medio e de William que contiene 25 mM de glucosa y 50 mg /ml de gentamicina (Lonza Bioscience, Verviers, Bélgica) en una atmósfera oxigenada (80% de oxígeno, 5% de CO
2).
Determinación de Drogas efecto en las células cancerosas
para los experimentos, las células cancerosas se sembraron, suplementado con medio de cultivo y se incubaron durante 48 horas a 37 ° C. Posteriormente, las células subconfluentes fueron expuestas a ITC durante 24 h a 96 h. Para la exposición & gt; 24 h, el medio de cultivo, que contiene CCI fue reemplazado cada 24 h
La detección de citotoxicidad
ensayo de retención de rojo neutro
El ensayo de retención de rojo neutro.. determina la acumulación del colorante rojo neutro en los lisosomas de células viables, no lesionados que se utilizó como otro parámetro para la detección de citostasis /citotoxicidad. Después de la exposición compuesto, se incubaron las células durante 3 h con el tinte NR (50 mg /ml) disuelto en el medio de cultivo correspondiente. Después, las células se lavaron suavemente con PBS precalentado y 150 l medio de fijación (EtOH: AcCOOH: agua desionizada, 50%: 1%: 49%) seguido por agitación suave durante 20 min. La absorbancia se registró a 540 nm usando un lector de microplacas Tecan.
Detección de Apoptosis y Crecimiento
Detención
caspasa 3/7 ensayo de escisión.
La inducción de la apoptosis en líneas celulares y las células primarias se determinó usando el ensayo Caspase3 /7-Glo (Promega, Alemania) según las instrucciones del fabricante.
la apoptosis en secciones de tejido del hígado se determinó por incubación con 50 mM de
N
acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aminometilcumarina (Ac-DEVD-AMC; Biomol, Hamburgo, Alemania) en tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,4, 1% de sacarosa, 0,1% de CHAPS, 10 mM de DTT). La escisión del sustrato se midió cinéticamente por espectrofluorimetría. Caspasa 3/7 actividad se determinó como la pendiente de las regresiones lineales resultantes y se expresa en unidades arbitrarias de fluorescencia por minuto.
Evaluación del potencial de membrana mitocondrial (MMP).
Para la detección de cambios en el MMP a nivel de una sola célula, el catión lipófilo JC-1 se utilizó como se describe en otra parte [14].
contenido de ADN subG1 y distribución del ciclo celular.
Para la detección de la distribución del ciclo celular , se utilizó la tinción PI de ADN después de la fijación, tal como se describe en otro lugar [14].
La detección de necrosis
yoduro de propidio (PI) ensayo de captación.
El ensayo se basa en la cuantificación de PI manchado células necróticas. Por lo tanto, después de la exposición compuesto, PI (2 mg /ml) se añadió a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos durante 5 min a TA bajo agitación continua. A continuación, las placas se centrifugaron a 189 g (3 min, RT). La cantidad de fluorescencia PI intracelular se midió utilizando un lector de microplacas Tecan en Ex.:. 525 nm /Em595 nm
ensayo de liberación de LDH de cortes de tejido
El porcentaje de lactato deshidrogenasa (LDH) liberación en el sobrenadante se determinó como sustituto de la integridad de la membrana utilizando el ensayo de LDH Mono-P (Analyticon, Lichtenfels, Alemania) según las instrucciones del fabricante. La cantidad de LDH que se liberan en el sobrenadante se determinó y se normalizaron al contenido de proteína de las rebanadas individuales, que se determinó mediante un ensayo de BCA de Pierce (Thermo Scientific, Dreieich, Alemania).
Aislamiento y análisis de Side Población (SP ) Las células
se analizaron células SP y no SP y aislado a partir de células Huh7 como se ha descrito antes [22]. En resumen, se tripsinizaron las células Huh7, se contaron y un millón de células /ml se resuspendieron en DMEM w /o rojo de fenol que contiene 2% de FCS y HEPES 10 mM. Las células se tiñeron con 20 mg /ml de Hoechst 33342 solo o junto con verapamil (50 mM) a 37 ° C durante 90 min. Entonces, las células se lavaron una vez con HBSS hielo frío que contenía 2% de FCS y HEPES 10 mM. Análisis y clasificación de células SP y no SP se realizó mediante MoFlo (DakoCytomation). Después, las células se lavaron con HBSS, se contaron y se sembraron en placas de cultivo durante otras 24 h. Las células fueron expuestas a MTBITC y posteriormente se utilizaron para el análisis.
