Extracto
Antecedentes
La angiogénesis es esencial para el crecimiento y la metástasis del cáncer. Aunque los agentes anti-angiogénicos, inhibidores particularmente factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), han mostrado actividad como agente único, existe un interés considerable en la combinación de estos nuevos fármacos con reactivos convencionales de quimioterapia para alcanzar una eficacia clínica óptima. El objetivo de este estudio fue evaluar los beneficios de la terapia de combinación de trampa vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF-Trap) con gemcitabina en un modelo de tumor de pulmón.
Métodos
Una luciferasa que expresan (LLC) modelo de carcinoma pulmonar de Lewis se estableció en ratones C57BL /6J y ratones portadores de tumores se asignaron al azar en el control, el VEGF-Trap, gemcitabina y VEGF-Trap /grupos de combinación de gemcitabina. El crecimiento del tumor y la supervivencia de los animales fueron monitoreados. densidad de los microvasos del tumor y la proliferación celular se evaluaron por CD31 y Ki-67 análisis inmunohistoquímico. ensayo TUNEL se realizó para detectar células apoptóticas. Los niveles de proteína de la ciclina D1, Pro-caspasa-3, Bcl-2, MMP2 y MMP9 en los extractos tumorales se examinaron por transferencia Western.
Resultados
VEGF-Trap en combinación con gemcitabina mostró mejora de forma significativa la inhibición del crecimiento del tumor y la supervivencia prolongada de ratón en comparación con el VEGF-Trap o monoterapia gemcitabina. La terapia de combinación VEGF-Trap /gemcitabina no sólo inhibió potentemente la angiogénesis tumoral y la proliferación celular, pero también aumentó la apoptosis celular en los tejidos tumorales. Además, el tratamiento de combinación marcadamente reducido regulado la expresión de la proliferación, anti-apoptosis y proteínas relacionadas con la invasión.
Conclusión
La terapia de combinación usando VEGF-Trap y gemcitabina como resultado una mejora anti-tumor eficacia en un modelo de cáncer de pulmón y VEGF-Trap /combinación de gemcitabina podría representar una estrategia prometedora en el tratamiento de cáncer de pulmón humano
Visto:. Zhou S, Yang y, Yang y, Tao H, Li D, Zhang J, et al. (2013) Combinación de terapia de VEGF-Trap y gemcitabina resultado una mejora en la eficacia antitumoral en un modelo de cáncer de pulmón de ratón. PLoS ONE 8 (7): e68589. doi: 10.1371 /journal.pone.0068589
Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, los Estados Unidos de América
Recibido: 15 Marzo, 2013; Aceptado: 6 Junio 2013; Publicado: 9 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el proyecto de Shanghai "Ciencia y Tecnología plan de acción para la innovación" animal de laboratorio de investigación (Nº 10140900400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31.000.527), el Fondo de investigación de la Oficina de Salud de Shanghai joven investigador (Dr. Zhou Shuang) y programa Académico Hong Kong (núm XJ2011025). Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. Junli Zhang es empleado de Yantai Rongchang Biotecnologías, Ltd Eli Lilly and Company Shanghai proporcionado gemcitabina (Gemzar) para este estudio. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La angiogénesis es el proceso de nuevos vasos sanguíneos formación a partir de la vasculatura existente. Es un proceso importante en el desarrollo de tumores malignos como lesiones neoplásicas necesitan establecer su propio suministro de sangre para crecer más allá de 1 a 2 mm de diámetro [1]. El regulador predominante de la angiogénesis del tumor es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [2], [3], que es el factor angiogénico clave sabe que está presente en todo el ciclo de vida del tumor [4]. Su expresión continua, junto con la estabilidad genética de los receptores de VEGF en las células endoteliales, hace supresión directa y constante de VEGF señal de una importante estrategia anti-tumor [3], [4]. Con el papel de la angiogénesis en el crecimiento tumoral y la progresión firmemente establecidos, agentes anti-angiogénicos han recibido una atención mucho más extendido, pero las estrategias clínicas para su uso óptimo todavía se están desarrollando [5].
