Extracto
Antecedentes
La teoría de las células madre del cáncer plantea la hipótesis de que el cáncer se perpetúan por la madre de cáncer células (CSC) o células iniciadoras de tumores (TIC) que tienen otras propiedades de células madre similares a la auto-renovación y mientras las células que inician /madre no diferenciadas tienen una vida finita. Para investigar si la hipótesis es aplicable al cáncer de pulmón, la identificación de pulmón CSC y demostración de estas capacidades es esencial.
Metodología /Principal Encontrar
Los perfiles de expresión de marcadores de células madre de cinco (CD34, CD44, CD133, IMC1 y Oct4) fueron seleccionadas por citometría de flujo en líneas celulares de cáncer de pulmón 10. CD44 se investigó adicionalmente mediante pruebas de
in vitro en
y
in vivo
tumorigenecity. Formación de cuerpos esferoides y
in vivo
capacidad de la iniciación del tumor se demostraron en CD44
+ células de 4 líneas celulares. Serie
in vivo
transplantability tumor en ratones desnudos se demostró utilizando la línea celular H1299. Los xenoinjertos primarias iniciadas a partir de CD44
+ células CD44 consistieron mixta
+ y CD44
- células en proporción similar como la línea celular H1299 de los padres, el apoyo a
in vivo
diferenciación. Semi-cuantitativos PCR en tiempo real (RT-PCR) mostró que ambos CD44
células recién ordenados
+ y CD44 + derivadas de CD44
+ - tumores iniciados expresaron los genes pluripotencia
Oct4 /POU5F1
,
NANOG
,
Sox2
. Estos marcadores stemness no fueron expresadas por CD44
- células. CD44
células Por otra parte, recién ordenados + eran más resistentes al tratamiento con cisplatino con menores niveles de apoptosis que CD44
- células. El análisis inmunohistoquímico de 141 no pequeñas de cáncer de pulmón de células resecados mostró expresión de células de tumor de CD44 en 50.4% de los tumores, mientras que no se observó expresión de CD34, y CD133 en las células tumorales. expresión CD44 se asocia con el carcinoma de células escamosas, pero de forma inesperada, se observó una mayor supervivencia en los adenocarcinomas de CD44 que expresan.
Conclusión /Importancia
En general, nuestros resultados demostraron que las propiedades similares a células madre se enriquecen en subpoblaciones de algunas líneas celulares de cáncer de pulmón que expresa CD44. Se requieren nuevas investigaciones para aclarar el papel de CD44 en la renovación de las células tumorales y la propagación del cáncer en el entorno
in vivo
Visto:. Leung EL-H, Fiscus RR, Tung JW, estaño VP -C, Cheng LC, Sihoe AD-L, et al. (2010) de células no pequeñas células cancerosas de pulmón que expresan CD44 se enriquecen de propiedades de células madre-similares. PLoS ONE 5 (11): e14062. doi: 10.1371 /journal.pone.0014062
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 5 de Mayo, 2010; Aceptado: 26 Octubre 2010; Publicado: 19 Noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Leung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de un fondo semilla para la investigación básica (HKU 10.400.863 de Wong MP), una pequeña subvención del proyecto (HKU 200907176141 a EL Leung) y una beca de formación en investigación en el extranjero de la Junta médica de china, Universidad de Hong Kong, concedida a EL Leung. Este trabajo también fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones R01HL087948, Instituto Nacional del Cáncer de subvención R21CA131522 (a Y. Ma). La financiación del DOE DOE-FG02-08ER64608 en el Instituto del Cáncer de Nevada (a L. M. Fink), una financiación de arranque en el Nevada Cancer Institute y la Universidad del Sur de Nevada (a R. R. Fiscus). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo. El pronóstico global es pobre con la supervivencia alrededor de 5 año debido a la presentación tardía, recaída de la enfermedad y la falta de terapia sistémica curativa. Recientemente, la teoría de las células madre de cáncer (CSC) propone que los cánceres son mantenidos por subpoblaciones de células tumorales que poseen características madre o células progenitoras. Estas células pueden iniciar la formación de tumor, se diferencian a lo largo de las vías de multi-potentes y son relativamente resistentes a la quimioterapia convencional [1]. CSC se ha demostrado en algunos hematológicos y tumores sólidos tales como cánceres de mama, cerebro, colon, pulmón e hígado [2], [3], [4], [5], [6]. Varios marcadores de células madre de tejidos normales se han utilizado para la identificación y el aislamiento CSC. Por ejemplo, CD133 es el marcador más frecuentemente demostrado en cánceres de hígado, cerebro, colon y pulmón, etc [3], [4], [5], [6]. El CD44
+ /CD24
- /perfil bajo caracteriza CSC en los cánceres de mama y de próstata [7], [8]. células de expresión de los genes clave 'stemness' de embrionarias (ES) y la madre inducidas pluripotentes (iPS) Oct4 y IMC1 [9], [10] se han encontrado en CSC de diferentes tipos de cáncer [11], [12].
