Se necesitan
Extracto
Los biomarcadores para hacer frente a un tratamiento excesivo que se produce en la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata que no iba a morir de la enfermedad, pero reciben tratamiento radical. Una posible barrera para el descubrimiento de biomarcadores puede ser la naturaleza policlonal /multifocal de tumores de próstata, así como del tipo de célula heterogeneidad entre muestras de pacientes. Tumor-adyacente estroma (microambiente del tumor) es menos afectado por la alteración genética y por lo tanto pueden producir biomarcadores más consistentes en respuesta a la agresividad del tumor. Con este fin se compararon los perfiles de expresión génica Affymetrix en el estroma tumoral y cerca identificado un conjunto de 115 conjuntos de sonda para los que los niveles de expresión se correlacionan significativamente con el tiempo de recaída. También se compararon los pacientes que recayeron químicamente poco después de la prostatectomía (& lt; 1 año), y los pacientes que no recayeron en los primeros cuatro años después de la prostatectomía. Se identificaron 131 expresados diferencialmente microarray sonda fija entre estas dos categorías. 19 conjuntos de sonda (15 genes solapados entre las dos listas de genes con
p Hotel & lt; 0,0001). Hemos desarrollado un clasificador basado en PAM por la formación en las muestras que contienen estroma tumoral: cerca de 9 muestras de pacientes rápidas recaídas y 9 muestras de pacientes indolentes. A continuación, prueba el clasificador en 47 muestras diferentes, que contiene 90% o más estroma. El clasificador predice la situación de riesgo de los pacientes con una precisión promedio de 87%. Esta es la primera clasificador pronóstico basado en microambiente tumoral general. Estos resultados indican que el microambiente del cáncer de próstata exhibe cambios reproducibles útiles para predecir los resultados para los pacientes
Visto:. Jia Z, Rahmatpanah FB, Chen X, W Lernhardt, Wang Y, Xia X-Q, et al. (2012) Los cambios de expresión en el estroma del cáncer de próstata anunciar la recaída posterior. PLoS ONE 7 (8): e41371. doi: 10.1371 /journal.pone.0041371
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de mayo de 2012; Aceptado: 20 Junio 2012; Publicado: August 1, 2012
Copyright: © Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de la Salud socios estratégicos para la Evaluación de cáncer de Firmas (SPECS) Consorcio subvención U01 CA1148102 y la Red Nacional de Detección temprana del cáncer del Instituto de Investigación (EDRN) Consorcio CA152738 U01 subvención. Este trabajo también fue apoyado por la Universidad de California de Irvine Premio Facultad de Carrera Desarrollo (ZJ), una beca del Centro Integral del Cáncer de Chao Familia en la Universidad de California de Irvine (ZJ y DAM). Además, este trabajo fue apoyado en parte por el Departamento de Congreso dirigido programas de Investigación Médica de Defensa de conceder W81XWH-08-1-0720, y por la Universidad de California de Irvine Instituto para la Investigación del Cáncer del subsidio de estudios Fellowship (T32CA009054 del Instituto Nacional del Cáncer) ( FR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. MM y DM son cofundadores y WL es CEO de Proveri Inc. YW es empleado de AltheaDx Inc. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer de próstata es el cáncer masculino más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer en hombres en los Estados Unidos [1]. Cada año en los EE.UU., hay aproximadamente 230.000 casos nuevos de cáncer de próstata y aproximadamente se realizan 195.000 prostatectomías radicales [2]. Sin embargo, algunos pacientes pueden ser salvados por estos tratamientos, ya que sólo una minoría de los casos va a morir de la enfermedad si se deja sin tratamiento. El número necesario a tratar para salvar una vida estimada en dos estudios fue 12-15 [3] y hasta 48 [4]. Numerosos nomogramas y métodos de predicción relacionados se han creado en base a las variables clínicas en el momento del diagnóstico, pero, hasta la fecha, tales herramientas han proporcionado asesoramiento limitada con respecto a los cuales los pacientes albergan enfermedad agresiva que requiere tratamiento radical, posiblemente seguida de terapia adyuvante y qué pacientes pueden ser adecuados para un programa de vigilancia activa más conservador [5] - [9].
