Europea
Extracto
Antecedentes
Además de ser responsable de la producción de energía en la célula, las mitocondrias son actores centrales en la apoptosis, así como la principal fuente de especies reactivas de oxígeno dañinos. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que la variación de secuencias en el genoma mitocondrial es un factor que contribuye a la etiología de las enfermedades relacionadas con estos diferentes eventos celulares, incluyendo cáncer. El objetivo del presente estudio fue evaluar la frecuencia de haplogrupos y polimorfismos en la región de control (CR) del ADN mitocondrial de las células mononucleares de sangre periférica de pacientes con carcinoma de próstata (n = 304) frente a los pacientes seleccionados para la enfermedad de la próstata, pero resultó ser negativo para el cáncer en la biopsia (n = 278) en una población en Europa central.
Metodología /principales conclusiones
las nueve principales haplogrupos europeos y los polimorfismos CR fueron identificados por medio de análisis de la extensión del cebador y la secuenciación de ADN, respectivamente. Se encontró que las frecuencias de haplogrupos mitocondriales y polimorfismos CR no difieren significativamente entre los pacientes con o sin cáncer de próstata, que no implica ningún impacto de la variación del ADN mitocondrial heredado la predisposición al carcinoma de próstata en una población europea Oriente.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados contrastan con un reciente informe reclamando una asociación entre el ADNmt haplogrupo U y el cáncer de próstata en una población norteamericana de ascendencia caucásica
Visto:. Mueller EE, Eder W, Mayr JA, Paulweber B , Sperl W, Horninger W, et al. (2009) mitocondrial haplogrupos y Control Region polimorfismos no están asociados con el cáncer de próstata en los caucásicos europeos Media. PLoS ONE 4 (7): e6370. doi: 10.1371 /journal.pone.0006370
Editor: Andrew Vickers, del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2009; Aceptado: 24 Junio 2009; Publicado: 28 Julio 2009
Derechos de Autor © 2009 Mueller et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la "Oesterreichische Krebshilfe - Krebsgesellschaft Tirol" y el Paracelso Médico de la Universidad de Salzburgo (07/05/027). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es una de las principales causas de muerte en el mundo desarrollado. Es el cáncer más frecuente entre los hombres en los Estados Unidos y la segunda más común en la Unión Europea [1], [2].
Un cambio en la producción de energía celular de fosforilación oxidativa en las mitocondrias de la glucólisis anaeróbica, llamado efecto Warburg, es una propiedad fundamental de las células cancerosas. Debido a la función esencial de las enzimas codificadas por el ADN mitocondrial (ADNmt) en el metabolismo energético, alteraciones en el genoma mitocondrial se ha sospechado que ser capaz de causar un cambio metabólico en los tumores [3]. Además, la actividad respiratoria mitocondrial está asociada con la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que puede contribuir a la etiología y progresión del cáncer [4]. Debido a que las mitocondrias juegan un papel importante tanto en la producción de ROS y la apoptosis, la conclusión de que podían influir en la aparición de cáncer se extrae fácilmente.
La mayoría de las células eucariotas contienen cientos de mitocondrias, que albergan numerosas copias de ADNmt [5], [ ,,,0],6]. El genoma mitocondrial circular y de doble cadena es de alrededor de 16 pares de kilobases de longitud y puede dividirse en dos regiones principales: la región codificante y la región de control. La región de codificación consta de 37 genes, 24 componentes de codificación de la maquinaria de traducción mitocondrial y 13 genes que proporcionan subunidades esenciales de las enzimas de generación de energía de la vía de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) [5], [7]. La región de control (CR), que es no codificante, contiene dos regiones hipervariables (HVI y HVII) y un desplazamiento (D-loop) región, y está implicado en la replicación del ADN mitocondrial y la transcripción [8].