El perfil de marcador de pulmón CSC queda por explorar. Estudios recientes utilizando líneas celulares de cáncer y tejidos tumorales frescos pulmonares sugieren CD133 como el pulmón CSC marcador [3], [11], [13], [14], [15], [16]. Los estudios bioquímicos mostraron que CD133 juega un papel funcional en la regulación del ciclo celular y la proliferación, pero no la iniciación del tumor [17]. Los estudios en el cáncer de colon mostró que CD133
+ células tienen un mayor contenido de ADN [18] y se convierten en CD133
- durante la metástasis, pero ambos CD133
+ y CD133
- células iniciar tumor en ratones SCID [ ,,,0],19]. CD133
- poblaciones de cáncer de colon y melanoma también se encontró que eran tumorigénicas en SCID /ratones nude [19], [20]. Los marcadores como la ESA, CXCR4, ALDH y ABCG2 se han utilizado con CD133 para el aislamiento de CSC de los cánceres de pulmón [13], [21], [22]. CD34 y Sca-1 son útiles para identificar células madre de pulmón murino pero Sca-1 no se expresa en tejidos humanos [23]. Para explorar más marcadores CSC pulmón, hemos analizado el perfil de expresión de CD34, CD44, CD133, IMC1 y Oct4 en líneas celulares de cáncer de pulmón el 10 por citometría de flujo. Hemos demostrado que CD44
+ pero no CD44
- células de líneas celulares de cáncer selectivos podrían ampliarse y propagan en serie
in vitro
y
in vivo
. Proponemos que las células CD44-expresión se enriquecen de propiedades de células madre. Nuestro estudio no muestra que todos los
células CD44 + son de buena fe CSC, sin embargo, proponemos que CD44 podría ser un marcador de la capacidad de la iniciación del tumor en algunas células de cáncer de pulmón. El patrón de expresión de CD44 también se caracterizó en los cánceres de pulmón clínicos.
Resultados
Células madre perfil de expresión de los marcadores de líneas celulares de cáncer
Se analizó el perfil de expresión de superficie putativa ( CD34, CD44, CD133) y nucleares marcadores (Bmi1, Oct4) de las células madre en líneas celulares de cáncer de pulmón 10 utilizando citometría de flujo (Tabla 1). De los marcadores de superficie, CD34, CD44 y CD133 se expresaron en varias frecuencias. CD44 fue el principal marcador expresado por H1299 y H23. A549, H441 y H1648 no mostraron expresión de los marcadores de superficie estudiados. CD133 se expresa en solamente HCC1833. No se observó correlación en la frecuencia de expresión entre 2 marcadores. Tanto los marcadores nucleares, BMI1 y OCT4, se expresaron en la mayoría de las células cancerosas en todas las líneas celulares estudiadas. diagramas representativos de citometría de flujo análisis para la expresión de CD44 y CD133 se muestran en la figura 1. La inmunotransferencia e inmunohistoquímica (IHC) análisis también se realizaron en líneas celulares que contenían CD44
+ y CD133
+ poblaciones (Fig 2A). Inmunoblot mostró expresión de la proteína CD44 en H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827 y H23. proteína CD133 solamente se expresó en HCC1833 y PLC8024 que se utilizó como una línea celular de control positivo para CD133 [4]. IHC también mostró la expresión de CD133 en HCC1833 pero no H1299, y viceversa para la expresión de CD44. Por lo tanto, los resultados de ambos análisis estuvieron en línea con los datos de citometría de flujo.
diagramas representativos de citometría de flujo análisis de CD44 (FITC) y CD133 (PE) expresión en líneas celulares de cáncer de pulmón HKULC2, HCC827, HKULC4, H23, HCC1833, H1299 y H1650. Las células muertas, restos celulares y dobletes fueron cerrada a cabo. La compensación por la fluorescencia de fondo se llevó a cabo mediante la medición de las señales de destino de los controles de color individuales y los controles negativos. Los datos se presentan en 2D diagramas de trazado ya sea las señales de PE o FITC contra un ECD® canal irrelevante (también conocido como PE-Texas Red). Los porcentajes promedio de 3 análisis individuales se presentan en la Tabla 1.