enormes esfuerzos se han invertido en el desarrollo de biomarcadores para el pronóstico del cáncer de próstata con un énfasis en las características del componente epitelial del tumor en muestras retrospectivas. Sin embargo, son pocos los biomarcadores clínicamente aceptadas y empleadas se han desarrollado. Una barrera para el descubrimiento de biomarcadores puede ser la heterogeneidad del tipo de célula y la naturaleza policlonal /multifocal de las alteraciones genéticas acumuladas en el momento del diagnóstico [10] - [13]. Por el contrario, las exposiciones microambiente tumoral mucho más limitadas y mutaciones de pérdida de heterocigosidad (LOH) [14], pero pueden responder a las señales paracrinas de la cercana tumor. Se ha demostrado que el microambiente de los casos seleccionados exhiben cambios histológicos distintos denominados "estroma reactivo" con distintos perfiles de expresión que se correlacionan con un peor pronóstico [15], [16]. De hecho, hemos demostrado que estroma asociado al tumor sin tener en cuenta subtipo posee perfiles de expresión únicos en comparación con estroma normal. Se han utilizado estos cambios de expresión génica para desarrollar un clasificador que puede diagnosticar con precisión la presencia de tumor en los casos de cáncer de próstata aun cuando las muestras utilizadas para el análisis no contienen tumor reconocible [13]. Este enfoque tiene potencial clínico para resolver cientos de miles de biopsias realizadas ambiguos en los EE.UU. cada año, lo que mejorará en gran medida el manejo de enfermedades y salvar vidas. Del mismo modo, la información de diagnóstico útil se ha obtenido a partir de examinar el estado de metilación de genes GSTP1 y APC en las biopsias de próstata iniciales negativos [17]. La expresión diferencial y perfiles epigenéticos en el estroma asociado a tumor en comparación con el estroma normal pueden reflejar las respuestas de estroma a factores paracrinos tumorales, así como otras influencias. Si la calidad y cantidad de este tipo de respuestas se correlacionan con los resultados clínicos tales como los fenotipos indolentes o agresivos, entonces la respuesta estroma tumoral a la cercana podría ser útil para derivar una regla general para el pronóstico. Otros investigadores han observado tales diferencias en cáncer de mama [18]. En este estudio, hemos probado esta hipótesis mediante la comparación de perfiles de expresión génica entre las muestras de estroma en los pacientes con resultados conocidos diferentes, independientemente de la histología, y la identificación de 115 conjuntos de sonda para los que los niveles de expresión se correlacionan significativamente con tiempos de recaída. También se compararon los perfiles de expresión entre un subconjunto de muestras de estroma de pacientes que recayeron rápidamente y muestras de estroma de los pacientes que no habían sufrido una recaída después de más de cuatro años. Se identificaron 131 conjuntos de sonda que tenían expresiones alteradas. Hubo 19 conjuntos de sonda (15) genes únicos en común entre estas dos listas de genes. entonces Derivamos un clasificador 15-gen. La precisión global fue del 87% cuando el clasificador fue probado en 47 muestras de ensayo independientes. la vía de análisis y estudios de ontología de genes indican estos 15 genes son considerablemente enriquecido para los genes que están involucrados en los procesos relacionados con la apoptosis. Estos estudios apoyan la posibilidad de que el estroma es una base práctica de la evaluación de riesgos.
Materiales y Métodos
Las muestras del enfermo de cáncer de próstata y Análisis de Expresión
Nuestra conjuntos de datos GSE8218 y GSE17951, los cuales son a disposición del público en la base de datos de la Expresión génica Omnibus (GEO), se basan en muestras de tejido congelado después de la prostatectomía obtenidos por el consentimiento informado a través de protocolos aprobados por el IRB y HIPAA conformes. Todos los tejidos fueron recogidos en la cirugía y es acompañado a patología para su revisión acelerada, disección, y broche de congelación en nitrógeno líquido. Clínica de datos de seguimiento fue asimilado por el programa de la UCI especificaciones y mantiene en una base de datos relacional. ARN para análisis de la expresión se hizo directamente a partir de tejido congelado después de la disección de OCT (compuesto de temperatura de corte óptima) bloques preparados a partir de las muestras se congelaron rápidamente con la ayuda de un criostato. Stroma partir de muestras de portadores de tumores se preparó a partir del tejido embebido-OCT que se montó en un criostato por ataque químico de una línea entre el tumor y el estroma con un escalpelo y luego la preparación de secciones congeladas que aparecen como dos piezas una de las cuales es estroma del tumor adyacente como se describe en [13]. Antes de la perfección de este método, algunos estroma fue preparado por disección mano de tejido congelado con un bisturí. Con el fin de evitar la contaminación, el método requiere mano dejando un hueco entre el tumor y el estroma de 0,5-1,0 mm y el estroma resultante se denomina estroma "cerca".