Detección de Aldehydedehydrogenase
La expresión de la enzima Aldehydedehydrogenase (ALDH) se analizó utilizando el Kit de ALDEFLUOR STEMCELL Technologies (Grenoble, Francia), de acuerdo para la fabricación del protocolo. Como control positivo, el DEAB inhibidor de ALDH, que se proporciona en el kit, se utilizó.
Migración Celular (cero) Ensayo
El ensayo de rayado se realizó como se describe en otro lugar [23]. imágenes de microscopía óptica adquiridos para cada muestra se analizaron cuantitativamente utilizando el software de computación J Imagen (http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). Para cada imagen, se midió la distancia entre un lado de cero y el otro. Mediante la comparación de las imágenes desde el tiempo 0 al último punto del tiempo (72 h) la distancia de cada cierre cero se obtuvo y el tiempo medio para el cierre GAB calculado.
Sincronización de la célula por el suero Privación y DMSO
para la sincronización de células en G0 /G1, se retiró el medio de células HepG2 y sustituido por medio sin FCS durante 96 h. Después de ese tiempo, las células fueron o bien expuestos a DMSO o MTBITC durante otras 24 h en medio que contiene diferentes concentraciones de FCS. Las células se recogieron entonces y se analizaron para su distribución el contenido de ADN.
En un segundo conjunto de experimentos, se añadió 2% de DMSO al medio de cultivo de crecimiento adherente células HepG2 durante 72 h. A continuación, las células se suministran con medio de cultivo fresco que contiene DMSO o MTBITC durante 24 h, posteriormente se recogieron y se analizaron en cuanto a su distribución de contenido de ADN.
In vivo
tolerabilidad de MTBITC
Crl: NU-Foxn1mice (ratones desnudos) fueron adquiridos de Charles River, Erkrath, Alemania y se obtiene en microaisladores en condiciones de barrera. El tratamiento se realiza mediante una sonda oral diaria con vehículo o MTBITC suspendido en el vehículo durante 18 días.
Gene Análisis de la expresión de p53 mediante PCR en tiempo real cuantitativa
El ARN total se aisló con el RNeasy mini kit de aislamiento de Qiagen (Hilden, Alemania), seguido de una etapa de purificación utilizando el kit de DNasa libre de RNasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Se empleó un total de 2 g de ARN de cada muestra para la producción de ADNc utilizando la primera hebra de síntesis de cDNA Kit de Fermentas (St. Leon-Rot, Alemania). Las muestras de cDNA se diluyeron 1:02-1:05 y amplificados con el LightCycler DNA FastStart Maestro
PLUS SYBR Green I Kit de Roche (Mannheim, Alemania). ADNc de p53 se amplificó utilizando el sentido 5'-CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 ', y antisentido 5'-TCATAG GGCACCACCACACT-3' oligonucleótidos que producen un fragmento de 371 pb. El ADNc de beta-microglobulina gen de referencia se amplificó utilizando el sentido 5'-AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 'y antisentido 5' ACGGCAGGCATACTCATCTT-3 'oligonucleótidos que producen un fragmento de 248 pb. Todos los pares de cebadores transversales intrón /exón fronteras y por lo tanto, los productos de PCR no representan la contaminación de ADN genómico. Las condiciones de PCR fueron: primero 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 s, 59 ° C durante 10 s y 72 ° C durante 30 s. Los productos de amplificación se cuantificó con el software LightCycler 2.0 de Roche, Mannheim, Alemania, mediante la preparación de una curva estándar utilizando diluciones conocidas del cDNA estándar. Para normalizar la expresión de mRNA p53 las diferencias para la muestra a otra en la entrada de ARN, ARN de calidad, eficiencia y revertir la transcriptasa, la referencia de genes beta-microglobulina se amplificó en paralelo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Gene Análisis de Expresión utilizando una matriz de vía de señalización
El aislamiento de ARN a partir del 10
6 células por muestra se realizó con el RT
2 qPCR -Grado kit de aislamiento de ARN (SABioscience, Frederick, Maryland, EE.UU.). cDNA fue sintetizado utilizando el RT
2 Matriz de PCR Primer capítulo de síntesis Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, EE.UU.). Cuantitativa en tiempo real PCR de la vía de señalización de p53 humana RT
2 Matriz Profiler ™ (catálogo nº .: SPAS-027, SABioscience, Frederick, Maryland, EE.UU.) se realizó utilizando un sistema de detección de PCR MyiQ de un solo color en tiempo real (Bio-Rad, München, Alemania). Para el análisis de los datos de la RT basado en la web
2 se utilizó la matriz de perfiles ™ PCR análisis de datos. Los datos fueron analizados por el '2
-ΔΔCt método' utilizando el software proporcionado por el fabricante. Para cada gen, factor de cambio se calculó como la diferencia en la expresión génica entre dos grupos. Los resultados se expresaron como la media de 3 experimentos independientes.
