humano
Extracto
SnoN es un regulador negativo de la señalización de TGF-β y también un activador del gen supresor tumoral p53 en respuesta al estrés celular. Su papel en el cáncer humano es complejo y controvertido con ambas actividades pro-oncogénicos y anti-oncogénicos reportados. Para aclarar su papel en el cáncer humano y proporcionar la relevancia clínica de sus actividades de señalización, se analizó la expresión SnoN en los tejidos del esófago, ovario, páncreas y mama humanos normales y cancerosas. En los tejidos normales, SnoN se expresa tanto en el epitelio y el estroma que rodea a un nivel moderado y es predominantemente citoplásmica. niveles SnoN en todos los epitelios tumorales examinadas son más bajos que o similar a la de las muestras normales de la misma, de acuerdo con su actividad anti-tumorigénico en las células epiteliales. En contraste, la expresión SnoN en el estroma está altamente regulada positivamente en las células inflamatorias se infiltran en esófago de alto grado y las muestras de tumor de ovario, lo que sugiere que SnoN puede promover potencialmente la progresión maligna a través de la modulación de la microambiente tumoral en estos tipos de tumores. Los niveles globales de expresión SnoN en estos tejidos de cáncer no se correlacionan con el estado de p53. Sin embargo, en líneas celulares de cáncer humano con la amplificación de la
SnoN
gen, se detectó una fuerte correlación entre el aumento de número de copias SnoN y la inactivación de p53, lo que sugiere que la vía de SnoN-p53 supresor de tumores debe ser inactivado, ya sea a través regulación a la baja de SnoN o inactivación de p53, con el fin de permitir que las células del cáncer de proliferar y sobrevivir. Estos datos sugieren fuertemente que SnoN puede funcionar como un supresor de tumores en etapas tempranas de la tumorigénesis en los tejidos de cáncer humano
Visto:. Jahchan NS, Ouyang G, K Luo (2013) perfiles de expresión de SnoN en condiciones normales y cancerosas Humano Los tejidos de respaldar su función de supresor tumoral en el cáncer humano. PLoS ONE 8 (2): e55794. doi: 10.1371 /journal.pone.0055794
Editor: Christina Lynn Addison, Ottawa Instituto de Investigación del Hospital, Canada |
Recibido: 4 de noviembre de 2012; Aceptado 30 de diciembre de 2012; Publicado: 13 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Jahchan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio está apoyado por el NIH RO1 CA101891 y SR1 DK090347 a K. Luo y el DOD BCRP beca predoctoral a N. Jahchan. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
SnoN (Ski-nueva proteína) fue descubierto puño como una oncoproteína que puede inducir la transformación de gallina y codorniz fibroblastos embrionarios cuando se sobreexpresa [1] - [4]. En los mamíferos, SnoN contiene tanto actividades pro-oncogénicos y anti-oncogénicos. La actividad pro-oncogénica de SnoN depende de su capacidad para unirse a las proteínas Smad y antagonizar las respuestas citostáticos de TGF-β [5], [6]. Suppporting su papel pro-oncogénica, la expresión SnoN es elevada en la mayoría de las líneas celulares de cáncer humano, y la reducción de la expresión SnoN por shRNA en el cáncer de mama invasivo y líneas celulares de cáncer de pulmón inhibe el crecimiento tumoral tanto
in vitro
y
in vivo
[7]. Más importante, la sobreexpresión de SnoN en la glándula mamaria de ratón acelera el desarrollo de cáncer de mama y la metástasis pulmonar inducida por el antígeno de polioma medio T (PyVmT) [8], proporcionando la primera
in vivo
apoyo a la actividad pro-oncogénica de SnoN. En los últimos años, sin embargo, cada vez más pruebas han surgido que indica que SnoN también puede actuar como un supresor de tumor. ratones heterocigotos que carecen de una copia de la
SnoN
gen muestran una mayor susceptibilidad a la tumorogénesis inducidos por carcinógenos, lo que sugiere que SnoN puede proteger a los ratones de la carcinogénesis [9]. Recientemente hemos demostrado que los altos niveles de SnoN inhiben la transformación inducida por oncogenes de ratón primaria fibroblastos embrionarios
in vitro
y el bloque de desarrollo de tumores en
in vivo
en un modelo de ratón de carcinogénesis de piel de dos etapas [10 ]. Esta actividad anti-oncogénica de SnoN es independiente de su capacidad para reprimir la señalización de TGF-β y probablemente se debe a su capacidad de inducir la estabilización de p53. En respuesta a estrés celular, altos niveles de SnoN es reclutado para los cuerpos nulcear PML donde induce la estabilización de p53, lo que lleva a un aumento de la senescencia celular y la apoptosis [10]. Por lo tanto, los altos niveles de SnoN en células pueden activar la vía de PML-p53 supresor de tumor para inhibir el crecimiento del tumor. Por último, SnoN también puede inhibir la metástasis tumoral ya la reducción de la expresión SnoN mejora la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células de cáncer de pulmón y de mama
in vitro Opiniones y metástasis tumoral
in vivo
[7].