la población humana se ha acumulado un gran número de sustituciones de bases de ADN mitocondrial a lo largo radiante linajes maternos, de los cuales combinaciones específicas constituyen los llamados haplogrupos mitocondriales [7], [9]. Nueve haplogrupos de ADN mitocondrial europeos distintos (H, U, J, T, K, W, I, V, X) se definieron por Torroni et al. [10], [11]. Aunque la mayoría de los polimorfismos mitocondriales se cree que son neutrales, ADNmts específicas de la población pueden ser funcionalmente diferente y ejercer diferentes influencias sobre los resultados de las enfermedades [7], [12] - [14].
haplogrupos mitocondriales y polimorfismos tienen ha encontrado que está relacionado con la carcinogénesis. Por ejemplo, el polimorfismo de ADN mitocondrial 10398A está implicada en la mejora de la producción de ROS, y se encontró que era un factor de riesgo para el cáncer de mama y el cáncer de esófago en pacientes de la India, y para el cáncer de mama invasivo en mujeres afroamericanas [4], [15]. Además, se encontró asiática haplogrupo D que se asocia con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de endometrio en China [16]. En las poblaciones caucásicas, haplogrupo K se asoció con un aumento significativo, y haplogrupo U una disminución significativa en el riesgo de cáncer de mama [17].
Booker et al. [18] informó de una elevada frecuencia del haplogrupo T en pacientes con carcinoma de próstata en un estudio de los blancos norteamericanos. Este haplogrupo Europeo se correlacionó con un riesgo 2 veces mayor de desarrollar la enfermedad [18].
El objetivo de replicar el último estudio sobre una población europea Oriente. Debido a que las asociaciones de enfermedades relacionadas con la edad se han demostrado no sólo con los haplogrupos mitocondriales, sino también con los polimorfismos de nucleótido único (SNP) en la República Checa [19], que también investigó variaciones en la secuencia de HVI y HVII en nuestras cohortes.
resultados
se evaluaron los nueve principales haplogrupos europeos, así como los polimorfismos de RC en células mononucleares de sangre periférica de 582 varones de raza blanca, de los cuales 304 fueron diagnosticados con cáncer de próstata; el 278 restantes fueron identificados con niveles de PSA sérico elevado, pero eran histológicamente negativos para el cáncer de próstata en la biopsia y sirvieron como grupo de control. Características clínicas de los pacientes con cáncer y controles se muestran en la Tabla 1. Se observaron todos los nueve haplogrupos europeos en nuestra cohorte. Las frecuencias de haplogrupos mitocondriales no difirieron significativamente entre los pacientes con cáncer de próstata y los sujetos de control (Tabla 2). Cuando las frecuencias de haplogrupos mitocondriales se compararon entre los pacientes de cáncer con una puntuación de Gleason ≤6 biopsia de pacientes con cáncer con biopsia puntuación de Gleason ≥7 También se observaron diferencias significativas (Tabla 3).
el CR mitocondrial fue secuenciado y analizado entre las posiciones de nucleótidos 16145 y 530. Doscientos diecinueve polimorfismos se encontraron entre los 582 sujetos, con 197 homoplasmic intercambios de pares de bases individuales, 10 individuales deleciones de pares de bases individuales y 5 inserciones de pares de bases cuando se compara con la Secuencia de Referencia de Cambridge revisado. Dos muestras presentaron la misma deleción de 6 pares de bases de nucleótidos 106 a 111. Una CA-eliminación en las posiciones 514 y 515 se produjeron 40 veces, y CA-inserciones y CACA-inserciones también se encontraron en este sitio 64 veces. CC-inserciones ocurrieron en las posiciones 302 y 310, y heteroplasmia se encontró en una muestra (A 16 280 A /G). De estos 219 polimorfismos, 16 no se enumeran en el MITOMAP o base de datos del genoma humano mitocondrial (www.mitomap.org; www.genpat.uu.se/mtDB/). Todos los polimorfismos y sus frecuencias en los grupos control y estudio de cáncer se enumeran en el cuadro complementario S1
Dos de los polimorfismos 219 -. A 189 G, T y C 310 - se encontró que tenían una frecuencia significativamente menor en el los pacientes con cáncer en comparación con la población de control (p & lt; 0,05) (Tabla 4, Tabla S1). Sin embargo, la significación se perdió después de la corrección para comparaciones múltiples de Bonferroni (análisis), lo que lleva a un nuevo nivel de significación requerido de & lt; 0,00023. La Tabla 4 enumera los 35 polimorfismos con una frecuencia ≥ 5%, bien en el grupo de estudio de cáncer de próstata o de control.