El endotelial vascular agente antiangiogénico trampa del factor de crecimiento (VEGF-trap o aflibercept) es una proteína quimérica de ingeniería que contiene el dominio extracelular 2 de VEGF receptor-1 (VEGFR-1, Flt-1) y el dominio extracelular 3 de VEGFR-2 (KDR) fusionado a la porción Fc de la inmunoglobulina G1 humana. VEGF Trap-potentemente bloquea todas las isoformas del VEGF-A y PIGF de ambos orígenes humanos y de ratón [6]. VEGF-Trap ejerce sus efectos anti-angiogénicos a través de la regresión de la vasculatura del tumor [7], [8], la normalización de sobrevivir a la vasculatura, y la inhibición de la germinación de nuevos vasos tumor [9], [10]. Estos prometedores resultados condujeron al avance de este agente en estudios clínicos [11], y ha sido recientemente aprobado por la FDA para el cáncer colorrectal EE.UU. [12]. Sin embargo, es poco probable que las terapias anti-angiogénicas son curativos en su propia porque los agentes anti-angiogénicos sí mismos no pueden matar directamente las células tumorales. Más bien, su mayor potencial se puede realizar cuando se utiliza en conjunción con terapias contra el cáncer convencionales, por ejemplo, la quimioterapia [13], [14]. normalización inducida por anti-angiogénesis de la vasculatura del tumor puede mejorar la perfusión del tumor y dar lugar a la entrega mejorada quimioterapia [15] - [18]
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo.. La gemcitabina es un análogo de la desoxicitidina que ha mostrado eficacia como tratamiento para muchos tumores sólidos. La gemcitabina se le ha recetado comúnmente en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [19], [20], sin embargo, sus beneficios son limitados debido a una baja tasa de respuesta tumoral o la resistencia adquirida.
en el presente estudio, hemos intentado evaluar la eficacia de la terapia de combinación usando VEGF-Trap y gemcitabina en un modelo de cáncer de pulmón LLC ratón, y para investigar el posible mecanismo responsable de la eficacia antitumoral aumentado.
Materiales y Métodos
ratones y Reactivos
C57BL /6J hembras fueron adquiridos de la Academia china de Ciencias y alojados en el Centro de Mantenimiento de Animales de la Universidad de Tongji durante al menos 1 semana antes utilizar. Los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Tongji. Todos los experimentos con animales se realizaron en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices institucionales. VEGF-Trap se construyó según Holash y compañeros de trabajo [8], y se expresa en las células después de la transfección estable de ovario de hámster chino (CHO). El VEGF-Trap recombinante se purificó mediante una proteína de cromatografía de intercambio iónico y de afinidad y se reconstituyó en PBS estéril. La calidad de VEGF-Trap se determinó mediante la reducción de SDS-PAGE. La actividad de unión de VEGF-Trap recombinante para VEGF de ratón se confirmó mediante un ensayo de unión ELISA directo-base. La proteína se almacenó a -20 ° C hasta su uso para la administración subcutánea (sc) a 1 g /kg. Gemcitabina (Gemzar) fue amablemente suministrado por Eli Lilly (Indianapolis, Ind., EE.UU.) y se almacena a 4 ° C. De acuerdo con los estudios previos [21], gemcitabina se disolvió en PBS estéril para la inyección intraperitoneal (ip) a una dosis de 60 mg /kg.
