Extracto
Antecedentes
N
-butylidenephthalide (BP) exposiciones efecto antitumoral en una variedad de líneas celulares de cáncer. El objetivo de este estudio fue obtener nuevos datos sobre los mecanismos implicados en la muerte celular inducida BP en células de cáncer de próstata humano.
Métodos /Principales conclusiones
Dos líneas celulares de cáncer de próstata humano, PC- 3 y LNCaP, fueron tratados con BP, y posteriormente evaluados por sus perfiles de viabilidad y el ciclo celular. BP causó la detención del ciclo celular y la muerte celular en ambas líneas celulares. La detención en la fase G0 /G1 se correlacionó con el aumento de los niveles de inhibidores de CDK (p16, p21 y p27) y disminución de las proteínas de control. Para determinar los mecanismos de detención del crecimiento inducido por BP y la muerte celular en líneas celulares de cáncer de próstata, se realizó un estudio de microarrays para identificar alteraciones en la expresión génica inducida por BP en las células LNCaP. Varios genes inducidos por BP, incluyendo el GADD153 /CHOP, un estrés del retículo endoplasmático (ER estrés) -regulated gen, se identificaron. estrés ER inducida-BP fue evidenciada por el aumento de expresión de las moléculas de aguas abajo GRP78 /BiP, IRE1-a y GADD153 /CHOP en ambas líneas celulares. La obstrucción de IRE1-α o expresión /CHOP GADD153 por siRNA redujo significativamente la muerte celular inducida por BP en las células LNCaP. Por otra parte, el bloqueo de JNK1 /2 señalización de JNK en siRNA dado lugar a una disminución de expresión de α-IRE1 y los genes GADD153 /CHOP, lo que implica que el estrés ER inducida por la PA puede ser obtenido a través de JNK1 /2 señalización en células de cáncer de próstata. BP también suprimió el crecimiento del tumor de xenoinjerto LNCaP en ratones NOD-SCID. Esto causó la reducción de 68% en el volumen del tumor después de 18 días de tratamiento.
Conclusiones
Nuestros resultados sugieren que BP puede causar un paro fase G0 /G1 en células de cáncer de próstata y su citotoxicidad está mediada por ER inducción de estrés. Por lo tanto, BP puede servir como un agente contra el cáncer mediante la inducción de estrés ER en el cáncer de próstata
Visto:. Chiu S-C, Chen S-P, Huang S-Y, Wang M-J, Lin S-Z, Harn H-J, et al. (2012) La inducción de la apoptosis Acoplado al retículo endoplasmático estrés en células de cáncer de próstata humano por
n
-butylidenephthalide. PLoS ONE 7 (3): e33742. doi: 10.1371 /journal.pone.0033742
Editor: B. Ashraf Abdel-Naim, Facultad de Farmacia, Universidad de Ain Shams, Egipto
Recibido: 22 Noviembre 2011; Aceptado: 16 de febrero de 2012; Publicado: 28 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Chiu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC-93-2320-B-303-004, NSC-94-2320-B-303-005, NSC-96-2113-M-303 a 001), y el hospital budista Tzu Chi-general, Hualien, Taiwan (TCSP-01-02, TCRD-I9801-03). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común en los hombres estadounidenses y la segunda causa principal de muertes por cáncer [1]. Las opciones de tratamiento para los pacientes incluyen cirugía, radioterapia, terapia hormonal, quimioterapia y combinaciones de algunos de estos tratamientos. Uno de los agente de quimioterapia más común usado para el tratamiento de cáncer de próstata son los taxanos, tales como el fármaco paclitaxel primera generación (Taxol, una marca comercial de Bristol-Myers Squibb) [2], [3]. Aumento de las concentraciones de los fármacos citotóxicos y mayores dosis de irradiación no mejoran la respuesta al tratamiento y conduce a la resistencia a la apoptosis en células de cáncer de próstata. Por lo tanto, los agentes contra el cáncer que no son tóxicos y altamente eficaz en la inducción de apoptosis preferentemente en las células tumorales son valiosos de nuevo desarrollo.
Recientemente, los tratamientos no tradicionales utilizando hierbas y suplementos dietéticos han sido considerados como medicamentos alternativos para la terapia del cáncer.