Discusión
El objetivo del presente estudio fue replicar la encuesta de Booker et al. [18], que realizó un estudio de casos y controles en 221 hombres blancos con cáncer de próstata y 246 controles blancos en América del Norte y encontró haplogrupo mitocondrial U para tener una representación excesiva en el grupo de cáncer en comparación con el grupo control (OR: 1,95). En los caucásicos europeos Media no se encontraron diferencias significativas entre las distribuciones de haplogrupos de pacientes con cáncer de próstata en comparación con los controles. El ajuste para comparaciones múltiples aplicadas al estudio de Booker et al. también dio lugar a la pérdida de significación estadística [18]. La distribución haplogrupo del estudio norteamericano parece mucho a la distribución en nuestros pacientes de cáncer, mientras que el grupo control en el estudio de Booker et al. [18] es insuficientemente representadas para el haplogrupo U en aproximadamente un 45% en comparación con nuestro grupo control (Tabla 5). Cuando se comparó el grupo de casos de América con el grupo control austríaco ninguna asociación significativa de haplogrupos a cáncer de próstata fue detectado
Para excluir la posibilidad de que tenga problemas de próstata en general -. Indicado por niveles elevados de PSA en suero en nuestro grupo de pacientes y el control - se asocia con una mayor frecuencia haplogrupo U, se evaluó además la frecuencia del haplogrupo U entre los participantes en el estudio SAPHIR (Programa de Prevención de la aterosclerosis Salzburgo, tal como se publicó anteriormente [14], [20]). Las frecuencias de haplogrupo U en nuestros grupos de control y el cáncer de próstata no son significativamente diferentes de las de estos sujetos sanos SAPHIR. Un subgrupo de esta población, que consiste solamente en hombres (n = 988, edad media 49 años), también cuenta con una frecuencia de haplogroup U similar al grupo de cáncer de próstata (datos no mostrados). Además, la frecuencia del haplogrupo U entre 277 azar West caucásicos europeos estudiados por Brandstätter et al. [21] también no es significativamente diferente de la frecuencia en nuestro grupo de control (Tabla 5). Los sujetos de este estudio fueron matriculados en el mismo Hospital Universitario de Austria, donde se recruted nuestras cohortes de pacientes y de control.
En los estudios epidemiológicos relacionados con el ADNmt la importancia de los grupos de control adecuados se ha subrayado anteriormente [22], [ ,,,0],23]. Hay varias razones que podrían explicar los resultados discrepantes. Por ejemplo, las diferencias de variación, edad o sexo regionales podrían influir en el resultado de los cálculos estadísticos. Booker et al. [18] no definen si su población control constaba en su totalidad de los hombres o las mujeres también se incluye. Su cohorte de control consistió en donantes de órganos, que en los Estados Unidos deben especificar explícitamente su deseo de convertirse en un donante de órganos; por lo tanto, en función de las tendencias de los diferentes grupos étnicos de donar órganos, bancos de donantes de órganos podría exhibir diferentes distribución de haplogrupos en comparación con la población general. La edad media de los controles fue menor que la de los pacientes con cáncer. Edad podría tener un impacto en la variación de la población regional, especialmente en un país como los Estados Unidos con una gran población de inmigrantes. los patrones de inmigración podrían haber cambiado a lo largo de un período de tiempo, dando lugar a diferentes distribuciones de haplogrupos de diferentes grupos de edad de una población.
En otro estudio estadounidense que trató de replicar los hallazgos de Booker y col. [18] con respecto a una asociación entre haplogrupo U y el cáncer de próstata en hombres blancos, Canter et al. [24] informó de haplogrupo porcentajes U de 26,7% para su grupo de cáncer de próstata (n = 71) y 11,7% para su grupo de control (n = 128). Una de las limitaciones de su estudio es el bajo número de pacientes con cáncer de próstata. Por otra parte, su breve informe no se dan las características de los participantes en el estudio o la forma en que fueron seleccionados.