A. inmunoblot representativo de H1650, HKULC2, H1299, HKULC4, HCC827, H23, HCC1833 y PLC8024 lisado total de proteínas utilizando anticuerpos contra CD44 y CD133. Actina se utilizó como control de carga. La transferencia se representativos de tres experimentos individuales. B. vista general que muestra la densidad de la formación de SB de CD44
+ y CD44
- H1299 células después del cultivo en medio RPMI con EGF, FGF y el suplemento de insulina durante 21 días (panel superior), y la morfología de SB en semanal intervalos (panel central). Las células de la primera generación SB se desagregan y se analizaron mediante citometría de flujo (panel inferior). El CD44
+ a CD44
- (81,58% a 9,68%) fue de similar a la de las células H1299 de los padres (81,3% a 18,7%, Tabla 1). SSC, dispersión lateral del canal. C. campos representativos de la formación de colonias de clasificar, CD44
+ y CD44
- H1299 células en agar blando después de cultivar durante 21 días. El recuadro muestra vistas ampliadas de las colonias representativas de las respectivas células tomadas bajo la misma ampliación. CD44
- subgrupos mostró una cantidad significativamente menor en comparación con las colonias tanto CD44
+ y subgrupos sin clasificar. (**, P & lt; 0,01). Histogramas representados promedio de 3 observaciones independientes de experimentos separados.
esferoide capacidad de formación de líneas celulares de cáncer
A continuación evaluó cuerpo esferoidal (SB) la capacidad de formación de FASC-fraccionado células de acuerdo a la expresión de CD44 y CD133 en 7 líneas celulares. 500 sin clasificar, marcador
+ y el marcador
- células, respectivamente, se cultivaron en condiciones no adhesivos y libre de suero con EGF, bFGF y suplementos de insulina durante 21 días. El porcentaje de formación de SB de cada línea celular se contó por selección aleatoria de campo en el día 21 y los resultados se representaron gráficamente como histogramas (Figura S1). células no clasificadas a partir de las 7 líneas celulares fueron capaces de formar SB. SB también se forma a partir de CD44
+ subpoblaciones de 6 líneas celulares en las que se expresó CD44, pero no de la CD44
- subpoblaciones. Además, HKULC2, H1299 y H1650 que contenía bajas proporciones iniciales de CD44
+ células dieron lugar a significativamente más SB en comparación con células no clasificadas (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01). Para HCC1833, CD133
+ pero no CD133
- células formaron SB. El aumento en el número de SB CD133
+ en comparación con células no clasificadas no fue estadísticamente significativa. Después de 21 días, todos los SB de H1299 CD44
+ células se disociaron en células individuales y se resuspendieron en medios de cultivo. Se establecieron hasta tres pases en serie, lo que indica
in vitro
auto-renovación de la CD44
+ células. La citometría de flujo análisis de la primera generación de células SB H1299 mostraron 81,58% de CD44
+ células, que se parecía mucho al 81,3% de las células de los padres, lo que demuestra que
in vitro
tumorigenecity de CD44
+ células dio lugar a una progenie con el mismo perfil de expresión CD44 (Fig. 2B). ensayo de clonogenicidad en agar blando también mostró que recién aisladas H1299 CD44
+ células formadas significativamente más colonias de CD44
- células en 3 semanas (** p & lt; 0,01), el apoyo a una mayor capacidad de auto-renovación de las células seleccionadas de CD44- (Fig. 2C).