Construcción de luciferasa que expresan Línea Tumor Cell
células de adenocarcinoma de pulmón de ratón LLC (CRL-1642) eran de la American Type Culture Collection (ATCC), que se propagaron en DMEM suplementado con 10% de suero inactivado por calor de ternera fetal (GIBCO-BRL), 1 mM de piruvato sódico, glutamina 2 mM y 100 mg /l de penicilina, y se mantuvo a 37 ° C en atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 en el aire. gen de la luciferasa se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de un molde de ADNc usando un cebador directo: 5'-CAC CGA CTC TAG AGC CGC CAC CAT GGA AGA TGC CAA AAA C y un cebador inverso: 5'-CGG GAT CAA CGC CGT GTA ATA ACG GTC CGT CGA CAA TCA CA, flanqueada por sitios de restricción I y Sal I X-bal. PCR se realizaron con 30 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 segundos, hibridación a 58 ° C durante 45 segundos, y extensión a 72 ° C durante 60 segundos. El fragmento de PCR se digirió con X-bal I y Sal I y se insertó en PRRL-CMV plásmido lenti-viral en el sitio I y Sal I X-bal. Lenti-luciferasa (lenti-Luc) vector viral fue empaquetado en células 293T mediante transfección de lenti-Luc y los plásmidos de embalaje (Invitrogen). Después de 48 horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes que contenían virus lenti-Luc. Para la transducción viral lenti-Luc, células LLC se sembraron en una placa de 6 pocillos y se lenti-virus que contienen sobrenadantes se añadieron al medio (sobrenadantes: fresco medio = 01:01, aproximadamente 1 × 10
8 partículas virales /ml) en presencia de polibreno (8 mg /ml). Un clon de luciferasa que expresan estable fue seleccionado por dilución limitada para crear una línea celular Luc-LLC. La actividad de luciferasa en las células Luc-LLC se determinó por ensayo de luciferasa utilizando un kit de detección de luciferasa (Beyotime) y bioluminiscente de imágenes (Berthold). Otras comparaciones de crecimiento celular, la migración y la capacidad de las células LLC y Luc-LLC formación de tumor se realizaron mediante el ensayo de MTT, cicatrización de heridas y la evaluación de modelo de tumor subcutáneo, respectivamente.
modelo de tumor de los animales y los grupos de tratamiento
Para inocular tumores, 2 × 10
6 células Luc-LLC se resuspendieron en 200 l de medio DMEM libre de suero y se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de 6 a 8 semanas de edad, ratones C57BL /6J. Una semana después de Luc-LLC inoculación, los ratones portadores de tumores se dividieron aleatoriamente en los siguientes grupos (n = 8 por grupo) basado en la bioluminiscencia medida después de que el volumen primero de formación de imágenes y los tumores de alcanzar alrededor de 100 mm
3: (a) control sin tratar (200 l de PBS tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal); (B) VEGF-Trap sola (1 g /kg tres veces por semana por inyección subcutánea); (C) gemcitabina sola (60 mg /kg tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal); (D) VEGF-Trap /combinación de gemcitabina (VEGF-Trap de 1 g /kg semanalmente por inyección subcutánea tres veces, y gemcitabina 60 mg /kg tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal). La terapia se continuó durante 2 semanas a partir de entonces. El tamaño del tumor se monitorizó cada dos días durante 15 días con un pie de rey después de la iniciación del tratamiento. Los volúmenes tumorales se determinaron utilizando la fórmula: volumen (mm
3) =
a
×
b
2 × 0,5, donde
a
es la larga de diámetro y
b
es el diámetro corto como se describe anteriormente [22]. Todos los datos se representan como medias ± SE. Los ratones fueron sometidos a la formación de imágenes en el día 12 después del inicio del tratamiento. En el día 15 después del inicio del tratamiento, los ratones fueron sacrificados en todos los grupos. Los tumores se pesaron y se tomaron fotos después de la disección. La mitad del tejido tumoral se fijó en peryodato-lisina paraformaldehído (PLP) y O.C.T (Sakura Finetek) incrustado para inmunohistoquímica. La otra mitad fue instantánea congelada en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. análisis de la curva de supervivencia se realizó en un grupo de tratamiento independiente. la muerte del ratón se determinó utilizando un criterio predeterminado.