Dadas las complejas funciones de SnoN en la tumorigénesis, es importante para determinar su patrón de expresión en tejidos humanos normales y supervisar cómo cambia durante la progresión maligna. SnoN se expresa de forma ubicua en todos los tejidos embrionarios y adultos. Su expresión está regulada positivamente durante etapas específicas de la embriogénesis y morfogénesis de órganos [11]. En las células no transformadas y tejidos normales, SnoN puede detectarse tanto en citoplasma y el núcleo, mientras que en líneas celulares de cáncer, SnoN es en gran parte nuclear [8], [12], [13]. Además, la expresión SnoN puede ser regulada a nivel de la amplificación del gen, la activación de la transcripción y la estabilidad de proteínas. El humano
SnoN
gen se localiza en el cromosoma 3q26.2, una locus amplificado con frecuencia en muchos tipos de cáncer, incluyendo el de esófago, ovario y muchos otros [5]. De acuerdo con esto, la expresión SnoN está regulada positivamente en muchas líneas celulares de cáncer [6]. Sin embargo, si la expresión SnoN también se incrementa en los tejidos de cáncer humano sigue siendo controvertido. Un número de estudios han examinado esta cuestión [13] - [18], pero sin un patrón consistente ha surgido. Mientras que algunos estudios informaron un aumento en SnoN ARN y los niveles de proteína en algunos tejidos de cáncer y que esta expresión SnoN mayor correlacionado con una pobre diferenciación, invasión más profunda y pobre supervivencia de los pacientes [13], [14], [16], otros detectan una disminución de SnoN expresión en los cánceres similares, particularmente en displásicas y cánceres altamente invasivos [15], [17], [18]. La posible relación entre la localización de SnoN y el estado maligno de cáncer también varía de un estudio a otro. Estos datos contradictorios sugieren una relación más compleja entre la expresión SnoN y la transformación maligna y justificar la necesidad de un examen más amplio de la expresión SnoN en tejidos normales y cancerosas de diferentes etapas malignos.
En este informe, hemos examinado la expresión en SnoN cuatro tipos de tejidos humanos normales y tejidos de cáncer de coincidencia de diferentes etapas clínicas de malignidad para evaluar si las alteraciones de la expresión SnoN correlacionan con la malignidad y /o el estado de inactivación de p53 tumor. Estos cuatro tipos, de esófago, de ovario, de mama y tejidos pancreáticos, se eligieron porque SnoN se ha implicado en el desarrollo de estos tipos de cáncer y /o en las funciones normales de estos tejidos. Esófago y ovario cánceres a menudo implican la amplificación del amplicón 3q26, y el número de copias del
SnoN
de genes, así como los niveles de transcripción SnoN se ha encontrado que aumentan en estos tipos de cáncer [14], [16], [19 ], [20]. Sin embargo no se ha definido el patrón de expresión de proteínas en células de ovario SnoN normal y en el adenocarcinoma de ovario. El cáncer de páncreas está estrechamente asociada con la vía /Smad TGF-β, y Smad4 se inactiva en casi 60% de cáncer de páncreas [21]. Como un regulador negativo de Smad4, SnoN también puede jugar un papel en el desarrollo de cáncer de páncreas. Finalmente, nuestros estudios recientes utilizando varios modelos de ratón han demostrado que la expresión SnoN se regula dinámicamente durante el desarrollo de la glándula mamaria [8] y está implicado en la progresión maligna del cáncer de mama [7], [8], [12]. Mediante el examen de la ubicación y los niveles de expresión SnoN en estos tejidos, esperamos obtener una mejor comprensión de las funciones que desempeñan SnoN durante la tumorigénesis, tanto en el entorno de epitelio y estroma y cómo esto puede correlacionar con la inactivación de p53.