en vivo
+ células CD44 propiedades de iniciadoras del tumor y el aumento secuencial de la eficacia del trasplante en ratones desnudos
la capacidad de la Las células seleccionadas por marcadores para iniciar
in vivo
tumor se investigó mediante trasplante subcutáneo en ratones desnudos. Para H1299, HKULC4, H1650 y HCC827, tan sólo 10.000 CD44
+ células fueron capaces de iniciar tumores en 30-68 días (Tabla 2), pero ningún tumor se forman a partir del mismo número de clasificar o CD44
- las células después de 90 días. Para las células sin clasificar de H1299, la iniciación del tumor se podría lograr por 200.000 células (3/4 ratones), mientras que con CD44 + células, los tumores se iniciaron por 10.000 (1/4 ratones), 50 000 (3/4 ratones) y 100.000 células (4 /4 ratones). Por CD44
- las células, se formó ningún tumor incluso utilizando 200.000 células (0/4 ratones) (Fig tumores 3A-representativa, la Tabla 2.). Hemos diseccionado los ratones y se examinaron todos los órganos y no encontró la formación de tumor metastásico de las células clasificadas o no clasificadas bajo el período observado. Para HKULC2 y H23, aunque se observó la formación de SB, no se formó ninguna xenoinjertos de tumores utilizando 200.000 sin clasificar, CD44
+ o CD44
- células. Del mismo modo, 200.000 sin clasificar, CD133
+ o CD133
-. HCC1833 células no formaron tumores
A. imágenes representativas de tumores de xenoinjertos primarios. la iniciación del tumor se logró por 200.000 células no clasificadas (3/4 ratones). De CD44
+ células, los tumores se iniciaron por 10.000 (1/4 ratones), 50 000 (3/4 ratones) y 100.000 células (4/4 ratones). Ningún tumor se formó con 200.000 CD44
- células (0/4 ratones). PBS, control de la inyección de solución salina. B. La citometría de flujo análisis de xenoinjertos primarios y secundarios desagregados mostraron similares CD44
+ para CD44
- relaciones de los subgrupos como las células H1299 parentales. Eje X: expresión CD44, el canal de FITC; Eje Y: Las células muertas teñidas por el canal de PI, PE. C. semicuantitativo RT-PCR análisis de xenoinjertos primarios mostraron una expresión de CD44 forma estándar (CD44s) y pluripotencia genes (
POU5F1
,
NANOG
,
Sox2
) en CD44
+ pero no CD44
- subgrupos. D. Análisis IHC de xenoinjertos de generaciones sucesivas de ratones receptores mostró que la expresión de CD44 en la distribución de la membrana celular. Las células huésped de origen de ratón presentes en el estroma del tumor no estaban manchadas. curvas de crecimiento tumoral de la primaria, los xenoinjertos de tumores secundarios y terciarios formados por células H1299 no seleccionados y ordenados CD44-se representaron mediante la observación y la medición de la formación de tumores semanal de hasta 9 semanas, los ratones después de lo cual fueron escarificadas para evitar el crecimiento excesivo de los tumores.
los siguientes experimentos probaron si la capacidad de la iniciación del tumor pudo propagarse
in vivo
. Desde H1299 + CD44 mostró la menor latencia de la formación de tumores (Tabla 2), que disociamos H1299 tumor primario para demostrar
in vivo
tranplantability serie. Sólo se seleccionaron las células tumorales viables de xenoinjertos H1299 desagregados para el trasplante de tumor en serie en secundario, y posteriormente, los ratones receptores terciarias. Los tumores se forman a partir de CD44
+ pero no CD44
- células (Tabla 3). Cabe destacar que, aunque las proporciones de CD44 en vivo
+ células (47,73% para primaria, 0,91% para secundaria) (Fig 3B) se redujeron en el trasplante de serie, la eficiencia de la iniciación del tumor aumentó en las generaciones sucesivas de tumor. La latencia de la formación de tumores de 5.000 CD44
+ células se redujo progresivamente a partir de los 30 días de la primera generación, a los 21 días de la segunda y 14 días de la generación terciaria, respectivamente. El número de células necesarias para iniciar los tumores terciarias también se redujo a 1.000 CD44
+ células.
Para analizar la capacidad de diferenciación de CD44
+ células, los tumores recogidos fueron desagregados y se somete a citometría de flujo análisis. El CD44
+ :CD44
- relación entre el tumor primario fue 80.72:17.0, y del tumor secundario fue 85.4:12.53. Estos fueron en el mismo rango que las células parentales (81.3: 18,7), lo que demuestra la expresión CD44 jerarquía similar de generaciones sucesivas de xenoinjertos (Fig. 3B). Un análisis más detallado del tumor primario mediante RT-PCR reveló la expresión de los marcadores de pluripotencia
POU5F1
,
NANOG
y
Hoteles en Sox2 CD44
+ pero no CD44
-. subpoblaciones (Fig. 3C)
Fig. 3D muestra la tinción inmunohistoquímica para CD44 representativa y curvas de crecimiento tumoral de los xenoinjertos de primaria y en serie trasplantados. Como se muestra en la curva de crecimiento del tumor, los tumores primarios y en serie trasplantados inician desde 50.000 CD44
+ células crecieron más de 200.000 células no clasificadas.