La bioluminiscencia de imágenes
in vivo
La bioluminiscencia de imágenes se realizó utilizando un sistema de imágenes de animales (NightOwl LB 983 Sistema de Imagen Molecular , Berthold). Los ratones fueron inyectados con una inyección intraperitoneal de sal de potasio de D-luciferina /kg 150 mg (Caliper Life Sciences) en 200 l DPBS. Después de 5 minutos de la inyección de luciferina, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg /kg). Cada ratón se colocó en una posición de decúbito lateral izquierdo y la imagen de escala de grises digital de un animal fue adquirido, seguido por la adquisición y superposición de una imagen en pseudocolor que representa la distribución espacial de los fotones detectados que salen de la luciferasa activa dentro del animal de. El tiempo de exposición varió de 10 a 30 segundos, dependiendo de la intensidad de la emisión de la bioluminiscencia de las células tumorales. Los fotones emitidos desde regiones específicas se cuantificaron usando un software de IndiGo (Berthold). Las regiones de interés (ROI) se elaboraron en torno a los sitios de tumor y se cuantificaron como recuentos de fotones por segundo.
La inmunohistoquímica
Los tejidos tumorales se fijaron en el PLP, embebido en OCT, y se cortaron en secciones de 10 micras . A continuación, las secciones se tiñeron con anticuerpos específicos para el análisis.
Para el análisis de densidad de los microvasos, secciones de tumor se tiñeron con una rata anti-ratón CD31 de anticuerpos (BD Pharmingen), seguido de IgG de conejo anti-rata conjugado con FITC (Invitrogen ). núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (Sigma-Aldrich). La cuantificación de la densidad de microvasos (MVD) se evaluó de acuerdo con el método de Weidner et al. [23]. Brevemente, las secciones fueron seleccionados en primer lugar a bajos aumentos (× 40 y × 100) para identificar la zona más vascular del tumor (punto caliente). Dentro del área de punto caliente, el manchado de los microvasos se contó en un solo de alta potencia (x400) de campo. MVD se expresó como el número de microvasos /campo. Cualquier células endoteliales CD31-manchado o grupos de células endoteliales que fueron claramente separados de los microvasos adyacentes, las células tumorales, o elementos de tejido conectivo se consideraron una sola microvasos contables.
El análisis inmunohistoquímico de la proliferación celular se realizó sobre secciones congeladas de tumores con un anti-ratón-Ki-67 anticuerpo de rata (Biolegend) seguido de IgG de conejo anti-rata conjugado con FITC (Invitrogen). Los resultados se expresaron como el porcentaje de Ki-67 células positivas ± SEM por × 400 aumentos. Un total de diez × 400 campos examinados y contados a partir de tres tumores en cada uno de los grupos de tratamiento. El índice de proliferación Ki-67 se calculó según la siguiente fórmula: 67 el número de células positivas Ki /el recuento total de células x 100%
TUNEL ensayo
In situ.
detección de células apoptóticas en el tejido tumoral se realizó por la técnica de terminal mediada por desoxinucleotidil transferasa fin de etiquetado dUTP nick (TUNEL) utilizando un kit de detección de apoptosis disponible en el mercado (Beyotime) siguiendo el protocolo del fabricante. células TUNEL positivas de 10 campos independientes se cuantificaron manualmente. El índice de apoptosis se calculó según la siguiente fórmula:. El número de células apoptóticas /número total de células nucleadas × 100%
Análisis Western Blot
Los tejidos tumorales en el día 15 después de la iniciación del tratamiento fueron homogeneizado con tampón de lisis (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 1 mM de PMSF, 10 mg /ml de aprotinina , 10 mg /ml de leupeptina) en hielo. Después de centrifugación a 14.000 rpm a 4 ° C durante 30 min, se recogieron los sobrenadantes y las concentraciones totales de proteína se determinaron mediante el ensayo de BCA (Pierce). Igual cantidad de proteínas desnaturalizadas se cargaron en 10% de gel de SDS-PAGE y se transfirieron sobre una membrana de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en TBST (1 x TBS que contiene 0,1% de Tween 20) y después se incubaron con anti-ratón de anticuerpos primarios a CyclinD1, Pro-caspasa-3, Bcl-2, MMP2 y MMP9 (todos de Santa Cruz biotecnología) durante la noche a 4 ° C. Después de lavar con TBST tres veces, anticuerpos secundarios conjugados con HRP fueron atados y realizaron con quimioluminiscencia utilizando sustrato SuperSignal West Pico (Pierce). intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando el software líder de la banda.
Análisis estadístico
La significación estadística se determinó mediante ANOVA de una sola vía o
t de Student
, según el caso.