materiales y Métodos
arrays de tejidos normales y cancerosas
Todos los arreglos fueron adquiridos de Biomax (Cybrdi Inc). Estas matrices vienen con información sobre los estadios clínicos, los grados de patología y TNM. La matriz de esófago contiene pares de muestras de biopsia tumoral y normal de las muestras coincidentes de 39 pacientes con diagnóstico histológico de adenocarcinoma y clínicamente clasificado:. 8 pacientes con grado I, 19 pacientes con grado II, y 11 pacientes con tumores de grado III
La matriz de tumor de ovario contiene muestras de biopsias tumorales y 10 muestras normales de la misma a partir de 69 mujeres de 50 +/- 10. Los tumores fueron clasificados como los adenocarcinomas de ovario:. 3 pacientes con carcinoma de ovario clara, 12 pacientes con grado I, 29 pacientes con grado II, y 25 pacientes con adenocarcinomas de grado III (todas con metástasis en los ganglios linfáticos, pero no la metástasis distante) guía
La matriz de tumor pancreático contiene muestras de 90 pacientes y cinco muestras de tejido pancreático normal. Los tipos de tumores en esta gama incluyen adenocarcinoma ductal, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma neuroendocrino, carcinoma adenoescamosa, carcinoides y carcinoma sólido pseudo-papilar. Se han clasificado en diferentes clases clínicos sobre la base de la evaluación histológica: 21 pacientes con grado I, 59 pacientes con grado II, 8 pacientes con grado III (muchos de ellos con metástasis en los ganglios linfáticos), y 2 pacientes con tumor de grado IV con metástasis a distancia
La matriz de cáncer de mama contiene muestras de biopsia del tumor duplicadas de 31 pacientes, con seis muestras normales de seis pacientes a juego, y 9 metastásico muestras de 9 pacientes a juego. Estos tumores se clasificaron clínicamente por análisis histológico para ser carcinoma ductal infiltrante: 9 pacientes con AI grado, 4 pacientes con grado II B, 10 pacientes con grado III A, 5 pacientes con grado IIIC, 9 pacientes que coincidan con metástasis de los ganglios linfáticos, y 1 paciente con adenocarcinoma metastásico de ovario. Debido a que no se detectaron diferencias en la expresión SnoN entre el grado IIA y IIB o IIIA entre el grado y los tumores IIIC, agrupamos estas muestras juntos como tumores de grado II o grado III. Además, 24 pares de carcinoma ductal de mama in situ (DCIS) Ejemplos a juego con los tejidos normales se obtuvieron de centro de cáncer UCSF
.
El espesor de todas las matrices es 5 m. La matriz de cáncer de mama contiene muestras duplicadas de cada paciente y de esófago, ovario y páncreas matrices tienen una sección de cada paciente.
La inmunohistoquímica
Para SnoN immuostaining.