CD44
+ células expresado pluripotencia y epitelio-mesenquimal-Transición (EMT) y marcadores poseído potenciales de diferenciación
La expresión de los genes pluripotencia y la adquisición de rasgos mesenquimales han sido mostrados para indicar un fenotipo de células madre. Hemos demostrado co-expresión de las proteínas embrionarios Oct4, Sox2 NANOG y por los estudios si en SB de CD44
+ H1299 células. Semi-cuantitativos RT-PCR también se realizó en CD44 recién ordenados
+ y CD44
- H1299 células. La expresión de
Oct4
,
NANOG
,
Sox2
y los marcadores mesenquimales
Snai1
,
CDH2
y
VIM
se muestra en CD44
+, pero fueron más bajos o indetectables en CD44
- células. Dado que la expresión diferencial de la norma (
s
) y formas variantes (
v3
,
v5
,
v6
y
v10
) de CD44 se ha demostrado en tallo o células diferenciadas, se investigó el patrón de
CD44
empalme del ARNm por RT-PCR. Tanto las formas estándar y variantes se encontraron en CD44
+ pero no CD44
- las células, lo que sugiere la retención de
CD44 mRNA
potenciales de corte y empalme diferencial de CD44
+ CD44 en comparación con
- subpoblación (Fig. 4A & amp; B).
A. Caracterización de inmunofluorescencia de la SB de CD44
+ subpoblación, que muestra la co-expresión de Oct4, Sox2 y NANOG. DAPI, el control; Green, Oct4-FITC; Rojo, Sox2-Texas Red; Azul, pseudocolor de NANOG por el anticuerpo conjugado con PE. B. semi-cuantitativa análisis de RT-PCR mostró genes pluripotencia,
Snai1
,
CDH2
,
VIM
,
CD44s
y
v3 CD44 , 5,6,10
expresión en CD44
+ células. CD44
- H1299 células carecen de estas expresiones a excepción de
CDH2
y
VIM
. C. CD44
+ células eran más resistentes a los efectos apoptóticos de cisplatino 5 mM en comparación con CD44
- en las células H1299 y H1650 después de 24 horas de incubación. Los histogramas representan la media de tres experimentos individuales de los no seleccionados, células CD44 + y CD44- antes y después del tratamiento con cisplatino.
CD44
+ células eran resistentes al cisplatino
recién ordenados CD44
+, CD44
- y células no clasificadas de H1299 y H1650 se cultivaron en medio RPMI sin suero y se sometió a tratamiento con cisplatino 5 mM durante 24 horas. El histograma en la figura. 4C representa el promedio de tres experimentos individuales para ambas líneas celulares. Apoptóticas y células no viables se midió mediante tinción con anexina V y PI usando citometría de flujo, respectivamente. Para H1299, cisplatino-tratamiento de clasificar o CD44
+ células dieron lugar a un aumento significativo de las células apoptóticas en comparación con el control sin tratar, lo que indica la resistencia a cisplatino relativa. CD44
- células mostraron un aumento significativo en la apoptosis (*** p & lt; 0,001) después del tratamiento indica la sensibilidad cisplatino. Al comparar entre los grupos, CD44
- células mostraron aumentos significativos (### p & lt; 0,001) de la apoptosis en comparación con ambos
células no clasificadas y CD44 +, lo que indica que CD44
- células fueron los más cisplatino sensible de los 3 grupos. También se observaron resultados comparables para H1650, lo que indica la resistencia a cisplatino relativa de la no seleccionados y CD44
+ células. Además, las células H1299 resistentes de forma estable seleccionados por el tratamiento con cisplatino largo plazo mostraron un porcentaje más alto basal (96,2%) de CD44 células
+ en comparación con las células parentales (82%). Del mismo modo, para H1650, CD44 basal
+ porcentaje aumentó del 61,5% al 92,9%. Los resultados indicaron resistencia y una ventaja de supervivencia de CD44
+ células bajo tratamiento con cisplatino crónica (Figura S2).