*
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo y
**
P
. & Lt; 0,01 sería muy significativa estadísticamente
Resultados
Establecimiento de LLC Modelo de tumor con expresión de luciferasa estable
Para un mejor crecimiento tumoral y la metástasis del monitor
in vivo
, se construyeron líneas celulares con expresión de luciferasa LLC estable y por vía subcutánea inoculado células LLC-Luc en ratones C57BL /6J. Los tumores se midieron y captación de imagen sobre días 7, 14 y 21 después de la inoculación del tumor. Como se muestra en la Figura 1A y B, el crecimiento del tumor Luc-LLC se visualizó con imágenes de bioluminiscencia y fotones emitidos a partir de regiones específicas se cuantificaron usando un software añil, que era consistente con la curva de crecimiento del tumor (Figura 1C). No se observaron diferencias entre las células LLC patente Luc-LLC y en la morfología celular, la migración y el crecimiento
in vitro
así como la capacidad de formación de tumores
in vivo gratis (Figura S2). Diferentes esquemas de tratamiento fueron representados en la figura 1D
(A) Imágenes de bioluminiscencia de tumores LLC en los días 7, 14 y 21 después de Luc-LLC inoculación subcutánea (n = 6).; (B) Las mediciones de fotones por segundo que representan los volúmenes de los tumores de los ratones utilizando el software de análisis de imágenes añil,
*
P Hotel & lt; 0,05,
**
P Hotel & lt; 0,01
vs
día 7; (C) Curva de crecimiento del tumor desde el día 5 al 25 después de Luc-LLC inoculación subcutánea (n = 6),
*
P Hotel & lt; 0,05,
**
P
& lt; 0,01
vs
día 5; (D) Representación esquemática del protocolo de experimento se describe en materiales y métodos, los animales se dividieron en cuatro grupos: (a) Control; (B) VEGF-Trap solo; (C) gemcitabina sola; (D) Combinación de VEGF-Trap y gemcitabina.
Efectos de VEGF-Trap en combinación con gemcitabina en tumores LLC
Para investigar los efectos terapéuticos de la terapia de combinación de VEGF-Trap y gemcitabina en el crecimiento de los tumores LLC, ratones C57BL /6 con tumores LLC se dividieron en cuatro grupos de tratamiento como se describe anteriormente. VEGF-Trap se preparó como se describe en los Materiales y Métodos. El VEGF-Trap purificado mostró como una sola banda con un peso molecular aparente de 50 kD (Figura S1A) y exhibió una actividad de unión potente para VEGF de ratón tal como se determina por un ensayo de unión directa (Figura S1B). Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron alrededor de 100 mm
3, se inició el tratamiento. En el día 6 después de la terapia del tratamiento inicial, VEGF-Trap y la combinación de gemcitabina mostró efectos inhibidores significativos sobre el crecimiento del tumor en comparación con el grupo control. Aunque VEGF-Trap o gemcitabina sola también significativamente el crecimiento tumoral inhibido, la terapia de combinación resultó en un más robusto inhibición en el desarrollo de tumores y tenía el retraso más significativo en el crecimiento del tumor como se determina por el volumen del tumor en días 9, 12 y 15 después del tratamiento inicial ( Figura 2C,
P
& lt; 0,01, en comparación con el grupo control). análisis de imágenes de bioluminiscencia de tumores LLC en día 12 después del inicio del tratamiento confirmó el efecto anti-tumor (Figura 2A y B). Las diferencias significativas en el tamaño del tumor y el peso se observaron en día 15 cuando el tratamiento se detuvo y los tumores fueron disecados (Figura 2D y E). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el tamaño del tumor entre los grupos de VEGF-Trap y en monoterapia con gemcitabina. Por lo tanto, la terapia de combinación de VEGF-Trap y gemcitabina aumentó la eficacia antitumoral en LLC modelo de tumor. Del mismo modo, el aumento de la inhibición del crecimiento del tumor en la terapia de combinación se tradujo en la supervivencia del animal prolongada de acuerdo con el análisis de Kaplan-Meier y los ratones que recibieron la terapia de combinación se mantuvo a una tasa de supervivencia del 100% al final del período de observación (Figura 2F) .