Angelica sinensis gratis (también llamado Danggui en chino) es una de las hierbas tradicionales que se utilizan más comúnmente en China. Se recomienda como un tónico, hemopoetic, espasmolítico y analgésico en la práctica clínica [4]. En nuestro estudio anterior,
n
-butylidenephthalide (BP), un compuesto aislado de
Angelica sinensis
extracto de cloroformo, muestra actividad inhibidora del crecimiento en varias líneas celulares de cáncer humano, incluyendo el cerebro, pulmón e hígado Células cancerígenas. BP causó la detención del crecimiento y la apoptosis en estas células tumorales
in vitro
y
in vivo
[5] - [7]. Estos hallazgos indican que BP es un compuesto anticanceroso prometedor nuevo con un potencial para la aplicación clínica. Sin embargo, el efecto de la PA en las células de cáncer de próstata no se ha abordado.
plegamiento de las proteínas en el retículo endoplasmático (ER) se altera en diversas condiciones físicas y patológicas, denominado estrés ER. Una vía de señalización específica, la respuesta de la proteína desplegada (UPR), se ha demostrado en células para superar el estrés ER [8]. La inducción de la proteína regulada por glucosa GRP78 /Bip ha sido ampliamente reconocido como un marcador de estrés ER y el inicio de la UPR. Las señales de la UPR a través de tres sensores distintos de tensión situados en la membrana del ER: proteína quinasa RNA-como ER quinasa (PERK), inositol-requiere proteína-1 α (IRE1-α) y la activación de factor de transcripción 6 (ATF6) [9]. Entre ellos, la activación de junio quinasa N-terminal IRE1-mediada (JNK) contribuye a la muerte celular mediante la fosforilación e inactivación del regulador anti-apoptótica BCL-2 [10]. La proteína del factor de transcripción CCAAT /proteína de unión a potenciador (C /EBP) -homologous (CHOP; también conocido como DDIT3 /GADD153) opera en la convergencia de la PERK, IRE1-α y las vías ATF6 [11], [12]. La sobreexpresión de CHOP juega un papel importante en la apoptosis [13] a través de la dephosphorylates BH3-única proteína proapoptótico malo y regula a la baja expresión de Bcl-2 [14]
El presente estudio buscó:. 1) para determinar la lucha contra -proliferative efecto de BP
in vitro
y
in vivo
, 2) para analizar los efectos de la PA en la progresión del ciclo celular y la apoptosis, 3) para investigar el estrés ER como un objetivo molecular potencial de BP, y 4) para determinar si la señalización de estrés MAPK /ER está implicado en la apoptosis mediada por BP en el cáncer de próstata. Los efectos de la BP en el cáncer de próstata se evaluaron
in vitro líneas de Hoteles en células LNCaP y PC-3. Se utilizó LNCaP-NOD-SCID experimento de xenoinjerto en ratones para evaluar el efecto anticancerígeno de BP
in vivo
.
Resultados
inhibió la proliferación de BP y los cambios morfológicos inducidos en el cáncer de próstata humana células
BP tiene un fuerte efecto anti-proliferativo sobre las células de GBM y causó detención G0 /G1 fase y la apoptosis en un tiempo y manera dependiente de la concentración. Para determinar el efecto de citotoxicidad de BP en células de cáncer de próstata, tres líneas celulares de cáncer de próstata humano se trataron con una concentración creciente de BP durante 24 y 48 h, y se evaluaron mediante el ensayo de MTT. Como se muestra en la Fig. 1A y B, BP disminuyó significativamente la viabilidad de DU-145, PC-3 y las células LNCaP en una dosis y manera dependiente del tiempo. El tratamiento de LNCaP y células con 75 mg /ml de BP durante 48 h dio lugar a 24,48% y la supervivencia celular 45,88%, respectivamente (Fig. 1B) 3 PC. Basándose en estos datos, se utilizó 70 mg /ml de BP para los estudios posteriores. Para investigar más a fondo el efecto de citotoxicidad de BP en células de cáncer de próstata, se seleccionaron LNCaP (andrógeno-dependientes) y las células PC-3 (independientes de andrógenos) para una mayor investigación. BP-tratado LNCaP y células PC-3 mostró el encogimiento celular obvio y redondeo, características típicas de las células sometidas a la apoptosis (Fig. 1D y F).
DU-145 (negro), PC-3 (gris) , las células LNCaP (blanco) se trataron con una concentración creciente de BP (25 a 100 mg /ml) durante 24 (a) y 48 h (B) y se analizaron con el ensayo MTT. LNCaP y PC-3 células fueron tratadas con DMSO al 0,2% (C y E, respectivamente) o 70 mg /ml de BP (D y F, respectivamente) durante 24 h, se muestran.