El análisis inmunohistoquímico de marcadores de células madre del cáncer en el CPNM muestras
Para evaluar la
in vivo
expresión de proteínas en la expresión de CD44, IHC se realizó en núcleos tumorales vestida de 141 carcinomas de pulmón primario y los tejidos pulmonares reactivos o fetales. En los tejidos de control, se observó la expresión de CD44 de la membrana celular en las células basales de las vías respiratorias o de metaplasia escamosa epitelio bronquial, y la regeneración de los neumocitos cúbicas de pulmón lesionado. No se observó expresión en las células epiteliales terminales diferenciadas tales como las células ciliadas o no ciliadas columnares de epitelio bronquial, o neumocitos tipo I planas que recubren los espacios alveolares. En primer trimestre de pulmón fetal humano, CD44 se expresa en el epitelio de las vías respiratorias primitivos (Fig. 5A). En los cánceres de pulmón, la expresión estaba presente en los macrófagos alveolares y linfocitos pequeños que sirvieron como controles positivos internos. Totalmente, 62/141 (50,4%) casos mostraron expresión de CD44. SCC se asoció significativamente con la expresión de moderada a fuerte (21/27, 77,8%) en comparación con AD (41/96, 42,7%) (p = 0,002) (figura 5B). En SCC que muestra moderada a la diferenciación así, CD44 se expresó mucho más fuertemente en el basal en comparación con maduración células tumorales (Fig. 5B), en consonancia con los nichos de células madre esperados. Cuando sólo se consideraron AD, la expresión de CD44 mostró una débil asociación con los no fumadores (p = 0,024). Para AD, prueba Log Rank mostró que los pacientes con expresión de CD44 negativo o débil tenían una significativamente peor global (p = 0,015), pero no la supervivencia libre de progresión. Para SCC, no se observó una relación significativa de la supervivencia con el nivel de expresión de CD44. No se observó ninguna asociación con otros parámetros clínico, incluyendo la edad del paciente, el sexo, el grado del tumor, el tamaño, el escenario, los ganglios linfáticos, o el estadio patológico (Tabla S2). la expresión de CD133 se detectó sólo en células pequeñas dispersas en el estroma de los tejidos fetales y adultos de pulmón reactivos. El epitelio bronquiolar basal, la regeneración de los neumocitos o células tumorales fueron negativos. CD34 se detectó en el endotelio y las células estromales reactivos en algunos tumores, pero no las células cancerosas. Para asegurarse de que la ausencia de tinción no se debió a la variación regional de distribución celular, los resultados fueron validados mediante la repetición de análisis de IHC en secciones completas de cáncer en casos selectivos.
A. la expresión de CD44 en la etapa seudoglandular de embriones de pulmón (izquierda) y la regeneración de los neumocitos de pulmón con lesión alveolar difusa (derecha). El recuadro muestra CD44
+ células basales en el epitelio bronquial normal. B. Casos representativos de los adenocarcinomas (AD) que muestra moderada (izquierda) y (derecha) la expresión de CD44 fuerte en la distribución de la membrana celular. En algunos casos de carcinomas de células escamosas (SCC), la expresión de CD44 fue particularmente prominente en las células tumorales en la periferia (flecha) que las regiones centrales (asteriscos) de las islas de tumores que generalmente se consideran como sitios de células madre. linfocitos pequeños y dispersos marcophages también mostraron expresión de CD44 en el estroma tumoral. análisis de supervivencia C. Kaplain Meier de los pacientes con EA (panel superior) y SCC (panel inferior) estratificó según CD44
+ (tumores con expresión fuerte /moderado) o CD44
- (débil, ausente tinción /focal) . PFS, la supervivencia libre de progresión en meses; OS, ovrall supervivencia en meses.