incluido en parafina arrays se desparafinaron en xilenos luego rehidratadas en una serie de gradiente de etanol. Las secciones se sumergieron en 0,85% de NaCl durante 5 minutos, a continuación, en PBS durante 5 minutos, y se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA). La permeabilización de las diapositivas se llevó a cabo con 20 mg /ml de proteinasa K durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT), seguido de lavado en PBS durante 5 minutos. Las muestras fueron fijadas por segunda vez con PFA al 4%, y se bloquearon durante la noche en 1% de BSA /suero de ternera recién nacida al 10% /0,02% de Triton X-100 en PBS en una cámara húmeda a 4 ° C. La tinción se realizó con un anticuerpo anti-SnoN reconocer un péptido C-terminal de SnoN [12] a una concentración de 1 mg /ml durante 2 horas, junto con un control de la competencia de péptidos y un control negativo sin anticuerpo primario. Después se añadió a los portaobjetos durante 1 hora 3 lavados con tampón IF (suero de ternero recién nacido al 10% /0,02% de Triton X-100 en PBS) durante 15 minutos cada uno, anticuerpo secundario conjugado fluorescente (anticuerpo anti-conejo Alex488 1:400 dilución) a TA en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron una vez con tampón de IF durante 15 minutos y dos veces con PBS durante 10 minutos cada uno, seguido por la adición de una gota de Vectashield DAPI medio de montaje (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA).
La secciones de los mismos tipos de tejidos (normales y cancerosas) fueron manchadas en el mismo experimento en condiciones idénticas, y se tomaron bajo el microscopio confocal de imágenes en una sola sesión. Además, el mismo lote de anticuerpos y diluciones se utilizaron para todas las tinciones que se describen en este documento. En ningún caso, los anticuerpos fue re-utilizar en cualquiera de los experimentos.
Para la inmunohistoquímica de p53.
Secciones
embebidos en parafina fueron desparafinados-en xilenos, rehidratada en etanol, y se incubaron con 3% de H
2O
2 durante 10 minutos para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. A continuación, las secciones fueron calentados a 95 ° C durante 30 minutos en tampón de citrato sódico (pH 6) [22] y bloqueados usando el kit de tiramida Sistema de señal biotina amplificación (Perkin Elmer, Boston, MA) durante 30 minutos a TA. Las láminas fueron tratados durante 30 minutos con anti-p53 en 1:200 dilución (DO-7 clon; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Después de lavar 3 x 5 min en 0,05% Triton X en PBS, los portaobjetos se incubaron en anticuerpo secundario biotinilado durante 30 min a RT. Se llevaron a cabo todos los pasos posteriores por el protocolo del fabricante. Para la visualización, DAB se utilizó como sustrato de peroxidasa (SK-4105; Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Captura de Imagen y semi-cuantitativa de análisis de datos
Para cada muestra de tumor teñido con SnoN , al menos tres imágenes fueron capturados utilizando el microscopio confocal LSM 510 en el marco del objetivo de 20x para asegurarse de que las principales áreas para cada muestra se incluyen en la cuantificación. intensidad SnoN (el número de píxeles /área) de cada una de las tres zonas se calculó utilizando el software de imagen J, y el tamaño de la zona se mantuvo constante durante todo el proceso de cuantificación. Los números fueron en promedio para cada muestra de tumor. El control y la competencia de péptidos señales de fondo negativos se restan de todas las muestras durante la cuantificación. Las imágenes de p53 se toman con el microscopio de fluorescencia Zeiss AxioImager. intensidad de la señal nuclear p53 se cuantificó en un 0 (negativo) a 5 escala (muy intensa coloración).
Para el análisis del potencial asociación de TP53 mutación y amplificación SKIL, se realizó la minería de datos de la enciclopedia línea celular Novartis ( CLE) que contiene 947 líneas celulares de cáncer humano [23], en el que se copian los números y las mutaciones de SnoN (SKIL) y los genes p53 se han caracterizado utilizando microarrays de Affymetrix SNP6 o RNAseq. Se analizaron 914 líneas celulares mediante la separación de las líneas de células basado en la frecuencia de amplificación SnoN y examinar la frecuencia de mutación de TP53 dentro de cada grupo.
El análisis estadístico se realizó a través de la función de la prueba t del estudiante en Bioconductor paquete de R como pruebas t suponiendo varianzas desiguales de 2 colas. coeficiente de correlación de Pearson se calculó utilizando el paquete R, y la significación del coeficiente de correlación observada se determina usando una muestra de t-test contra la población de coeficientes de correlación en-entre p53 y todos los genes Entrez en el genoma humano. posible correlación entre la expresión SnoN e inactivación de p53 en el cáncer de los tejidos se evaluó mediante la prueba de Kruskal-Wallis.