BP induce la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 y cambia los niveles de expresión de G0 /G1 reguladora proteínas
con el fin de dilucidar su mecanismo de acción, se examinaron los efectos de la PA en la progresión del ciclo celular. Citometría de flujo El análisis mostró que el tratamiento con BP dio como resultado la acumulación de células en fase G0 /G1 de una manera dependiente del tiempo (Fig. 2A y B). La cuantificación de la proliferación de las células no tratadas mostró que 67,95% de las células estaban en la fase G0 /G1, 24,96% de las células estaban en la fase S, y 7,73% de las células estaban en la fase G2 /M del ciclo celular 12 h después de la siembra en LNCaP Células; 62,71% de las células estaban en la fase G0 /G1, 17,78% de las células estaban en la fase S, y 19,50% de las células estaban en la fase G2 /M del ciclo celular 12 h después de la siembra en células PC-3. El tratamiento de células con 70 mg /ml de BP durante 12 h aumentó el porcentaje de células en la fase G0 /G1 a 81,94% y redujo el porcentaje de las células en la G2 fases /M S y de 10,6 y 8%, respectivamente, en células LNCaP. En las células PC-3 tratados con 70 mg /ml de BP durante 12 h, el porcentaje de células en la fase G0 /G1 aumentó a 69,94%, y las células en la G2 fases /M S y se redujo a 18,11 y 11,97%, respectivamente .
BP G0 del ciclo celular inducida /detención en G1 en LNCaP (a) y las células (B) PC-3. Las células se sembraron a 8 x 10
5 (LNCaP) y 6 × 10
5 (PC-3) por 6 cm de placa por triplicado y se trató con 70 mg /ml de BP durante 12-24 h. Los datos se presentan como medias ± S.D. de tres experimentos diferentes. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01. Western blot de ciclina D1, CDK2, p16, p21, p27 y Rb-fosfo (Ser807 /811) se llevó a cabo en las células LNCaP (C) y PC-3 células (D). β-actina se utilizó como control interno. Western blot de fosfo-Akt (Ser473), Akt, fosfato GSK-3β (Ser9) y GSK-3β se realizó en células LNCaP (E) y células PC-3 (F). β-actina se utilizó como control interno.
Para determinar los mecanismos moleculares que subyacen a la detención del ciclo celular G0 /G1 en células de cáncer de próstata inducidos por BP, se analizó la expresión de cierta G0 /G1 reglamentario proteínas en las células LNCaP y PC-3 tratados con 70 mg /ml de BP. Primero examinamos el nivel de ciclina D1, ciclina el puesto de control principal que controla la fase G0 /G1. tratamiento BP condujo a la rápida reducción del nivel de proteína ciclina D1 (Fig. 2C y D). Regulación al alza de las proteínas reguladoras del ciclo celular G0 /G1 tales como p16, p21, p27, y regulación por disminución de CDK2 también se observaron en una manera dependiente del tiempo (Fig. 2C y D) .También observó una rápida reducción del nivel de fosforilación de Rb (Fig . 2C y D) que indica la activación comprometida de la CDK4 /6.
se ha establecido que la fosforilación de la ciclina D1 está mediada por la vía de la Akt-GSK-3β. Activado Akt fosforila e inhibe la función de GSK-3β, que conduce a la fosforilación de-y la estabilización de la ciclina D1. Por lo tanto, se examinó si la vía de Akt-GSK-3β-ciclina D1 estaba implicado en la degradación inducida por BP de la ciclina D1 en las células del cáncer de próstata. El análisis de transferencia Western mostró que BP rápidamente y notablemente reprimida la fosforilación de Akt, tan pronto como 10 min (Fig. 2E y F). En consonancia con la inhibición de la actividad de Akt, la fosforilación de Ser9 reducido en GSK-3β, un objetivo de Akt quinasa, también se observó (Fig. 2E y F), lo que sugiere que BP promueve la fosforilación de ciclina D1 a través de la supresión de la Akt y la activación de GSK- 3β. Estos datos sugieren que BP suprime Akt-GSK-3β en células de cáncer de próstata y causa la detención del crecimiento G0 /G1 por afectan a la expresión de proteínas reguladoras G0 /G1.
apoptosis inducida BP en LNCaP y células PC-3
Para evaluar el papel de la apoptosis en la muerte celular inducida por BP, se llevaron a cabo el Western Blot y la tinción de TUNEL. La activación de las caspasas son mecanismos cruciales para la inducción de apoptosis. La caspasa -8 y -3 se proteasa clave asociada con el receptor de la muerte mediada por apoptosis y su participación en la apoptosis inducida por BP se investigó tanto en células LNCaP y PC-3. caspasa BP-inducida -8 y -3 divisiones aumentó dependiente de la dosis tanto en las células LNCaP y PC-3 (Fig. 3A y B). Los miembros pro-apoptóticos de la familia Bcl-2, Bax, también aumentó después del tratamiento BP que tienen vínculo importante entre la apoptosis inducida por el estrés ER-IRE1 y. tinción TUNEL a las 48 h después del tratamiento 70 mg /ml de BP también reveló aumento del número de células apoptóticas en tanto LNCaP y células PC-3 (Fig. 3D y F, respectivamente).