(A) imágenes de bioluminiscencia de tumores subcutáneos LLC inoculados en el día 12 después del inicio del tratamiento; (B) Análisis de Imagen (fotones por segundo) que representan los volúmenes de los tumores de los ratones utilizando el software de análisis de imágenes añil; (C) El volumen del tumor calculado en días 3, 6, 9, 12,15 después del inicio del tratamiento; (D) fotos representativas del tumor en el día 15 después del inicio del tratamiento; (E) pesos de los tumores se midieron en el día 15 cuando se cosecharon los tumores; curvas (F) de supervivencia se construyeron de acuerdo con el análisis de Kaplan-Meier. n = 8 para cada grupo, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & lt; 0,01
vs Francia El grupo de control
la inhibición de la angiogénesis tumoral y la proliferación celular
se cosecharon
LLC tumores de todos los grupos de tratamiento en el día 15 después del comienzo del tratamiento y se prepararon para estudios immunehistochemistry como se describe en Materiales y Métodos. La angiogénesis en el tejido tumoral se evaluó contando la densidad de los microvasos después de la tinción inmunohistoquímica para CD31. El tratamiento con VEGF-Trap o la terapia de combinación resultó en una inhibición evidente de la angiogénesis en tumores en comparación con el grupo control. Los recuentos promedio de los vasos por campo de alta potencia en el VEGF-Trap o grupo de combinación fueron significativamente más bajos (
P Hotel & lt; 0,01) que en el grupo control (Figura 3A y B). Aunque hubo una significación estadística en la densidad microvascular, también señaló que los tumores tratados con gemcitabina mostró un área de CD31-positivo más fuerte que los tumores en el grupo de terapia combinada
.
(A) Imágenes representativas de los microvasos CD31-positivo las células de la zona y Ki67 positivos en los tejidos tumorales LLC viables en el día 15 después del inicio del tratamiento se estimaron mediante tinción inmunohistoquímica; (B) y (C) la densidad de microvasos y el porcentaje de las células Ki67 positivas se determinaron contando el número de la tinción positiva por campo de alta potencia en la sección, como se describe en "Materiales y Métodos". *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01
vs
el grupo de control. Barra de escala, 50 micras.
Para examinar la proliferación celular en los tejidos tumorales después del tratamiento, las secciones congeladas de tumores fueron teñidas con Ki-67 anticuerpo y el índice de proliferación Ki-67 se calculó basándose en el análisis inmunohistoquímico. El índice de proliferación Ki-67 mostró una disminución de 8 veces en VEGF-Trap y el grupo de combinación de gemcitabina en comparación con el grupo de control (Figura 3A y C), lo que sugiere una supresión significativa de la proliferación de células tumorales en los grupos de tratamiento.
Aumento de la apoptosis de las células del tumor
para investigar más a fondo el mecanismo de los efectos combinados de VEGF-Trap y gemcitabina en tumores LLC, un ensayo de TUNEL se realizó para estudiar la apoptosis de las células tumorales. Como se muestra en la Figura 4A y B, el ensayo TUNEL reveló un marcado incremento en la apoptosis en los tejidos tumorales del grupo de terapia de combinación (
P
& lt; 0,01)., En comparación con los otros grupos
apoptosis (A) de la célula se evaluó por tinción TUNEL, las secciones representativas de tejidos de tumor LLC que fueron obtenidos a partir de ratones en día 15 después de la iniciación del tratamiento; Se determinó (B) El índice de apoptosis como se describe en "Materiales y métodos". *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01
vs
el grupo de control. Barra de escala, 50 micras.