Discusión
La hipótesis de que los cánceres son mantenidos por una subpoblación de células madre o progenitoras similar mientras que los no-madre /células progenitoras tienen una vida finita lapso plantea la posibilidad de que la orientación de los componentes específicos de las vías de regulación de mantenimiento de las células madre del cáncer podría proporcionar un medio de control del cáncer. Como paso previo a investigar si esta hipótesis es aplicable a los carcinomas de pulmón, es necesario para identificar y aislar células de cáncer de iniciar el uso de marcadores adecuados. Mientras que todavía se está explorando el enfoque óptimo para este fin, el análisis de citometría de flujo y clasificación de las células de marcador positivo es actualmente el método más ampliamente aplicada [24]. Entre los marcadores de superficie estudiados, hemos demostrado que CD44
+ células se enriquecen de la capacidad de propagación del tumor y CD44 es un marcador potencial de CSC de líneas celulares de NSCLC. En un estudio reciente sobre los cánceres de pulmón metastásico en derrame pleural maligno, CD44 también se informó como un posible marcador de células madre, pero la caracterización de las propiedades de células madre-como se basó en
vitro expansión análisis y celular molecular en
[ ,,,0],dieciséis]. En nuestro estudio,
in vitro
y
in vivo
tumorigenecity de CD44 se mostró
+ células. Por otra parte, nuestros experimentos de xenoinjertos mostraron una mejora progresiva de la eficiencia del trasplante en las generaciones sucesivas tumorales con el acortamiento del período de latencia y disminución de la dosis mínima celular del injerto. Una capacidad de formación de tumor creciente Se informó también de Du et al. que investigó CD44
+ subpoblaciones de células de cáncer de colon [25]. Se demostró que las células epiteliales de mama inducido a someterse a EMT para adquirir caracteres de células madre similares y tumorigénicos [26]. En nuestro estudio, CD44
+ células también se asociaron con la expresión de marcadores de EMT que implican tales como
Snai1
,
CDH2
y
VIM
. Sólo CD44
+ células expresaron la pluripotencia genes
POU5F1
,
NANOG
y
Sox2
[10], [27], [28], [29], mientras que estos marcadores se perdieron en CD44
- células, lo que sugiere que EMT pueden estar implicados en el mantenimiento de stemness. Se necesitan más investigaciones para dilucidar el mecanismo subyacente y la interacción entre estas proteínas del complejo de transcripción y expresión de CD44.
En las células H1299 y H1650 cultivadas, CD44
+ células apoptóticas demostraron un nivel basal más baja y la resistencia en relación con cisplatino tratamiento en comparación con CD44
- células. Esto indica su capacidad de resistencia contra quimiotoxicidad y la capacidad para mantener la homeostasis del tejido, las características cree que está asociada con el fenotipo de células madre de tejido. Por otro lado, cuando CD44
+ células fueron trasplantadas de la
in vitro
a
in vivo
entorno de disparo de pérdida de células marcadas a través de la apoptosis, un 100 veces de reducción de células tumorales era capaz para iniciar los tumores a un ritmo más rápido en las generaciones sucesivas ratones, lo que demuestra la solidez de la subpoblación de células madre similares a las contenidas en las celdas seleccionadas. Esto también podría indicar que sólo una parte de la CD44 se requerían
+ células para la iniciación del tumor, y que el aumento de CD44 tumorigenecity
+ células se debió a
in vivo
enriquecimiento de CSC. Otros estudios con marcadores y criterios de selección refinados son necesarias para más específica
in vitro
CSC aislamiento.