Resultados
SnoN se expresa en tejidos normales de mamíferos
Para determinar la normalidad patrón de SnoN en diversos tejidos humanos y establecer una línea de base para un nuevo análisis de los tejidos de cáncer, lo primero que examinó la expresión SnoN en 39 muestras normales del esófago de tejidos, 10 muestras normales de mama, 6 ovárica normal y 5 muestras de páncreas normales por inmunohistoquímica con anticuerpos anti-SnoN. Este anticuerpo purificado por afinidad se elevó contra un péptido C-terminal de SnoN humana y se ha caracterizado anteriormente para los estudios de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica [8], [12]
La mucosa del esófago contiene tres capas:. El no queratinizado epitelio escamoso estratificado, la lámina propia que consiste en tejido conectivo laxo, y la mucosa muscular que consiste en el músculo liso. En el epitelio escamoso estratificado de esófago, SnoN se expresó en niveles de moderados a altos en el citoplasma, con una tinción más fuerte en la parte superior de la superficie del epitelio aplanado que en la capa inferior de células cúbicas (Figura 1A). En la lámina propia, SnoN era predominantemente localizada en el citoplasma de las células en el tejido conectivo, pero también puede ser detectado en el núcleo de algunos fibroblastos. Los vasos sanguíneos se expresa SnoN en un nivel alto, y el músculo esquelético de la muscularis mucosa tuvo la mayor tinción SnoN (Figura 1A). Por lo tanto, SnoN se expresa tanto en las células epiteliales y el compartimiento del estroma, y dado sus altos niveles de expresión en los músculos, vasos sanguíneos y fibroblastos, puede desempeñar un papel importante en la regulación del microambiente del estroma.
SnoN expresión en el esófago normal, incluyendo las células diferenciadas suprabasal escamosas epiteliales, la lámina propia (estroma y tejido conectivo), y la mucosa muscular (músculo liso). E: Las células epiteliales; F: fibroblastos; B.V; vaso sanguíneo. Control negativo: los tejidos se tiñeron con anticuerpo secundario conjugado solo y sin anticuerpo primario. péptido control: tejido teñido con el control de la competencia péptido SnoN. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, la expresión Representante SnoN en el tejido ovárico normal. E: células epiteliales del folículo; S: estroma. El panel de la izquierda es la tinción DAPI solo (azul), el panel central es SnoN mancha sola (verde), y el panel de la derecha es SnoN (verde), además de manchas (azul) DAPI. Lo mismo es cierto para los paneles en la figura C-D. C, expresión Representante SnoN en el páncreas normal. E: Las células epiteliales acinares; S: las células del estroma de las paredes de tejido conjuntivo lobular. D, la expresión Representante SnoN en la mama normal. E: Las células epiteliales de los conductos y lobuli; S:. Estroma
En el tejido ovárico normal, SnoN era predominantemente citoplasmática y se expresa en niveles moderados en las células epiteliales de los folículos primordiales y primarios y células del estroma (Figura 1B). En el páncreas normal, SnoN estaba presente en el citoplasma de las células epiteliales de los acinos y conductos intralobulillares en niveles moderados, y en el tabiques de tejido conectivo lobular en un nivel inferior (Figura 1C). Finalmente, en tejidos normales de mama, SnoN se expresó en el citoplasma de las células epiteliales de los conductos lobuli y terminales (Figura 1D), similar a lo que se ha reportado antes [8], [12]. También se detectó en el estroma a un nivel inferior. Por lo tanto, SnoN está presente en todas las capas epiteliales y del estroma de estos cuatro tipos de tejidos normales a diferentes niveles. En las células epiteliales de todo tipo de tejidos, SnoN se localiza predominantemente en el citoplasma. Esto es consistente con nuestros hallazgos anteriores [8], [12].