análisis de transferencia de Western de la caspasa activa 8 , caspasa 3 activa y Bax se llevó a cabo en las células LNCaP (a) y PC-3 células (B). β-actina se utilizó como control interno. células LNCaP y células PC-3 se incubaron en ausencia (C y E, respectivamente) o presencia (D y F, respectivamente) de 70 mg /ml de BP durante 48 h y después se sometió a ensayo de TUNEL.
análisis de la expresión génica por microarrays de ADNc en las células LNCaP
expresión génica mediada por BP para obtener información sobre el mecanismo de la inhibición del crecimiento inducida por BP y la muerte celular, se utilizó microarray basado en oligodesoxinucleótido para identificar tratado con BP . células LNCaP se trataron con 70 mg /ml de BP durante 3 y 24 h, y se extrajo el ARN y se utilizan en el análisis de microarrays. Se identificaron a ser regulado en una forma dependiente del tiempo (Tabla 1) genes, incluyendo GADD153 /CHOP. Hemos validado la sobre regulación de los genes GADD153 /CHOP por Western blot. BP provocó un aumento de la expresión de la proteína GADD153 /CHOP tanto en LNCaP y PC-3 células (Fig. 4A y B). Sobre regulación de GADD153 /CHOP se ha definido como ER respuesta al estrés, que a su vez activan las señales para inducir la apoptosis. Así se investigó el papel del estrés ER en la muerte celular inducida por BP en células de cáncer de próstata.
Western blot de Bip, calnexina, PDI, ATF6, fosfo-eIF2α (Ser51), IRE1-α, GADD153 /CHOP, fósforo ASK1 (Thr845), ASK1 y Fas se realizaron en células LNCaP (a) y PC-3 células (B). β-actina se utilizó como control interno. Western blot de Bip, IRE1-α, GADD153 /CHOP y Ero1-Lα se realizaron en células LNCaP (C) y PC-3 células (D). β-actina se utilizó como control interno.
BP inducida por el estrés ER en las células LNCaP y PC-3
Para delinear la inducción de estrés ER por BP en la próstata las células cancerosas, se investigó la inducción de genes relacionados con la UPR después del tratamiento BP en LNCaP y PC-3 células (Fig. 4A y B, respectivamente). La expresión de BIP aumentó después del tratamiento BP, pero no se encontraron diferencias en calnexina y expresiones PDI (Fig. 4A y B). se observó sobre regulación de estrés ER-α transductor IRE1 pero no ATF6 y p-eIF-2α. BP-α expresión inducida IRE1 era evidente a partir de 3 h (1,16 pliegues) y aumentó hasta 48 h (2,47 pliegues) en células LNCaP. Los niveles de Fas aumentó después del tratamiento BP, tanto en células LNCaP y PC-3 y fueron consistentes con el hallazgo de microarrays en las células LNCaP. Además, las expresiones de bip, IRE1-α y GADD153 aumentaron dependiente de la dosis tanto en LNCaP y células PC-3 (Fig. 4C y D). El objetivo transcripcional GADD153, ER-oxidasa como 1 α (ERO1-Lα) también aumentó de forma dependiente de la dosis después del tratamiento BP (Fig. 4C y D).
BP-induce la translocación nuclear de GADD153 /CHOP en células LNCaP y PC-3
para estudiar la implicación de GADD153 /CHOP en el tratamiento de BP, lo primero que investigó si BP promueve la translocación de la proteína GADD153 /CHOP al núcleo. GADD153 /CHOP translocación nuclear representa el transporte de la señal de tensión en el núcleo y, por tanto, una activación funcional. A las 12 h después del tratamiento BP 70 mg /ml, GADD153 /CHOP fue aparentemente más abundantes en el núcleo de LNCaP tratadas con BP y células que en la de los controles (Fig. 5A y B) 3 PC-.
células LNCaP (a) y (B) células PC-3 fueron tratados con 0,2% de DMSO (control) o 70 mg /ml de BP durante 12 h, se fijaron y se tiñeron con anti-GADD153 /CHOP. Se utilizó anticuerpo secundario marcado con FITC (fluorescencia verde) Los núcleos se tiñeron con DAPI (fluorescencia azul). Las imágenes fueron capturadas por un microscopio láser confocal.