Expresión Down-regulación de la proliferación, la apoptosis y anti-invasión proteínas relacionadas
Una vez establecidos los cambios en la densidad de los microvasos, la proliferación celular y el índice de apoptosis en respuesta al VEGF-Trap y la terapia de combinación de gemcitabina, el próximo tratado de investigar el posible mecanismo de los efectos combinados observados en el modelo de tumor
in vivo
mediante la evaluación de la expresión de la proliferación celular (ciclina D1), anti-apoptosis ( pro-caspasa-3, Bcl-2), y la invasión (MMP2, MMP9) relacionados con las proteínas mediante Western blot. En los extractos de tumores LLC en el día 15 después del inicio del tratamiento, ciclina D1, procaspasa, Bcl-2, MMP-2 y la expresión de MMP9 se redujo reguladas en VEGF-Trap y el grupo de combinación de gemcitabina en comparación con el grupo control (
P Hotel & lt; 0,01). Western blot resultados confirmaron que VEGF-Trap o monoterapia gemcitabina podrían regular a la baja la expresión de todas estas proteínas, pero la terapia de combinación mejorar aún más estos efectos (Figura 5A y B). Estos datos fue consistente con los resultados de análisis inmunohistoquímico y el ensayo de TUNEL (Figura 3, Figura 4).
(A) análisis de transferencia Western mostró que VEGF-Trap combinado con gemcitabina inhibe la expresión de la ciclina D1, Pro- La caspasa-3, Bcl-2, MMP2 y MMP9 en los tumores de LLC; (B) Cuantificación de los niveles de proteína. ß-actina sirvió como un control interno. cuantificación Densitómetro era con respecto al primer conjunto de datos en cada caso (indicado por un valor de 1). Todos los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
vs Francia El grupo de control
Discusión
la angiogénesis es un proceso estrechamente regulado, que implica un equilibrio dinámico entre las señales de estimuladores e inhibidores. La angiogénesis se produce cuando el equilibrio entre estimuladores e inhibidores angiogénicos está a favor de los estimuladores [24]. El bloqueo del estimulador angiogénico clave, VEGF, es un medio eficaz para inhibir la angiogénesis en modelos animales de tumores [25], [26]. Sin embargo, la monoterapia anti-VEGF ha limitado los beneficios clínicos para los pacientes con cáncer y en dosis altas a menudo puede conducir a diversos efectos adversos, tales como la hipertensión, proteinuria, trombosis, y GIP [27], [28]. Por lo tanto, se requiere más investigación para maximizar el efecto anti-tumoral y reducir al mínimo el número de efectos secundarios de la terapia antiangiogénica
.
La evidencia creciente sugiere que la combinación de inhibidores de la angiogénesis con quimioterapia produce mejores resultados terapéuticos en el tratamiento del cáncer [29] - [35]. Un ensayo clínico de fase III demostró que una combinación de bevacizumab anticuerpo monoclonal anti-VEGF con carboplatino-paclitaxel mejoró significativamente la supervivencia global (OS) en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con la quimioterapia sola [36]. Por lo tanto, es clínicamente relevante para explorar más combinaciones entre los agentes anti-angiogénicos y los regímenes de quimioterapia para más opciones terapéuticas.
Dado el amplio uso de gemcitabina en el tratamiento de NSCLC, es importante para determinar si la combinación de un agente anti-angiogénico con gemcitabina puede producir un beneficio clínico. Recientemente, un estudio de fase III (ensayo AVAiL) que compararon bevacizumab más cisplatino-gemcitabina a chemocherapy (cisplatino-gemcitabina) mostró una mejoría en la supervivencia libre de avance, pero no la supervivencia global [37]. Sigue siendo un reto para prolongar la supervivencia global del paciente en la parte superior de la terapia con gemcitabina.
VEGF-Trap es una proteína de fusión del receptor Fc-VEGF señuelo quimérico y ha sido recientemente aprobado por la FDA EE.UU. para el cáncer colorrectal metastásico [12]. En comparación con bevacizumab, VEGF-Trap es un inhibidor de la angiogénesis más potente debido a su mayor afinidad por VEGF. Además, VEGF-Trap también puede bloquear PlGF que es también un factor pro-angiogénico. Por lo tanto, sería interesante evaluar si la combinación de VEGF-Trap y gemcitabina puede dar lugar a una terapia más eficaz para el cáncer de pulmón.