No puede excluirse que la variación geográfica de las frecuencias de haplogrupos en poblaciones de estudio de control están presentes entre Austria y los EE.UU..
de acuerdo con nuestros resultados, un estudio coreano no encontró ninguna asociación entre los haplogrupos mitocondriales y el cáncer de próstata [25]. El conjunto común de 22 haplogrupos del este asiático fue examinado y no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la distribución de frecuencias de haplogrupos de ADNmt entre el caso (n = 139) y el grupo control (n = 122).
La comparación de los polimorfismos CR de los pacientes de cáncer a los controles que encontramos dos de cada 219 diferencias estadísticamente significativas, que perdió su importancia después de la corrección para comparaciones múltiples.
Como hemos analizado sólo haplogrupos mitocondriales y polimorfismos de la región de control, no podemos excluir la posibilidad de que los polimorfismos en la región de codificación mitocondrial, no incluido en los polimorfismos haplogrupo predefinidos, podría estar asociado con el cáncer de próstata. Otra limitación de nuestro análisis es el poder bajo estudio. Se requerirían muy grandes tamaños de muestra para detectar de forma fiable una diferencia modesta en haplogrupo frecuencias entre los dos grupos [26].
Las mutaciones somáticas del ADNmt han sido reportados en una variedad de cánceres, incluyendo el carcinoma de próstata [27], [ ,,,0],28]. En este estudio, las muestras de ADN genómico de sangre solamente estaban disponibles para nosotros, y por lo tanto se pudo determinar ninguna asociación entre las mutaciones somáticas /polimorfismos.
En conclusión, no hemos encontrado ningún haplogrupos mitocondriales o polimorfismos CR estar asociados con cáncer de próstata en una población austríaca.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
el estudio se realizó de acuerdo con la Ley austriaca sobre tecnología genética y cumplido con la Declaración de Helsinki. El estudio y el uso de muestras de archivo para el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Innsbruck (estudio de la ONU 3174). Muestras archivadas en 1995 a 2006, se utilizaron para el estudio. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito a partir de 2001.
Los pacientes y sujetos control
Un total de 582 sujetos de raza blanca fueron analizados; Todos fueron reclutados del Departamento de Urología de la Universidad Médica de Innsbruck. Los pacientes y los controles se inscribieron en el programa de detección precoz del cáncer de próstata del Tirol, que se basa en AAP ordinario (antígeno prostático específico) ensayo [29], [30]. El grupo de casos comprende 304 hombres de entre 51 y 84 años, con diagnóstico de cáncer de próstata mediante la evaluación histopatológica de acuerdo a las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud. Como grupo control de la enfermedad, 278 hombres de entre 46 y 80 años con resultados benignos de la biopsia de próstata fueron reclutados como se describe anteriormente [29] (Tabla 1). Para el grupo de control de la enfermedad de un seguimiento medio de 4,3 años después de la biopsia está disponible que va de cero a 12 años, en los que se diagnosticó ningún cáncer.