El papel del estrés ER en la lucha contra la proliferación mediada por BP
Además, utiliza un enfoque de siRNA para determinar el papel de GADD153 en el potencial anticáncer de BP en el cáncer de próstata. células LNCaP fueron transfectadas con siRNAs para GADD153 y IRE1-α, respectivamente, con o sin tratamiento posterior de 70 mg /ml de BP durante 48 h. El análisis de transferencia Western demostró que la transfección de si-GADD153 /CHOP dio lugar a una supresión de la expresión /CHOP GADD153 inducida por BP en las células LNCaP, en comparación con las células transfectadas con siRNA control mezclado (Fig. 6A). La muerte celular inducida por el tratamiento BP fue rescatado por 21,18% en las células transfectadas con GADD153 /CHOP siRNA en comparación con células siRNA transfectadas revueltos (Fig. 6B). Desde promotor del gen GADD153 /CHOP contiene sitios de unión para todos los principales inductores de la UPR, y sólo IRE1-α fue inducido después del tratamiento BP (Fig. 4), que caracteriza, además, el papel de IRE1-α en el crecimiento celular inducida por BP la detención y la muerte celular. Silenciamos expresión IRE1-α mediante transfección si-IRE1-α antes del tratamiento de 70 mg /ml de BP. Como se muestra en la Fig. 6C, IRE1-a siRNA bloqueado significativamente la expresión de proteínas IRE1-α inducida por el tratamiento BP de una manera dependiente de la dosis. Además, GADD153 /CHOP también fue suprimida por IRE1-α siRNA transfección. ensayo de MTT mostró que 11,67 y 20,8% de muerte celular se inhibió en 20 y 50 nM IRE1-a siRNA transfección después de la exposición de las células a 70 mg /ml de BP, respectivamente (Fig. 6D). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la muerte celular inducida por BP puede estar implicado, al menos en parte, a través de la inducción de estrés ER y la sobre regulación de IRE1-α y GADD153 proteínas /CHOP expresión.
( a) células LNCaP fueron transfectadas con scramble siRNA (
#), 20, o 40 nM GADD153 siRNA, respectivamente, durante 48 h utilizando el reactivo de transfección RNAiFect. Después de 24 h de tratamiento con 70 mg /ml de BP, se realizó el análisis de transferencia Western para GADD153. inducida por BP (B) la actividad anti-proliferativa se midió con el ensayo de MTT en las células LNCaP transfectadas con scramble siRNA (
#) o 20 nM GADD153 siRNA durante 48 h y después se trató con 70 mg /ml de BP durante 24 h. Los datos se expresan como medias ± S.D. de tres experimentos independientes. ***,
P Hotel & lt; 0,001. las células LNCaP (C) se transfectaron con scramble siRNA (
#), 20, o 50 nM IRE1-a siRNA, respectivamente, durante 48 h utilizando el reactivo de transfección RNAiFect. Después de 24 h de tratamiento con 70 mg /ml de BP, se realizó el análisis de transferencia Western para IRE1-α y GADD153, respectivamente. β-actina se utilizó como control interno. (D) BP-indujo la actividad anti-proliferativa se midió con el ensayo de MTT en las células LNCaP transfectadas con scramble siRNA (
#), 20, o 50 nM IRE1-a siRNA, respectivamente, por 48 h y luego se trató con 70 mg /ml de BP durante 24 h. Los datos se expresan como medias ± S.D. de tres experimentos independientes. ***,
P
. & Lt; 0,001 frente al vehículo
El papel de MAPK en el estrés ER inducida por BP y la muerte celular
La activación de las MAPK ha sido implicado en la regulación de la tensión inducida ER-muerte celular. Se investigó el efecto de la presión arterial en la activación de MAPK. La exposición de LNCaP y células PC-3 a 70 mg /ml de BP resultaron en la fosforilación de JNK y ERK 1/2 1/2, pero no p38 MAPK (Fig. 7A y B). La fosforilación de ERK 1/2 BP después del tratamiento se produjo a los 10 minutos y la baja regulación se produjo a los 30 minutos. Por el contrario, la fosforilación de JNK media mantuvo en 10 a 180 min. Para caracterizar adicionalmente el papel de la JNK media en el tratamiento BP, que silenciados expresión JNK media por transfección siRNA específico. Como se muestra en la Fig. 7C, JNK media la expresión y la fosforilación después del tratamiento BP reducido mediante transfección si-JNK. Además, la expresión inducida por BP de IRE1-α y GADD153 también redujo mediante transfección si-JNK. la muerte celular inducida por BP fue rescatado por transfección si-JNK, en comparación con la transfección de siRNA revueltos (siRNA1: 26.14%, siRNA2:. 20,95%, la figura 7D). Estos hallazgos sugieren que la activación de JNK está implicada en la muerte celular inducida por BP y participa en IRE1-α y la activación GADD153.