se determinó el análisis de proteínas por inmunotransferencia
La concentración de proteína como se ha descrito por Bradford [24]. Para la inmunotransferencia, 20 g de proteína se mezclaron con tampón de muestra que contienen hecho SDS-listo, suplementado con 0,5% de β-mercaptoetanol. La electroforesis se realizó de acuerdo con el método de Laemmli [25]. A continuación, el gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia de tanque. Los sitios de unión no específica se bloquearon con leche baja en grasa al 5% en TBS /T y se incubaron con primaria, y, posteriormente, peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con anticuerpo secundario durante 1 h o durante la noche. Después de la incubación de anticuerpos, las proteínas de interés se detectaron mediante la técnica de quimioluminiscencia. Una imagen digital de la transferencia de Western fue capturada por una cámara CCD. aproximaciones Tamaño fueron tomadas por la comparación de las bandas teñidas a la de un estándar de proteína cargada durante la electroforesis. El proceso se repitió para la estructura de la proteína β-actina.
El silenciamiento de p53 por RNAi
p>
5 células fueron sometidas a transfección con revertir Transpass R1 (no .: M2551S) de NEB (Frankfurt a. M., Alemania). Para la transfección, 10 l TransPass R1 se mezclaron con 240 l DMEM y se incubaron durante 15 min a TA antes de la adición de oligómeros siRNA (siRNA p53 abreviatura Mix, no .: N2011S, NEB, Frankfurt una M., Alemania;. Controlar gato siRNA. . no sc-37007, Santa Cruz Biotecnología, Santa Cruz, EE.UU.; fluoresceína siRNA de control conjugado, no .: N2100S, NEB, Frankfurt una M., Alemania) a una concentración final de 25 nM, seguido de otro paso de incubación a TA. por 15 min a 250 l de complejo de transfección se transfirieron entonces a cada uno de las células así y HepG2 que contienen DMEM + 15% de FCS w /o antibióticos fueron incubadas posteriormente con el complejo durante 24 h en condiciones estándar de cultivo celular. Después, las células se lavaron dos veces con PBS y se complementaron con DMEM fresco que contenía FCS al 15% durante otras 24 horas antes de la exposición a la sustancia de ensayo durante 24 h.
RT-qPCR MLPA y
RT- MLPA se utilizó para analizar la expresión de ARNm de los miembros de la familia Bcl-2. Se aisló ARN de las células HepG2 y Hep3B como se describe anteriormente. RT-MLPA (MRC Holanda, RM002 kit, R011-C1) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los ARNm específicos se transcribieron inversamente en ADNc y obligados por dos oligonucleótidos en consecuencia ligados por una ligasa termoestable. Cada sonda da lugar a un producto de amplificación de longitud única separados por secuenciador capilar (Genescan). El análisis se realizó con GeneMapper (Applied Biosystems). La suma de todos los datos de pico se fijó a 100% para normalizar las fluctuaciones entre diferentes muestras, y los picos individuales se calcularon en relación a 100%. Análisis de la regulación del ARNm de Bcl-2 y Bmf no era posible por razones técnicas.