Expresión SnoN es reducida en grado inferior del esófago Adenocarcinoma pero comparable a la de WT tejidos del tumor de alto grado Stroma
a continuación examinó los niveles de expresión y patrones SnoN en 39 muestras de tejido de esófago adencarcinoma por tinción de inmunofluorescencia seguido de formación de imágenes confocal en tanto 20X y 40X de aumento y los comparó con la de las muestras normales a juego. Estas muestras de adenocarcinoma de esófago se han clasificado clínicamente de grado I a III. Notablemente, la estructura del tejido de varias capas se ve en tejido esofágico normal se ha perdido por completo en estas muestras de adenocarcinoma, y las células del estroma del tumor están intercaladas con epitelio tumor. Nuestro análisis semi-cuantitativo mostró que en comparación con el epitelio escamoso normal, la expresión SnoN se redujo significativamente en el grado I (p = 0,00016) y en menor medida, los tumores de grado II (p = 0,142) (Figura 2A y 2B). Curiosamente, como tumores progresaron a una etapa más maligna (grado III), la expresión SnoN recuperó gradualmente a un nivel comparable o superior a la de los controles normales (dos muestras representativas, una similar a la normal y una más alta se muestran en la Figura 2A). SnoN expresión en las células del estroma y tejido conectivo en el grado I y II tumores también se redujo significativamente de la de los tejidos normales. estroma del tumor de grado III, sin embargo, mostró una regulación positiva significativa de la expresión SnoN de lo que los tumores de grado (p = 0,0068), alcanzando un nivel similar y en el 55% de las muestras, más alta que en los tejidos normales (último panel, Figura 2A) , especialmente en la infiltración de fibroblastos y células inflamatorias (linfocitos, leucocitos y fagocitos) (Figura 2A y 2C). Sin embargo, debido a las grandes variaciones entre las muestras individuales de grado III, el cambio medio en los niveles SnoN estroma más que en los tejidos WT no fue estadísticamente significativa. Notablemente, SnoN permaneció en gran parte citoplasmática en estas muestras tumorales. Nuestros datos sugieren que la expresión SnoN está regulado por disminución en los pacientes con adenocarcinoma esofágico bajo grado, pero su expresión se restableció en tumores de alto grado, en particular en el estroma (para los números detallados, véase la Tabla 1). Esto sugiere que la expresión SnoN puede variar en diferentes etapas de malignidad y que SnoN puede desempeñar diversas funciones en las diferentes etapas de la tumorigénesis.
A, Representante SnoN tinción de cáncer de esófago de varios grados a 20X (arriba) o 40X ( inferior) aumentos. Se muestran dos de grado III muestras que representan diferentes niveles de expresión SnoN. E: epitelio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, SnoN tinción en las células epiteliales normales y tumorales se cuantificó usando el software Image J y los números se dibujan en el diagrama de caja, que incluye muestras normales (n = 36, la intensidad media = 1,13) y muestras de tumores de esófago de grado I (n = 8, media = 0,07), II (n = 19, media = 0,71) y III (n = 11, media = 1,26). El análisis estadístico comparando los controles normales para cada grado tumoral mostró que los niveles epitelial SnoN en adenocarcinoma de esófago son significativamente más débil (grado I: p = 0,0002) o similar (grado II: p = 0,1425 y grado III: p = 0,3349) a la de el control de las muestras normales. El aumento de la expresión SnoN epitelial en grado III en comparación con grado I fue estadísticamente significativa (p = 0,0013). C, La cuantificación de SnoN tinción estromal en muestras normales (n = 27, media = 1,69) y de tumores de esófago muestras de grado I (n = 5, media = 0,23), II (n = 19, media = 1,09), y III ( n = 11, media = 1,78). El análisis estadístico comparando los controles normales para cada grado del tumor de esófago es el siguiente: p = 0,0023 para el grado I, p = 0,8565 para II, y p = 0,1132 para el grado III. El aumento de la expresión del estroma SnoN en el grado II (p = 0,0287) y de grado III (p = 0,0068) en comparación con los tumores de grado I estroma tumoral fue estadísticamente significativa.