células LNCaP (A) y (B) células PC-3 fueron tratados con 70 mg /ml BP durante los tiempos indicados. Fosfato ERK1 /2, ERK1 totales /2, fosfo-JNK1 /2, el total de JNK1 /2, fosfo-p38, p38 y totales fueron detectados por Western Blot, respectivamente. células LNCaP (C) se transfectaron con scramble (
#) o 20 nM JNK1 /2 siRNA durante 48 h utilizando el reactivo de transfección RNAiFect. Después del tratamiento con 70 mg /ml de BP durante 24 h, se realizó análisis de transferencia Western para fosfo-JNK1 /2, el total de JNK1 /2, IRE1-α y GADD153. β-actina se utilizó como control interno. inducida por BP (D) la actividad anti-proliferativa se midió con el ensayo de MTT en las células LNCaP transfectadas con scramble (
#) o JNK1 /2 siRNA durante 48 h y después se trató con 70 mg /ml de BP durante 24 h. Los datos se expresaron como medias ± S. D. de tres experimentos independientes. ***,
P
. & Lt; 0,001 frente al vehículo
BP inhibe el crecimiento de células cancerosas en xenoinjerto LNCaP-NOD-SCID
Para evaluar la actividad antitumoral de BP
in vivo
, xenoinjerto de cáncer de próstata humano se establecieron por inyección subcutánea de 5 x 10
5 células LNCaP en el tejido subcutáneo dorsal de ratones NOD-SCID. Como se muestra en la Fig. 8A, el volumen relativo del tumor en ratones tratados con 500 mg /kg BP fue significativamente 68% menor que los ratones de control tratados con vehículo en el día 18. El peso del tumor se redujo significativamente del 56% en el grupo tratado con BP en comparación con el grupo de control en el día 18 (Fig. 8B). Los tumores en los animales de control se calificaron como Gleason 5B ya que ningún tejido glandular se encontró (Fig. 8C). En los animales tratados con BP, se observaron glándulas fusionadas irregulares y se organizaron de Gleason 4A (Fig. 8D). Por lo tanto, los grados de la diferenciación del tumor de grupo tratado con BP fueron mejor que el grupo control. Además, se observó la regulación de GADD153 /CHOP en el tumor BP-tratamiento por tinción inmunohistoquímica (Fig. 8E y F) y análisis de transferencia Western (Fig. 8G), respectivamente. La activación de caspasa-3 también se observó en el tumor BP-tratamiento (Fig. 8G). No hubo diferencias significativas de peso corporal en ambos grupos tratados con BP y el control. Estos resultados indican que la muerte celular inducida por el cáncer de próstata BP se correlacionó con el estrés ER
in vivo
.
ratones NOD-SCID (A) fueron inyectados con aproximadamente 5 × 10
5 LNCaP las células en el tejido subcutáneo dorsal. Cuando el tumor alcanzó 100 a 250 mm
3, ratones portadores de tumores LNCaP se administraron s.c. con control de vehículo (▪) o 500 mg /kg BP (•) en los días 0-4 de 5 días. Los volúmenes tumorales relativos de control y los grupos tratados con BP se muestran como medias ± S. D. del volumen del tumor en cada punto de tiempo. (B) Los tumores de los grupos de control y terapéuticos se retiraron y se pondera en día 18. El peso medio del tumor del grupo tratado con BP fue 56% más pequeño que en el grupo control. Los datos se expresaron como medias ± S. D. de peso del tumor del control y los grupos tratados con BP. **,
P Hotel & lt; 0,01. (C, D) secciones de tejidos tumorales con tinción HE de control (C) y grupos terapéuticos (D) .GADD153 expresiones se identificaron inmunohistoquímicamente en el control (E) y el grupo tratado con BP (F). Las células GADD153-positivas se tiñeron de color marrón. La expresión de GADD153 y la forma activa de la caspasa-3 en el tejido tumoral de xenoinjertos de LNCaP se upregulated después de la administración de BP en comparación con el grupo control mediante análisis de Western Blot (G).