Para el análisis de la expresión de 50 microgramos (10 microgramos de tejido de la biopsia ) de las muestras de ARN total se procesaron para la hibridación de Affymetrix GeneChips (GSE17951: U133 Plus 2.0 plataforma; GSE8218: plataforma U133A). Para estos dos conjuntos de datos, las distribuciones de los cuatro tipos de células principales [células tumorales epiteliales, células del estroma, células epiteliales de la hiperplasia prostática benigna (BPH), y las células epiteliales de las glándulas quísticas dilatadas] se estimaron por hasta cuatro patólogos, cuyas estimaciones . se promediaron como se describe [19], [20]
conjunto de datos GSE25136 (plataforma U133A), que consiste en 79 casos portadores de tumores (& gt; 10% de células tumorales), fue desarrollado y utilizado como una forma independiente equipo de prueba. La distribución de tipo celular de este conjunto de datos se estimó utilizando CellPred, un
in silico
método para determinar el porcentaje de muestras de tumor en base a los valores de la expresión para las firmas de múltiples genes que no varían con los parámetros de patología quirúrgica del tumor de Gleason y la etapa (disponible en http://www.webarraydb.org/webarray/index.html) [20]. Tenga en cuenta que la distribución de células de tipo de conjuntos de datos GSE8218 y GSE17951 fueron proporcionados por hasta 4 patólogos [19], mientras que la distribución del tipo de célula del conjunto de datos GSE25136 se estimó por
in silico
método [20].
Métodos estadísticos
la normalización se llevó a cabo a través de múltiples conjuntos de datos utilizando los ~22,000 sonda fija en común a todos los conjuntos de datos. En primer lugar, el conjunto de datos fue GSE8218-cuantil normalizado usando la función '' normalizeQuantiles de la rutina LIMMA [21]. Los conjuntos de datos GSE17951 y GSE25136 eran entonces cuantil normalizado por referencia a los datos normalizados establecidos GSE8218 utilizando una función modificada '' REFnormalizeQuantiles que está disponible en la página web de especificaciones (http://www.pathology.uci.edu/faculty/mercola/UCISpecsHome. html) [22]. El paquete LIMMA de Bioconductor se utilizó para detectar genes expresados diferencialmente. Análisis de predicción para micromatrices (PAM [23]), aplicado en la I, se utilizó para desarrollar un clasificador basado en la expresión de los conjuntos de entrenamiento y luego se aplica a las unidades de prueba sin más cambios.
Resultados
gen asociado con
riesgo
se emplearon dos métodos para definir los genes expresados diferencialmente en el estroma de los casos de alto y bajo riesgo. corto tiempo de supervivencia libre de enfermedad (DFS) es un indicador comúnmente utilizado de agresividad [24] - [26]. En primer lugar, definimos los casos agresivos de cáncer de próstata que aquellos pacientes que experimentaron recaída de la enfermedad dentro de 1 año después de la prostatectomía, y los casos indolentes (o menos agresivos) como aquellos pacientes que ya sea en recaída después de 4 años después de la cirugía o que no recaer y tuvieron al menos 4 años 'datos de seguimiento disponibles. Sobre la base de estos criterios, se identificaron 40 muestras de pacientes rápida recaída que contienen estroma pura que estaban cerca al tumor y 9 muestras de pacientes con enfermedad indolente que contienen estroma pura que estaban cerca al tumor desde el conjunto de datos GSE8218. De estos arreglos se seleccionaron al azar 8 muestras de pacientes recaída rápidos y 7 muestras de pacientes indolentes como los conjuntos de entrenamiento y se compararon los perfiles de expresión de estos dos grupos usando LIMMA. Los genes con
p
valores & lt; 0,05 y doble cambio & gt; 1.6 (ya sea hacia arriba o hacia abajo-regulada reguladas) fueron identificados y utilizados para desarrollar un clasificador PAM. El clasificador resultante se ensayó posteriormente contra las muestras de los pacientes que no habían sido utilizados para la formación (32 muestras de pacientes recaída rápidos y 2 muestras indolentes paciente). Este proceso se repitió 1000 veces y se seleccionaron 3.625 sonda fija al menos una vez fuera de 1.000 veces en base a criterios de
p & lt
valores; 0,05 y doble cambio & gt; 1,6. La sensibilidad media y la especificidad del proceso de validación cruzada eran 69% y 82%, respectivamente. Un total de 131 conjuntos de sonda fueron seleccionados por PAM no menos de 500 veces del total de 1.000 iteraciones.