En el presente estudio, la hipótesis de que una terapia de combinación compuesta de VEGF-Trap y gemcitabina podría conseguir efectos mejorados anti-tumorales. Para probar esta hipótesis, se examinaron los efectos terapéuticos de esta terapia de combinación en un modelo de cáncer de pulmón LLC. Los resultados mostraron que el tratamiento de combinación con VEGF-Trap y gemcitabina proporcionado beneficios más terapéutico que cada modalidad individual. La terapia de combinación tuvo efectos inhibidores significativamente más altos en el crecimiento del tumor y una tasa de supervivencia prolongado, no sólo la inhibición de la angiogénesis tumoral y la proliferación celular, sino también el aumento de la apoptosis de células dentro de los tejidos tumorales.
Para explorar el posible mecanismo que subyace a la mejora de la anti- la eficacia del tumor en la terapia de combinación de VEGF-Trap y gemcitabina, extractos de tejidos tumorales fueron estudiados por Western blot para la expresión de proteínas. Los resultados mostraron que el VEGF-Trap o gemcitabina sola regulados hacia abajo la expresión de la proliferación (Ciclina D1), anti-apoptosis (Pro-caspasa-3, Bcl-2), y la invasión (MMP2, MMP9) proteínas relacionadas, pero la combinación terapia resultó en una baja regulación más significativo de estos marcadores en comparación con los grupos de monoterapia. Estos datos son consistentes con los resultados de los análisis de inmunohistoquímica y ensayo de TUNEL, apoyando la idea de que la terapia de combinación de VEGF-Trap y gemcitabina puede mejorar la eficacia antitumoral.
La alta potencia de inhibición de VEGF por marcas y VEGF-Trap este agente en un socio ideal para la combinación con enfoques dirigidos a otros mecanismos de progresión tumoral. En las clínicas, la terapia de VEGF-Trap puede ofrecer beneficios adicionales a través de la normalización de la vasculatura del tumor, lo que reduce la presión intersticial y recipiente de la permeabilidad, y aumenta el suministro de otros agentes en los tejidos tumorales, que pueden hacer que las células tumorales sean más sensibles a la quimioterapia [38] - [40]. La combinación de la inhibición de VEGF continua por VEGF-Trap con otras modalidades de tratamiento puede representar una opción terapéutica más óptima en un número de tipos de tumores.
Nuestros resultados sugieren que la combinación de VEGF-Trap y gemcitabina podría ser una más alternativa eficaz para el cáncer de pulmón humano, que puede formar la base de un fundamento para los estudios clínicos en humanos para investigar los beneficios de la terapia de combinación de VEGF-Trap y gemicitabine en el cáncer de pulmón.
en conclusión, la terapia de combinación de VEGF -Trap y gemcitabina resultó en la mejora de la eficacia antitumoral en el modelo de tumor LLC. La terapia de combinación inhibe el crecimiento del tumor y la supervivencia de los animales prolongada por la angiogénesis tumoral suprimida y la proliferación celular, así como aumento de la apoptosis de células tumorales. la terapia de combinación /gemcitabina VEGF-Trap podría presentar una estrategia prometedora para el cáncer de pulmón humano.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La calidad y la actividad de VEGF-Trap. (A) La calidad de VEGF-Trap se determinó mediante la reducción de SDS-PAGE para mostrar como una sola banda con un peso molecular aparente de 50 kD; (B) de VEGF-Trap exhibió una potente actividad de unión a VEGF de ratón como se confirmó mediante un ensayo de unión directa
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068589.s001 gratis (TIFF)
figura S2.
Comparación de las características biológicas de las células LLC y Luc-LLC. La morfología celular y la migración (A), el crecimiento (B), y capacidad de formación de tumor (C) de las células de LLC y Luc-LLC se llevaron a cabo por la cicatrización de heridas, el ensayo de MTT y evaluación del modelo de tumor subcutáneo, respectivamente, que no mostró diferencias entre los transgénicos y las células no transgénicas. Barra de escala, 200 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0068589.s002 gratis (TIFF)
Reconocimientos
gracias Eli Lilly and Company Shanghai para la amabilidad de ofrecer gemcitabina (Gemzar).