CD133 es el marcador más frecuente y se ha utilizado para aislar CSC de los cánceres de pulmón frescas [13] , [15], pero en nuestro estudio, la mayoría de líneas celulares de cáncer no mostraron expresión significativa CD133 por cualquiera de las semi-cuantitativos de RT-PCR (datos no mostrados), IHC, inmunotransferencia (Fig. 2A) o citometría de flujo análisis (Tabla 1). Utilizando el mismo anticuerpo anti-CD133, Chen et al. sólo el 0,7% observado la expresión de CD133 en H1299, mientras que no se encontró expresión en nuestro estudio [11]. Entre nuestras líneas celulares estudiadas, solamente HCC1833 mostró la formación SB-CD133 en la selección, pero
in vivo
tumorigenecity no pudo demostrarse. El uso de otras especies de ratones que son inmunológicamente más tolerante hacia los xenotrasplantes podrían revelar resultados diferentes. No hay datos acerca HCC1833 están disponibles en la literatura para la comparación. Stuelten et al también encontró que la expresión de CD133 poco frecuente en el panel de células de cáncer NCI60 [30]. Se observó la expresión de CD44, pero en dos líneas celulares, sus hallazgos se diferenciaba de la nuestra. Observamos 0% y el 95,9% de CD44 en A549 y H23, pero 84,41% y 30,95%, respectivamente, fueron detectados por los investigadores [30]. No podemos explicar las diferencias, pero los datos de otros tipos de cáncer también se han reportado observaciones discrepantes. Por ejemplo, un estudio informó 38-72% de las células CD133 + en la línea celular de cáncer de ovario SKOV3 mientras que el porcentaje encontrado por Stuelten et al fue sólo 0,78%. Diferentes porcentajes de marcadores también se han encontrado en el colon y el hígado las células del cáncer [30], [31], [32]. La inconsistencia de CSC expresión marcador de perfil entre los diferentes estudios podría estar relacionado con la variación individual de cáncer, pero también puede deberse a diferentes estados de potencia, características de composición o funcionales de la madre de cáncer o poblaciones progenitoras. En ausencia de un marcador específico, el verdadero porcentaje de CSC en un tumor, en particular que, en líneas celulares de cáncer establecidas desde hace tiempo, es controvertido [24]. La variación en las presiones ambientales y selectivos experimentadas por las células cancerosas
in vitro
y
in vivo
podrían desencadenar o suprimir diferentes vías de las redes moleculares que regulan las funciones de CSC, y no está claro si la CSC perfil marcador podría variar según las circunstancias. Si bien hemos demostrado que CD44
- células son incapaces de perpetuación tumor, son claramente necesarios métodos más refinados para la selección y caracterización CSC. Valdría la pena explorar si CD44 podría combinarse con otros marcadores potenciales CSC como ALDH, CXCR4, ABCG2, marcador de lado la población, la ESA, etc., para mejorar la eficiencia y la especificidad de CSC selección [13], [21], [22], [33].
CD44 es una glicoproteína unida a la membrana que media una compleja gama de funciones. Estudios recientes han prestado apoyo a su papel como marcador CSC. Por ejemplo, la capacidad de expansión y la iniciación de xenoinjerto clonal de CD44
+ - seleccionado cáncer colorrectal CSC puede ser inhibida por CD44 knockdown [25]. Homocigota eliminación CD44 afectó la supervivencia células de la cripta intestinal y tumorigenecity atenuada sin afectar a la proliferación en un modelo de carcinoma de colon de ratón primario [34]. Mecánicamente, el crecimiento invasivo y metastásico puede ser mediada a través de la interacción de CD44 de la superficie celular con componentes de la matriz extracelular tales como ácido hialurónico con los cambios posteriores inducidas en la maquinaria del citoesqueleto de las células del cáncer [35]. CD44 expresado en la superficie de las células de cáncer de colon se ha demostrado que facilitar la unión endotelial P o L-selectina y aumentar el acceso a tumor diseminación hematógena [36]. CD44 también está conectado en red a muchas cascadas de señalización que median las funciones de mejora de tumores. Actúa como un co-receptor con la vecina EGFR u otros receptores de la familia ErbB tirosina quinasas [37], y puede activar las vías de proliferación celular indirectamente a través de la presentación ligando tal como el factor de dispersión a su receptor c-MET [38]. supervivencia de las células del tumor también se puede mejorar a través de la activación de vías anti-apoptóticos, tales como la cascada de PI3K /AKT [39], [40] y Bcl2 y Bcl-XL factores de transcripción [41]. Un informe sobre los cánceres de pulmón de células mostró que la activación de la señalización de CD44-MAPK-PI3K dio lugar a una mayor expresión de uPA /uPAR y MDR1, se derivan mayores fenotipos invasivos de cáncer resistentes a múltiples fármacos y [42]. Se ha sugerido que las formas variantes de CD44, especialmente CD44v6 que se expresa transitoriamente durante el desarrollo embrionario de pulmón, media la migración de células tumorales y la invasión y pueden ser suficientes para un marcador CSC [43]. Cabe destacar que en nuestra CD44
+ - derivada SB y xenoinjertos, el ARNm de ambos se expresaron las formas estándar y variantes de CD44
Las técnicas de inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal contra la forma estándar de CD44 mostró que en no. : cáncer de pulmón, CD44 no se expresa en el epitelio pulmonar terminales diferenciadas pero está regulada positivamente en los sitios considerados generalmente como reserva o nichos de células troncales y en la regeneración de las células de revestimiento alveolares de los pulmones lesionados.