En segundo lugar, con el fin de identificar sonda fija asociados a una clase más amplia de valores de riesgo, el conjunto de datos fue de nuevo GSE8218 se utiliza para identificar conjuntos de sonda que se correlacionan con el tiempo de supervivencia libre de enfermedad, incluidos los pacientes que recayeron entre uno y cuatro años después de la cirugía. Conjunto de datos GSE8218 incluyó 49 muestras de estroma puros procedentes de 49 pacientes que se sometieron a la recaída del cáncer de próstata después de la cirugía. Tenga en cuenta que las 49 muestras de estroma utilizadas para el análisis de correlación no son idénticos a los casos 49 de estroma utilizadas para una rápida recaída
vs.
Comparación indolente que consisten en 44 casos en recaída (en común con los casos utilizados para el análisis de correlación) y 5 casos no presentaron recaídas. Se analizaron las 49 muestras de estroma caso de recaída por un análisis de correlación y se identificaron 115 conjuntos de sonda asociados-DFS mediante análisis de correlación de Pearson con los coeficientes de correlación & gt; 0,46 y asociados
p
valores & lt; 0,001). los coeficientes de correlación de Pearson para estos 115 conjuntos de sonda se extienden -0,46 a -0,61 o desde 0,46 a la 0,69. Diferentes genes relevantes de la enfermedad de progresión, más allá de las que se encuentran en los casos de recaída temprana y tardía (131 genes anteriores) fueron asumidos para ser descubierto en esta etapa de identificación de genes debido a los casos de riesgo medio (tiempo de recaída entre 1 año y 4 años) fueron incluidos.
Se trata de 19 conjuntos de sonda común entre los 131 conjuntos de sonda identificados por el análisis PAM permutado y los 115 conjuntos de sonda identificados a partir de análisis de correlación. Un estudio de simulación mostró que la probabilidad de observación de 19 superposición entre seleccionados al azar 131 conjuntos de sonda y 115 conjuntos de sonda a partir de una base de 22.000 conjuntos de sondas es & lt; 0,0001. Por lo tanto estos 19 conjuntos de sonda se solapan (cifra superior al azar) representan un acuerdo significativo entre dos conjuntos que no son idénticos de caso utilizando diferentes métodos de análisis. Los 19 conjuntos de sonda comunes, que representan el 15 genes únicos, se enumeran en la Tabla 1. Ejemplo parcelas de expresión de estos conjuntos de sonda
vs. Francia El tiempo DFS se muestran en la Figura S1.
clasificador de desarrollo y pruebas con conjuntos de datos independientes.
Los 19 superpuestas sonda fija se utilizaron para desarrollar un clasificador. De 40 muestras de cáncer de recaída rápidos desde el primer paso que contiene estroma tumoral cerca, se seleccionaron 9 muestras con los tiempos más cortos DFS, que se combinaron con los 9 muestras que contienen estroma tumoral cerca indolentes para formar un conjunto de entrenamiento. Se utilizaron los 19 conjuntos de sonda identificados en el paso anterior como PAM de entrada [23] para desarrollar un clasificador basado en estas 18 muestras de entrenamiento. El estado observado de los casos de entrenamiento como caso de comportamiento agresivo o indolente caso se ha especificado. Los 19 conjuntos de sonda fueron retenidos por el proceso de optimización de PAM con una precisión del último entrenamiento del 88,9% (Tabla 2).