Análisis de Datos
Los resultados se calcularon mediante el uso informático GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA). El valor de la mediana de concentración inhibidora del crecimiento (IC50) se calculó después de la normalización de la respuesta y la transformación logarítmica con la siguiente ecuación: Y = 100 /(1 + 10
∧ ((LogIC50-X) * ladera)). El análisis de varianza entre grupos se realizó mediante ANOVA de una vía y se analizó la significación de la diferencia entre los grupos control y de tratamiento usando Dunnett prueba de comparación múltiple. Las diferencias con p = 0.05 (*) o p≤0.01 (**) fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados
La citotoxicidad de las TIC en las células tumorales hepáticas en comparación con hepatocitos normales
Se utilizó el ensayo de retención de NR para la evaluación de MTBITC citotoxicidad en células de cáncer en comparación con los hepatocitos normales. Este ensayo ha sido reportado como alta parámetro citotoxicidad sensible [26]. Una pérdida de viabilidad dependiente de la concentración, como se determina por la capacidad de deterioro de la retención lisosomal NR se observó en todas las células de cáncer probadas después del tratamiento MTBITC durante 24 h (Figura 1A). Por el contrario, en hepatocitos humanos, no hay pérdida de viabilidad relevante fue visto el plazo de 24-72 h tratados con & lt; 50 mM MTBITC (figura 1b). En hepatocitos murinos, MTBITC activa algunos procesos de ampliación de la capacidad de acumulación de rojo neutro de lisosomas después de 72 h de tratamiento MTBITC (figura 1b). Con base en los resultados obtenidos después de 24 h de tratamiento MTBTIC, los valores de IC50 se calcularon en 23,18 M (HepG2), 20.89 M (Huh7), 31.97 M (Hep 3B), 13,11 M (LIXF), 72.09 (hepatocitos humanos) y 47.81 (hepatocitos murinos) .
tratamiento
MTBITC atenúa selectivamente la supervivencia celular de las células tumorales del hígado (a), en comparación con hepatocitos primarios (b). La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de retención NR después de la exposición a MTBITC durante 24-72 h. Los resultados se expresaron en relación al control (0,1% DMSO), las barras son la media + SD, (número de experimentos independientes se da a continuación las figuras). Control positivo (+), 0,01% de Triton X-100. ** ≤p & lt; 0,01 en comparación con DMSO
detención del crecimiento y la apoptosis en células de HCC inducción humana normal y hepatocitos /PCLS
Para evaluar la naturaleza del deterioro observado en la viabilidad MTBITC-. estresado células de HCC, hemos tratado de establecer si esto se debió a un alto en el crecimiento celular, la apoptosis o procesos necróticos (figura 2 y 3). Se analizaron en primer lugar las células para la activación de la caspasa 3/7 como marcador de apoptosis específica. Dentro de las 24 h, MTBITC la apoptosis inducida significativa a 25 mM, pero sólo en las células HepG2 () p53 en peso; sin aumento podría ser visto en las células, las células p53-Mut (Huh7) p53 nula (Hep 3B) o LIXF (figura 2a). hepatocitos normales no se vio afectado por el tratamiento, como se investigó en células humanas o murinas a las 24 h (Figura 2 C). No hemos podido encontrar indicios de que MTBITC induce una reacción necrótica en las células malignas o normales, incluso a 50 micras, según lo determinado por la tinción de células PI (figura 2b y d). Condiciones de la exposición repetida (hasta 72 h), como sería el caso bajo la quimioterapia, no se sensibilizan más hepatocitos sanos a la apoptosis (figura 2c) o necrosis (figura 2d). Las observaciones realizadas en los hepatocitos normales se verificaron adicionalmente usando PCLS. Este
ex vivo
modelo permite que cubre la complejidad de la estructura del hígado y la multiplicidad de funciones metabólicas, homeostático, endocrinos y de biotransformación. Por lo tanto, una mejor refleja el alto nivel de organización biológica del órgano [27]. La exposición de PCLS a 25 M MTBITC no aumentó la apoptosis (figura 2e) o necrosis (Figura 2F) tasa en el tejido sano, sino más bien la suprimió, en comparación con el control de las rebanadas. En contraste, el control positivo, 1 mg /ml de actinomicina D se combina con 100 ng /ml de TNF inducida profunda apoptosis hepática (figura 2e).