Discusión
En la actualidad algunos compuestos terapéuticos dietéticos de origen natural prometedores incluyen resveratrol, curcumina, la genisteína, sulfuro de dialilo y otras sustancias que tienen en común la capacidad de inducir la apoptosis de las células cancerosas han sido explotados [15]. En nuestros estudios anteriores, hemos demostrado que BP acto con fuerza contra el glioblastoma multiforme (GBM) tumores cerebrales y tumores de carcinoma hepatocelular (HCC)
in vitro
y
in vivo
[5], [6] , [dieciséis]. Sin embargo, no se han determinado los efectos de BP en células de cáncer de próstata humano. Los resultados de este estudio mostraron que BP es citotóxico para las tres líneas celulares de cáncer de próstata diferentes. Debido a que tanto las células de cáncer de próstata andrógeno-dependientes e independientes del mostraban una sensibilidad similar al tratamiento de BP, la implicación de la vía de andrógenos se ignora en este estudio.
La pérdida de la regulación del ciclo celular es la característica del cáncer. Para explorar los mecanismos contabilizadas por el efecto de la PA en las células del cáncer de próstata, se controlaron los ciclos celulares. la detención del ciclo celular inducida por BP se evidenció por la sobre regulación de p16, p21 y p27, y la baja regulación de CDK2 y ciclina D1. Las proteínas p16, p21 y p27 son inhibidores de CDK que regulan negativamente cdk o ciclina /cdk complejo [17]. La proteína p16, miembro de la familia INK4, se une a CDK4 /6 para bloquear la actividad quinasa en la mitad de la fase G1 [18]. El p21 (CIP1) y p27 (Kip1) proteínas se unen al complejo de ciclina /cdk, lo que resulta en la inhibición de G1 a la fase S a través de la transición de la supresión de la fosforilación de Rb por el complejo ciclina /cdk [19]. Por lo tanto, la disminución de fosforilados Rb debe ser debido a una expresión desencadenada-BP de los inhibidores de CDK, que a su vez reducen la actividad del complejo de ciclina /cdk. la activación frecuente de la vía de señalización Akt ha sido reportado en muchos cánceres humanos [20], [21], y GSK-3β se ha identificado como una de las dianas moleculares de la Akt. Akt inactiva la actividad de quinasa GSK-3β través de la fosforilación específica de sitio en Ser9 [22]. Represión de Akt que conduce a la des-fosforilación y activación de GSK-3β causa la fosforilación de la ciclina D1 en Thr286 y la posterior degradación proteasomal [23]. Ciclina D1 se ha demostrado que se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer incluyendo cáncer de mama, cabeza y cuello, esófago y de próstata [24],. En este estudio, se encontró que BP es capaz de inhibir la activación de Akt mediante la reducción de la fosforilación de Ser473, y restaura la actividad de la quinasa GSK-3β mediante la reducción de la fosforilación Ser9 en células de cáncer de próstata. Estos datos sugieren que BP suprime la proliferación de células de cáncer de próstata a través de la detención del ciclo celular mediante la regulación de la proteína reguladora del ciclo celular /CDK /ciclina CKI y la orientación del eje de señalización de Akt-GSK-3β-ciclina D1.
Para investigar el subyacente los mecanismos moleculares de la muerte inducida por BP células de cáncer de próstata, se examinaron los cambios inducidos por BP en la expresión génica en células de cáncer de próstata humano utilizando un ensayo de selección basado en microarrays oligodesoxinucleótido. Varios genes que muestran incremento mayor de dos veces en la expresión a las 24 h de tratamiento BP fueron identificados (Tabla 1). GADD153 /CHOP mostró dramáticamente 11.89 pliegues aumento de la expresión después del tratamiento BP. GADD153 /CHOP es un gen de interés, ya que está implicado en ER vía apoptótica mediada por el estrés. La activación de la UPR juega un papel protector de las células sometidas a estrés ER [26]. Sin embargo, la activación prolongada de la UPR por el estrés ER excesiva puede convertir su papel al citotóxica por la activación de múltiples vías de apoptosis en células de mamífero [27]. Las proteínas de estrés ER transductores ATF6, IRE1-alfa y PERK constituyen el núcleo regulador de la tensión de la UPR y la transducción de señales desde el RE hasta el citoplasma y el núcleo después de estrés ER [28] - [30]. En nuestro estudio, la PA inducida por la activación única IRE1-α, pero no ATF6 o p-eIF2α en células de cáncer de próstata. Aumentar y mantener la expresión de IRE1-α y su objetivo abajo GADD153 /CHOP después del tratamiento de BP se observaron en tiempo y dosis-dependiente manera. Uno de los mecanismos implicados en GADD153 /apoptosis CHOP mediada es el estrés oxidativo [31]. La oxidación de la luz del RE es inducida por el GADD153 /CHOP objetivo abajo ERO1-Lα. ERO1-Lα se ha especulado que hyperoxidize la luz del RE, y hace que la producción citotóxica especies de oxígeno reactivo (ROS) que conduce a la muerte celular. Otro mecanismo se asoció con la función de Bax en la apoptosis inducida GADD153 /CHOP. En aopotosis cardiomiocitos inducida por ER-estrés, Bax aumentan con el estrés ER en un /CHOP dependiente manera GADD153 [32]. Bax y Bak también modulan la UPR por una interacción directa con IRE1-α, y son importantes vínculo entre IRE1-α-ER apoptosis inducida por el estrés mediada. Nuestros resultados muestran que la transfección de siRNAs para IRE1-α o GADD153 /CHOP suprime la muerte celular inducida por BP. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que BP puede modular ER apoptosis estrés mediada por células de cáncer de próstata humano a través de la activación de la vía de señalización de IRE1-α-GADD153 /CHOP.