Un mapa de calor (Figura S2) ilustra que los 194 genes (la combinación de la 131 conjuntos de sonda identificados por el análisis PAM y los 115 conjuntos de sonda identificados a partir de análisis de correlación) tenían perfiles distintos entre los casos de recaída rápidos y casos indolentes en las 18 muestras de la formación del estroma. Un volcán parcela (Figura S3) ilustra que algunos de los conjuntos de sonda tienen grandes cambios veces y bajos valores de p. Los 115 conjuntos de sonda con 19 conjuntos de sonda (15 genes únicos) en común con los 131 conjuntos de sondas identificadas a partir del análisis PAM permutada. El volcán parcela en la Figura S3 muestra que estos 19 conjuntos de sonda se encuentran entre los conjuntos de sonda más prometedores que tienen los mayores cambios veces y los valores más bajos p.
Con el fin de proporcionar una prueba objetiva del clasificador pronóstica, 47 independientes se emplearon muestras de ensayo, incluyendo 36 muestras de conjunto de datos GSE8218 y 11 muestras de conjunto de datos GSE17951 (no usados en el entrenamiento) para la prueba. Se observó una sensibilidad del 88,1% y una especificidad del 80% obteniéndose la exactitud promedio fue del 87% (Tabla 2,
Prueba
). El valor global predictivo positivo (VPP) y el valor predictivo negativo (VPN) de la prueba basado en las 47 muestras independientes fueron del 97,9% y 44,4%, respectivamente.
Con el fin de probar si el 15-gen clasificador de pronóstico generalmente se aplica a toda la gama de resultados y no se limita a la supervivencia seleccionado específico seleccionado para la formación en el primer paso, hemos probado 19 muestras (no incluidas en el entrenamiento) de pacientes que, o bien sufrieron una recaída entre los años 1 y 4 después de la cirugía o no una recaída pero no tenía datos de seguimiento de menos de 4 años. Estas 19 muestras incluidas 9 muestras de estroma de tumor cerca y 10 muestras de portadores de tumor (tumor & lt; 10%). El análisis de Kaplan-Meier indicó que el pronóstico clasificador 15-gen dicotomizó estas muestras ambiguas en dos grupos con riesgos significativamente diferentes (
p
= 0,02). Estas observaciones indican que la combinación de un método de entrenamiento basado en la supervivencia seleccionado en combinación con un método de correlación que utiliza la gama disponible completa de los tiempos de supervivencia libre de enfermedad produjo un clasificador con resultados precisos cuando se aplica a una cohorte de prueba independiente. Una representación de Kaplan-Meier de los resultados de la prueba para las muestras de ensayo 47 en combinación con los resultados de la prueba de estas muestras de estroma 19 mediana riesgo se resume en la Figura 1. Estos resultados proporcionaron una probabilidad de separación de probabilidad de las clasificaciones predichas con un
p = 0,0018
.
Para medir la importancia de la sonda 19 establece clasificador, hicimos un experimento basado en conjuntos de genes seleccionados al azar. Se seleccionaron al azar 19 conjuntos de sonda, de entre todos los 22283 sonda fija y reran la formación y la prueba, como se describió anteriormente. Este proceso se repitió al azar 1.000 veces. Los promedios de las características de funcionamiento se dan en la Tabla 2. Sólo el 7% de los clasificadores 1000 al azar tenía igual o mejor rendimiento que el clasificador pronóstico.
También registramos si se incluye la información clínica, como la puntuación de Gleason, tumor escenario y PSA preoperatorio añaden valor pronóstico para el clasificador. Se han utilizado estas tres variables en combinación con los 19 conjuntos de sonda como entrada PAM PAM y dejamos que seleccionar las mejores características de predicción. Ninguna de estas tres variables fueron recogidos por PAM. Además, se analizaron 65 casos (18 casos de entrenamiento y 47 casos de prueba de la Tabla 2) usando un multivariante de Cox de riesgos proporcionales de regresión, donde la edad, grado de Gleason, TNM y PSA antes de la operación se comparan con la predicción hecha por nuestro clasificador. Sólo predicción clasificador (
p = 0,0005
) y TNM (
p = 0,0383
) se asociaron significativamente con la supervivencia. El resultado indica que la firma genética tiene mejor valor predictivo y añade valor predictivo de las variables clínicas y patológicas conocidas.