aislamiento del ADN y análisis de ADNmt
ADN fue aislado a partir de células congeladas mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el AllPrep DNA /RNA Mini Kit 50 (Qiagen, Hilden, Alemania). Se utilizó un sistema jerárquico para ADNmt haplogrouping que combina la amplificación multiplex PCR, extensión del cebador de un solo base de multiplex, y la separación electroforética basada en capilar para el análisis de diez SNPs mitocondriales haplogrupo-diagnóstico (mtSNPs) para determinar la distribución haplogrupo de los haplogrupos europeos más comunes, H, T, J, T, K, I, V, W y X, tal como se describe anteriormente [20]
Sin embargo, se hicieron los siguientes cambios en este protocolo:. para eliminar los cebadores y desoxinucleótidos no incorporadas del Los productos de PCR, un ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH, EE.UU.) a digerir en un volumen de 4,5 l que contenía ExoSAP 0,5 ly 2 l producto de PCR se llevó a cabo a 37 ° C durante 60 minutos seguido de la inactivación de la enzima a 80 ° C durante 15 minutos. Las reacciones de extensión de cebador múltiplex se llevaron a cabo en un volumen total de 5 l que contiene 1 l de SNP Start Master Mix (GenomeLab ™ SNP Start Kit de extensión del cebador, Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.), 1 l de producto de PCR, y 1 l mezcla de imprimación. Dos cebadores SNP se cambiaron a 8251r: (A)
15GAGGGGGTGCTATAGGGTAAATACGGG y 16391r: (A)
6TGATTTCACGGAGGATGGTGGTCAAGGGA. Se utilizaron como un patrón interno, cebadores marcados con fluorescencia (Biomers, Ulm, Alemania) de longitudes de 15 y 60 bases (15 bases DY781 estándar: CACATGTCGGAGTCT, 60 bases DY781 estándar: TACAGTTCGTGCACACCGGCATCAGCTGTGTGCGAGAGTACTTACTATTGGTTGGCCAGA).
haplogrupos que no pudo ser asignados a uno de los nueve principales haplogrupos europeos por la combinación de SNP fueron designados como "otros". se analizaron
p>
2, 333,3 pM de avance y retroceso de imprimación, 133,3 mM de cada trifosfato de desoxinucleótido (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 0.083 U de fuego caliente de la polimerasa (Solis Biodyne, Tartu, Estonia). condiciones de ciclado térmico fueron 95 ° C durante 15 minutos, 35 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 2 minutos, y finalmente 37 ° C durante 2 minutos
.
los productos de PCR fueron purificados de la misma manera como se describe para el análisis haplogrupo (ExoSAP-IT, USB, Cleveland, OH, EE.UU.). El fragmento se secuenció usando los cebadores: 16098f ACATTACTGCCAGCCACCATG y 17f: CCCTATTAACCACTCACGGG. La secuenciación se llevó a cabo utilizando GenomeLab ™ DTC - Kit de inicio rápido (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) en un volumen de 10 l que contenía 2 l de la mezcla maestra y 500 pM de la imprimación adecuada. condiciones de ciclación térmica para la secuenciación se realizaron con: 30 ciclos de desnaturalización a 96 ° C durante 5 segundos, hibridación a 50 ° C durante 5 segundos y extensión a 60 ° C durante 4 minutos, seguido de 25 ° C durante 10 segundos. Las muestras se precipitaron de etanol y se separaron por electroforesis capilar en un Beckman Coulter CEQ ™ 2000 Genetic Analysis System.
El análisis estadístico
Las frecuencias de todos los haplogrupos mitocondriales y polimorfismos de RC en los pacientes con cáncer de próstata y controles se ensayó la independencia mediante estadística de chi-cuadrado de Pearson y la prueba exacta de Fisher, según corresponda. Además, de la misma manera, las frecuencias de haplogrupos mitocondriales en pacientes con carcinoma de próstata y biopsia puntuación de Gleason ≤ 6 y los pacientes con carcinoma de próstata y biopsia puntuación de Gleason ≥7 fueron probados. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Para el análisis de polimorfismos CR valores de p significativos se han corregido para comparaciones múltiples mediante el análisis de Bonferroni (nivel de significación requerido = 0,05 /número de comparaciones), lo que lleva a un nuevo nivel de significación requerido de & lt; 0,00023 [número de comparaciones = 219]. Todos los análisis se realizaron con SPSS 15.0 versión para estudiantes (SPSS Software GmbH, 80339 Múnich, Alemania).
Apoyo a la Información sobre Table S1. polimorfismos región
control
doi: 10.1371. /journal.pone.0006370.s001 gratis (DOC 0,21 MB)
Reconocimientos
Agradecemos a Michaela Öller para la asistencia en el ADN aislamiento, Adel Sakic para ayudar en la selección de la muestra y el aislamiento de ADN, y Birgit Stenzel para preparar el conjunto de datos clínicos. También se agradece a Neil D. Jones para la lectura crítica del manuscrito.