SnoN expresión se reduce en las adenocarcinoma de grado más bajo de ovario tejidos, pero elevada en tumor de alto grado Stroma
al igual que lo que se ha observado en el cáncer de esófago, la expresión SnoN se downregulated en el grado I y en un menor grado, adenocarcinoma de ovario II muestras grado en ambas epitelio tumoral y el estroma (Figura 3 y Tabla 1), pero se recuperaron de nuevo en los tumores de grado III. Grado III muestras de adenocarcinoma de ovario mostraron heterogeneidad en la expresión SnoN, con 60% de las muestras que exhiben un mayor tinción SnoN (panel último, la Figura 3A) que los tejidos normales y otros que muestran una tinción más débil SnoN (panel#4, Figura 3A). Como resultado de esta heterogeneidad, el análisis estadístico mostró que no había diferencia global en la expresión SnoN entre el tejido ovárico normal y muestras de tumor de grado III. Sin embargo, en comparación con las muestras de tumor de grado inferior, el compartimiento del estroma de las muestras de tumor de grado III mostró una tinción SnoN mucho más fuerte (Figura 3A y 3C). Estas células estromales fueron identificados por los patólogos como la infiltración de fibroblastos y células inflamatorias. Una vez más, SnoN permaneció en gran parte citoplasmática en estas muestras tumorales. Por lo tanto, similar a la que se ha observado con el cáncer de esófago, la expresión SnoN en cáncer de ovario también pareció ser menor en las primeras etapas de la progresión maligna.
A, expresión Representante SnoN en el tejido ovárico normal y en adenocarcinoma de ovario de diversos grados tumorales a 20x (arriba) o 40x (abajo). Se muestran dos de grado III muestras que representan diferentes niveles de expresión SnoN. E: epitelio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, tinción SnoN en las células epiteliales tumorales normales y de ovario se cuantificó usando el software Image J y los números se dibujan en el diagrama de caja, que incluye muestras normales (n = 10, media = 1,28) y las muestras de tumor de ovario de grado I (n = 11, media = 0,55), fase II (n = 29, media = 1,05), y la etapa III (n = 25, media = 2,04). El análisis estadístico comparando los controles normales para cada grado tumoral mostró que los niveles epitelial SnoN en adenocarcinoma de ovario son iguales o más débiles que las muestras de tejido de control: p = 0,6139 para el grado I, p = 0,7984 para II, y p = 0,1461 para III. No se observó ninguna diferencia significativa entre las muestras de tumor de ovario. C, tinción SnoN en las células del estroma en muestras normales (n = 10, media = 1,38) y de tumores de ovario muestras de grado I (n = 7, media = 0,61), II (n = 23, media = 0,81), y III ( n = 20, media = 2,00). El análisis estadístico comparando los controles normales a cada grado del tumor de ovario es la siguiente: p = 0,5997 para el grado I, p = 0,3633 para el grado II, y p = 0,1833 para el grado III. El aumento de la expresión del estroma SnoN en grado III en comparación con el grado II (p = 0,0258) fue estadísticamente significativa.
Expresión SnoN disminuye en muestras de adenocarcinoma pancreático
La matriz de tejido de cáncer de páncreas contiene múltiples tipos de adenocarcinoma de los tres grados clínicos (I-III), incluyendo adenocalarcinoma ductal, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma neuroendocrino, carcinoma adenoescamoso, carcinoide, carcinoma sólido y pseudo-papilar. En todas las muestras de cáncer de páncreas en los tres grados de tumor, SnoN era citoplásmica y se expresa a un nivel más bajo que en las muestras normales de la misma edad (Figura 4A-4B y la Tabla 1). En todos los grados tumorales, expresión SnoN fue la más alta en la fase III de adenocarcinoma de páncreas (Figura 4B). Sin embargo, este aumento no fue por encima de los controles de tejido normal. El compartimiento del estroma del tumor no tenía una tinción SnoN más alto que el estroma normal (Figura 4A y 4C). Así, en ninguno de los tejidos tumorales era SnoN expresa a un nivel más alto que en los tejidos normales, consistentes con un papel supresor de tumor de SnoN en el cáncer de páncreas.