pruebas de las muestras Stroma Lejos de tumor y el tumor muestras con bajas cantidades de Stroma
El 19 sonda fija (15 genes) forman un pronóstico firma específica a cerca de estroma tumoral. Para examinar si el clasificador 15-gen extendido a estroma que está lejos de tumor primario, hemos probado el clasificador en 9 muestras de estroma indolentes 8 de los cuales son
ahora
del tumor primario, tomado de una zona a la contralateral sitio del tumor. La exactitud o especificidad fue sólo 11,1% (datos no mostrados). Por lo tanto, cuando se prueba estroma desde posiciones remotas con una baja probabilidad de ser afectados por factores paracrinos tumorales, una respuesta estroma representada por los cambios de expresión de estos 15 genes no se detectó en contraste con tales cambios detectables en el estroma cerca de tumor. Para comprobar si el clasificador 15-gen era insensible a las grandes cantidades de contaminantes del tumor, lo probamos en 117 muestras de portadores de tumores (& gt; 10% de células tumorales con promedio de 48,5% del componente de tumor) en tres conjuntos de datos (GSE8218, GSE17951 y GSE25136) con una precisión global del 41%. Sin embargo, cuando el clasificador fue probado en 9 muestras que contienen & lt; 10% las células tumorales, la precisión fue del 89% (Tabla 2). Así, para el uso clínico previsto de la prueba, será importante muestrear estroma que es adyacente a pero libre de las células tumorales.
Análisis de función de los genes clasificador
Se analizó la sonda 19 conjuntos (15 genes) utilizando la herramienta bioinformática DAVID [27]. Los 15 genes se enriquecen de manera significativa en los genes asociados con la apoptosis y con la muerte celular (p & lt; 0,001 y & lt puntuación Benjamin; 0,05) (Tabla 1, en negrita y /o cursiva). Asimismo, analizaron los 194 genes (la combinación de los 131 conjuntos de sonda identificados por el análisis PAM y los 115 conjuntos de sonda identificados a partir de análisis de correlación) utilizando una herramienta de análisis de la vía de MetaCore (GeneGo Inc.). El sistema de filtración de MetaCore ayudó a limitar la búsqueda a aquellos genes que han sido reportados en el tejido específico, por ejemplo, tejido de la próstata. Los genes filtradas se utilizan para construir las vías de señalización. Las vías estadísticamente significativas tenían que cumplir la FDR & lt; 0,05 y múltiples genes (& gt; 2) asociado de forma significativa con los procesos biológicos. Para el análisis de los 194 genes, se utilizó 'músculo liso + biomarcador de la enfermedad »y« neoplasias prostáticas transcripción "como parámetros de filtrado. Los resultados del análisis de la vía MetaCore se enumeran en la Tabla S1.
Discusión
Anteriormente puso de manifiesto que hay cientos de importantes cambios en la expresión génica entre estroma tumoral y el estroma adyacente normal que se utilizaron para desarrollar una alta precisión de estroma específico de diagnóstico clasificador para la detección de la presencia del tumor-de-basado en la expresión de ARN de estroma sola [13]. Estos cambios de expresión-estroma específico es probable que sea debido a la reacción del estroma a los mediadores paracrinos derivados del tumor, así como un posible "efecto de campo". Aquí Además, la hipótesis de que puede haber diferencias de expresión entre el estroma de los tumores indolentes y agresivos, que podrían ser utilizados para el pronóstico clínico. Con el fin de probar esta hipótesis, se compararon los perfiles de expresión de genes entre las muestras de estroma de tumor adyacente de pacientes que experimentaron muestras de estroma rápida de recaída y adyacente tumorales de pacientes que no experimentaron recaída o para los que la recaída tomó muchos años. 40 muestras de estroma de rápida recaída y 9 muestras de estroma de casos indolentes se sometieron a un proceso de permutación para identificar genes expresados diferencialmente. En cada una de las iteraciones 1.000 /volver a muestrear, se utilizó el 31% de las muestras de estroma (8 sobre 40 muestras de estroma de recaída rápidos y 7 de los 9 muestras de estroma indolentes) para la formación y utilizamos las muestras restantes del estroma para la prueba. Debido al hecho de que teníamos pequeño número de muestras de entrenamiento, se seleccionaron pequeños pero similares números (8 y 7) para cada iteración con el fin de dar cabida a la remuestreo (análisis permutada). Las ventajas de este sistema son tres veces. En primer lugar, se trataba de un análisis equilibrado en cada nuevo muestreo. En segundo lugar, dicho régimen es robusto a posibles "malas" las muestras ya que las muestras malas pueden ser excluidos en muchas combinaciones de remuestreo. En tercer lugar, tal esquema puede aumentar drásticamente la base de detección (de un total de 3625 sondas fueron identificados por 1.000 el nuevo muestreo). Sin embargo, sólo se seleccionaron 131 conjuntos de sonda que se identificaron más de 500 veces en los 1.000 iteraciones para reducir la posibilidad de identificaciones falsas. También se identificaron 115 conjuntos de sonda de los cuales los niveles de expresión en el estroma tumoral adyacente se correlacionaron significativamente con el tiempo de supervivencia libre de enfermedad de los pacientes que se sometieron a la recaída de la enfermedad. Los 19 conjuntos de sonda comunes (15 genes únicos) de estas dos listas de genes importantes se utilizaron para desarrollar un clasificador basado en PAM, que tenía una precisión promedio de 87% cuando se probó en 47 muestras de tumores del estroma adyacente-independientes.