Impacto de MTBITC sobre la apoptosis (a, c, y e) o necrosis (b, d, f) la inducción de células malignas y saludables. inducción de la apoptosis distinta se evaluó mediante la caspasa 3/7 actividad después del tratamiento de células con MTBITC durante 12 a 72 h. Control positivo (+): CPT 10 M o estaurosporina (a, c), 1 mg /ml de actinomicina D /100 ng /ml de TNF (ActD /TNF) (e). inducción de necrosis se cuantificó mediante absorción específica de PI en células aisladas (B y D) o la liberación de LDH de PCLS (f). Control positivo (+): 0,2% de Triton X-100. Los resultados se expresan en relación con el disolvente (0,1% DMSO). Las barras son la media ± SD, (número de experimentos independientes se da por debajo de las cifras;. Experimentos realizados en PCLS se llevaron a cabo por triplicado).
G2 /M detención (A a D) y la apoptosis (e ) la inducción después del tratamiento de células de HCC con MTBITC, determinada por tinción PI de DNA y citometría de flujo análisis. se determinó Impacto de MTBITC o 0,1% de DMSO (disolvente) después de 24 h (LIXF) o 72 h (HepG2, Huh7, Hep3B). Las barras son la media ± SD (n = 3).
A continuación, se midió el impacto de MTBITC en el ciclo celular. El pico subG1 fue utilizado por lo tanto como indicador de apoptosis. Después de 24 h de exposición a MTBITC, un G2 dependiente de la concentración fuerte /M detención fue evidente en LIXF (figura 3a) y todas las líneas celulares de HCC probado, pero de nuevo sin ninguna claros signos de apoptosis en las células p53-Mut o p53 nula (no datos mostrado). A continuación, nuestro análisis fue ampliado a un plazo de 3 días de la exposición MTBITC, como ya habíamos establecido que un tratamiento prolongado MTBITC no aumentó el daño a las células sanas. Como se muestra en la figura 3b-d, el bloque G2 /M mantiene bajo tratamiento CCI y esto fue en las células & gt p53 nula de orden; células p53 mut & gt; células p53 en peso. Aunque dentro de las 24 h, las células p53 con impedimentos no fueron sometidos a la muerte celular, 72 h-tratamiento con MTBITC desencadena apoptosis en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 3E).
Efecto de MTBITC en células TIC
a continuación se investigó el impacto de MTBITC en células SP chemoresistant, aislado a partir de células Huh7 utilizando el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 y citometría de flujo. En contraste con la línea de células HepG2, que contenía menos de 0,3% de células SP, la línea celular Huh7 contenía células SP a una concentración de alrededor de 1,5% y por lo tanto se utilizó para experimentos adicionales (figura 4A). la discriminación SP apropiada en células Huh7 se llevó a cabo experimentos de control de inhibición transportador ABC usando verapamilo (figura 4a), que bloquearon con éxito Hoechst flujo de salida de colorante. Caracterización de las poblaciones de células clasificadas demostró que i) la capacidad de las células SP al flujo de salida de colorante Hoechst se pierde en su mayor parte dentro de una semana en cultivo celular (figura 4a), como se ha demostrado mediante un nuevo análisis de células SP ordenados. ii) células SP crecieron significativamente más rápido que las células de NSP en las mismas condiciones de tratamiento, tal como se determina después de 72 (figura 4b). iii) La migración de células SP fue mayor que la de la población de células Huh7 total de, evaluada por el ensayo cero (datos no mostrados). La migración también se utiliza como un parámetro más para investigar la potencia quimioterapéutico de MTBITC. Como se muestra en la figura 4c, dentro de las 48 h, las células de control habían casi totalmente desplazado hacia la abertura de la elocuencia de nueva creación y cerró el "cero". Por el contrario, el establecimiento de contactos célula-célula completa todavía no era evidente después de 72 h en MTBITC células tratadas. Determinación de la tasa de migración de las células mostró que bajo células SP de tratamiento MTBITC necesario 44,1 h a cerca de GAB en un 50%, las células de control de 26,2 h. No hay diferencias de sensibilidad de drogas en términos de inhibición del crecimiento se pudo observar después del tratamiento MTBITC entre SP y las células de NSP (Figura 4D). Nuestro análisis adicional reveló que MTBITC detenido no SP, así como las subfracciones de SP en G2 /M y los empuja en la muerte celular programada, aunque en menor medida en las células SP en comparación con su homólogo no SP (figura 4E y F). A continuación se investigó la capacidad de los MTBITC para reducir la cantidad de células ALDH-positivas a partir de líneas de células HepG2 y Huh7. Como se representa en la figura 4g, MTBITC-tratamiento resultó dependiente de la concentración en una abrogación de este marcador; gramo.