A, expresión Representante SnoN en el páncreas normal y en páncreas adenocarcinoma de diferentes grados a 20X (arriba) o 40x (abajo). E: epitelio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, tinción SnoN en las células epiteliales tumorales normales y pancreáticas se cuantificó utilizando la imagen J, y los números se dibujan en el diagrama de caja, que incluye muestras normales (n = 5, media = 3,08) y las muestras tumorales pancreáticas de grado I (n = 21, media = 1,89), de grado II (n = 59, media = 1,59), y de grado III (n = 8, media = 2,09). SnoN expresión en muestras de tumores fue más débil que en las muestras pancreáticas normales (p = 0,0855 para el grado I, p = 0,0125 para la Segunda, y p = 0,0518 para la III). No se observó ninguna diferencia significativa en SnoN tinción epitelial entre las muestras de tumores de páncreas. C, tinción SnoN en normal (n = 2, media = 1,87) y las muestras del estroma del tumor de grado I (n = 20, media = 2,10), II (n = 55, media = 1,70) y III (n = 8, media = 1,57). No hay ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las muestras tumorales y el estroma normal.
Expresión SnoN se reduce significativamente en el seno ductal adenocarcinoma
La matriz de tejido de cáncer de mama contiene muestras de biopsias de pacientes con la duplicación de la infiltración ductal carcinoma de mama de etapas II y III y el carcinoma metastásico a los ganglios linfáticos. Para nuestra sorpresa, los niveles de SnoN no estaban elevados en ninguna de las muestras tumorales (Figura 5A-5B y Tabla 1). Por el contrario, los niveles de SnoN fueron significativamente menores que las muestras de control y no se observa correlación entre sus niveles de expresión y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos (Figura 5B). SnoN se expresa en altos niveles en muy pocas muestras y fue predominantemente citoplasmática. Para la mayoría de las muestras tumorales, la expresión SnoN en el estroma fue notablemente menor que en las muestras de control normales (Figura 5A y 5C) guía.
A, expresión Representante SnoN en las muestras normales y ductales de mama adenocarcinoma en 20X (arriba) o 40x (abajo). E: epitelio; S: estroma. Verde: SnoN; azul, DAPI. B, tinción SnoN en normal (n = 6, media = 1,59) y las células epiteliales de tumor de mama de grado II (n = 9 para IIA y n = 3 para IIB, media = 0), de grado III (n = 10 para IIIA y n = 5 para IIIC, media = 0), y metastásico muestras (n = 10, media = 0). La disminución de la expresión SnoN en muestras tumorales en comparación con tejidos normales tiene un valor p de 0,0966 para el grado II, 0,0430 para el grado III, y 0,0321 para las muestras metastásicos. C, tinción SnoN en las células del estroma de la normal (n = 6, media = 1,35) y las muestras de tumor de mama de grado II (n = 9 para IIA y n = 3 para IIB, media = 0), de grado III (n = 10 para IIIA y n = 5 para IIIC, media = 0,38), y metastásico muestras (n = 10, media = 0). Los valores de p para cada comparación tumor /normal, fue de 0,3340 para el grado II, 0.1647 para el grado III, y 0,0695 para las muestras metastásicas. D, la expresión Representante SnoN de una sección de mama normal y DCIS sección tomada del mismo paciente. Verde: SnoN; azul, DAPI.
Para probar la posibilidad de que SnoN puede estar elevada durante las primeras etapas de la tumorigénesis, pero redujo en etapa tardía de la progresión maligna, se recogieron y se tiñeron 24 muestras DCIS humanos y sus tejidos normales a juego para SnoN expresión. Curiosamente, aunque en cualquier célula individual en los tejidos DCIS, el nivel de expresión SnoN fue similar o, en algunos casos, menor que en células en los tejidos normales, debido a un marcado incremento en el contenido epitelial en las muestras de DCIS, el nivel general SnoN en todo el tejido era mucho más alta que en los tejidos normales (Figura 5D). Por lo tanto, el aumento global en el nivel de SnoN en muestras DCIS refleja el contenido epiteliales significativamente elevados en estos tejidos, pero no la regulación positiva de la expresión SnoN en las células individuales.
En su conjunto, a diferencia propuesto anteriormente, la expresión SnoN se reduce en menor tumores malignos de grado de esófago, mama, páncreas y ovario (Tabla 1). En esofágico y cáncer de ovario, y en menor grado en el cáncer de páncreas, la expresión SnoN recuperó gradualmente en los tumores de grado III.