Recientemente, se ha informado de que en el cáncer de mama cualquier conjunto de 100 genes o más seleccionados al azar tiene una probabilidad del 90% que se asociaron significativamente con el resultado, y las firmas más publicados no son significativamente más relacionado con los resultados de los predictores al azar [ ,,,0],28]. Para hacer frente a este problema, hemos generado clasificadores aleatorios basados en el
mismas muestras de entrenamiento y los 1.000 conjuntos de conjuntos de sonda 19 seleccionados al azar y probado estos clasificadores al azar con los
muestras de prueba misma
tal como se utiliza para probar la 19-sonda conjunto pronóstico Stroma clasificador. El número medio de conjuntos de sonda seleccionada por PAM en los 1.000 juegos al azar es de 3,7, que se supone que es un ruido. Es decir, para cualquier conjunto elegido al azar de 19 conjuntos de sonda, un pequeño número de conjuntos de sonda se correlaciona con el estado alto /bajo riesgo por coincidencia, lo que explica por qué la exactitud promedio de entrenamiento de clasificadores azar fue ~ 70%. Sin embargo, estos clasificadores azar no funcionarían para los conjuntos de pruebas independientes. Por el contrario, los 19 conjuntos de sonda se identificaron a través de ambos enfoques rigurosos; Por lo tanto, son potencialmente marcadores pronósticos generales que se aplican a otras unidades de prueba. La comparación favoreció nuestro 15-gen (19 sonda conjunto) clasificador sobre los clasificadores generados a través de procesos aleatorios (Tabla 2).
Un número de genes identificados aquí por el desarrollo clasificador se han observado en otros estudios de la expresión del ARN en el estroma de tejido de la próstata. Se comparó el total de 227 conjuntos de sonda o 194 genes únicos identificados aquí con sonda fija-estroma específica previamente identificados en tres estudios como útiles para el diagnóstico. Hay 2 genes en común (PROM1, GPM6B) con los 339 conjuntos de sondas utilizadas para desarrollar nuestro clasificador de diagnóstico [13]; 3 genes (SEL1L3, KRT19, y KRT7) en común con los 119 genes expresados diferencialmente gen de Joesting
et al.
[29], y 3 genes (Nkx3-1, TPD52 y GALNT3) en común con los 44 genes que son expresados diferencialmente entre estroma asociado al tumor y el estroma no tumoral de 5 pacientes [30]. Estas observaciones indican que las firmas de pronóstico en el estroma son muy diferentes de las firmas de diagnóstico en el estroma.
En un estudio reciente, se llevó a cabo un análisis de todo el genoma LOH /desequilibrio alélica (AI) de ADN para identificar LOH /AI puntos fríos /calientes en el epitelio de la próstata, o en el estroma de la próstata, o en el que ambos identificaron 156 genes asociados con fenotipos clinicopatológicos incluida la recaída [14]. Cuatro genes (C7, SLPI, HOXB13, PDCD10) son compartidos con nuestros genes de pronóstico 194 estroma con un
p
valor de 0,08. Por lo tanto, la expresión de genes de unos pocos genes que hemos identificado como de potencial valor pronóstico podría ser alterado debido a los cambios genotípicos, y son de particular interés para el futuro, pero la mayoría de los genes que hemos identificado todavía no muestran una asociación de este tipo.