El tratamiento con BP provocó el aumento de expresión de Fas, que llevó a la activación de la caspasa-8 y -3 en tumor cerebral maligno en nuestro estudio anterior [5]. Fas sobreexpresión también se incrementó a 3 horas después del tratamiento BP. apoptosis tanto, inducida por BP de células de cáncer de próstata humano podría ser mediada, al menos parcialmente, a través de vía de la apoptosis receptor de muerte.
Además, la activación de MAPK ha sido implicada en la regulación de la expresión génica en el estrés ER señalización cascada y está implicado en muchos aspectos del control de la proliferación celular y la apoptosis. La vía de JNK también se ha demostrado que es un regulador positivo de la apoptosis inducida por el estrés ER [33]. En nuestro estudio, se observó la fosforilación de JNK después del tratamiento BP. La inhibición de la expresión de JNK de siRNA llevó a la baja regulación de IRE1-α y GADD153 /CHOP, y la muerte celular inducida por BP parcialmente rescatado. ER activada por estrés IRE1-α se une el factor de necrosis tumoral proteína adaptadora factor2 asociada al receptor (TRAF2), una ubiquitina ligasa E3, que a su vez activa la quinasa de regulación de la señal de apoptosis 1 (ASK1; también conocido como MAP3K5), posteriormente provoca JNK activación. Estos resultados implican la noción de que BP-inducida ER estrés mediar la muerte celular a través de la cooperación de la vía de JNK.
factor de necrosis tumoral relacionada con la apoptosis ligando inductor (TRAIL) es un ligando del receptor de muerte que puede iniciar preferencialmente la apoptosis en las diversas células tumorales. Recientemente terapéuticos, basados-TRAIL, incluyendo la terapia génica TRAIL, TRAIL recombinante, y TRAIL-receptor-agonistas anticuerpos han de entrar en ensayos clínicos [34] - [37]. Sin embargo, similar a muchos otros tipos de cáncer, el cáncer de próstata desarrollar resistencia a TRAIL [38], [39]. Por lo tanto, la búsqueda de los sensibilizantes TRAIL capaces de superar la resistencia TRAIL en células cancerosas son valiosos. LNCaP se sabe que son resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL asociado con la ausencia de PTEN que promueven la activación constitutiva de la vía de AKT /PI3K. Desde BP disminuyó de manera eficiente la actividad de Akt mediante la reducción del nivel de fosfo-Akt Ser473, lo que hace un candidato de BP sensibilizador TRAIL.
En conclusión, nuestro estudio demuestra que BP 1) provoca la detención del ciclo celular en el cáncer de próstata G0 /fase G1 por la orientación del eje de señalización Akt-GSK-3β-ciclina D1; 2) induce la muerte celular a través de ER-estrés y la UPR mediado por JNK; 3) desencadena la apoptosis de las células de cáncer de próstata humano a través de múltiples vías de apoptosis
in vitro e
in vivo gratis (Fig. 9).
BP induce la apoptosis en células de cáncer de próstata humano a través de múltiples vías de apoptosis, incluyendo la detención del ciclo /célula fase G1 G0, vía del receptor de muerte y la vía de la tensión dependiente de ER.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células y reactivos
Las líneas celulares de próstata humano LNCaP y PC-3 se adquirieron de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), y se cultivaron en medio RPMI con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor 1640, 100 U /ml de penicilina y 100