subconjunto de las muestras más agresivos en nuestro estudio tendrá estroma reactivo, que se ha demostrado que se correlaciona con un mal resultado [15]. Por lo tanto, se compararon los 194 genes expresados estroma que encontramos correlacionarse con los resultados de los 1150 genes que son expresados diferencialmente entre el subgrupo "estroma reactivo" de muestras de cáncer de próstata y el estroma distantes de los mismos 17 pacientes [15]. Diez genes (RABEP1, ZNF263, MCCC2, SLC4A4, TP53, KPNA6, PTPRF, CDH1, SCNN1A, y CD24) fueron en común entre los estudios (
p = 0,1312
valor, mediante una prueba basada en la simulación). Otro estudio reciente identificó 36 marcadores de pronóstico también elaborados específicamente del estroma reactiva [16]. Además, las muestras de ensayo tenían sustancial tumor presente, dejando abierta la posibilidad de que algunos genes son expresados diferencialmente entre el epitelio tumoral de un tumor de alto y bajo riesgo. A pesar de estas diferencias en el diseño experimental, cuatro genes (Nkx3-1, FOLH1, AGR2, HOXB13) son en común con nuestros 194 estroma genes de pronóstico con un
p valor Red de 0,0001, lo que indica un acuerdo sustancial. Por otra parte, los cuatro productos génicos están bien documentados biomarcadores de diagnóstico o pronóstico para el cáncer de próstata [31] - [35]. Estos genes serán de especial interés en los estudios futuros.
Se analizaron las funciones biológicas de los pronósticos de 19 conjuntos de sonda (15 genes) (Tabla 1) utilizando el software de David y MetaCore. Los resultados indicaron que el 7 de genes conocidos (GADD45B, Cdkn1a, NLRP1, ErbB3, ywhae, TNFSF10 y eIF5A) están relacionados con la apoptosis y 6 genes conocidos (CDKN1A, NLRP1, ErbB3, ywhae, TNFSF10 y eIF5A) están relacionados con la muerte celular, con 6 en común. Esto es intrigante basa en nuestra especulación de diálogo tumor de estroma que favorece la progresión del tumor. Tal vez, los tumores agresivos señales paracrinas proporcionan un mecanismo para obligar al estroma que rodea a someterse a procesos de remodelación y /o apoptóticas para facilitar el crecimiento del tumor y la invasión [36] seguido de epitelio-mesenquimal transición [37], [38]. Se necesita evidencia a partir de experimentos independientes a nivel molecular para apoyar esta hipótesis.
Asimismo, analizaron los 194 genes (la combinación de los 131 conjuntos de sonda identificados por el análisis PAM y los 115 conjuntos de sonda identificados a partir de análisis de correlación) usando un software vía MetaCore. El resultado del análisis de vías, mediante el uso de 'músculo liso + biomarcador de la enfermedad' como un parámetro de filtrado indica que este conjunto de 194 genes son considerablemente enriquecido en los genes asociados con 'neoplasias prostáticas transcripción'. Los siete genes asociados con esta descripción eran NCOA3 (TRAM-1), c /EBP (CEBP), NR77 (NR4A1), NK31 (Nkx3-1), P53 (TP53), KL5 (KL5), CEBPD. Por otra parte, se encontró que 3 genes STAT1, ErbB3, P21 (CDKN1A) estar asociado con "regulación neoplasias prostáticas de la progresión a través del ciclo celular 'y 1 STAT1 gen está asociado con' neoplasias prostáticas respuesta inflamatoria '. Pathway análisis usando 'músculo liso + enfermedad "como un parámetro de filtrado indicó que 67 de los 194 genes que se sabe que están asociados significativamente con enfermedades prostáticas y 66 de estos 194 genes que se sabe están asociados significativamente con neoplasias prostáticas (Tabla S1) de los cuales 59 son en común entre las dos listas. Por otra parte, la mayoría de estos 194 genes también están asociados con otros tipos de cáncer, como los tumores colorrectales, neoplasias de la mama y los tumores de pulmón, lo que indica que estos genes pueden ser comúnmente implicados en las vías relacionadas con el cáncer. La vía de análisis también demostró que una fracción significativa de estos 194 genes que interactúan con factores de transcripción, tales como P53, SP1, FOXO3A, AR, BCL6, STAT5A, STAT5B, C-Jun, Nrf2 MYOD y STAT1, que desempeñan papeles cruciales en el cáncer el desarrollo y la progresión. Por ejemplo, el factor de transcripción SP1 está asociado funcionalmente con 94 genes de la lista de genes 194 (figura S4).