Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) son capaces de proliferación continua y auto-renovación y se proponen para desempeñar papeles importantes en la oncogénesis , crecimiento tumoral, metástasis y la recurrencia del cáncer. se consideran células madre cancerosas derivadas de células madre normales afectados por el microambiente tumoral aunque el mecanismo de desarrollo no está claro todavía. En 2007, el grupo de Yamanaka tuvo éxito en la generación de
Nanog
células madre pluripotentes inducidas células de ratón (MIPS), en la que la proteína fluorescente verde (GFP) ha sido insertado en la región 5 'no traducida del
Nanog
gen. Por lo general, las células iPS al igual que las células madre embrionarias, se consideran, para ser inducida en células progenitoras, que se diferencian en diversos fenotipos normales dependiendo del nicho normal. La hipótesis de que los CAC se podría derivar de
Nanog
MIPS células en el medio de cultivo condicionado de las líneas celulares de cáncer, que es un imitador del microambiente carcinoma. Como resultado, las células Nanog MIPS tratados con el medio de carcinoma de pulmón de ratón Lewis acondicionado adquirido características de células madre cancerosas, en que se formaron esferoides que expresan GFP en cultivo en suspensión, y tenía una alta tumorigenicidad en ratones BALB /c desnudos que presentan la angiogénesis in vivo. Además, células madre cancerosas derivadas de iPS estos tenían una capacidad de auto-renovación y expresan los genes marcadores,
Nanog
,
Rex1
,
Eras
,
Esg1
y
Cripto
, asociado con propiedades de células madre y un estado indiferenciado. De esta manera llegamos a la conclusión de que un modelo de células madre cancerosas se desarrolló originalmente a partir de células MIPS y propuso el medio de cultivo condicionado de las líneas celulares de cáncer podría funcionar como nicho para la producción de células madre cancerosas. El modelo de células madre cancerosas y el procedimiento de su establecimiento ayudarán a estudiar las alteraciones genéticas y los factores secretados en el microambiente tumoral que convierten las células MIPS de células madre cancerosas. Por otra parte, la identificación de marcadores de buena fe de los CAC, potencialmente, lo que ayudará al desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer, podría ser posible que el modelo CSC
Visto:. Chen L, T Kasai, Li Y, Sugii Y, Jin G, Okada M, et al. (2012) Un modelo de cáncer de células madre derivadas de células madre pluripotentes inducidas ratón. PLoS ONE 7 (4): e33544. doi: 10.1371 /journal.pone.0033544
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de septiembre de 2011; Aceptado: 10 Febrero 2012; Publicado: 12 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (B) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (Nº 21300179, http://www.waseda.jp/rps/en/manual/kakenhi_honbun.html), y por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Tecla de programa, la subvención No. 30930038, http://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una serie de estudios han tratado de identificar los mecanismos de crecimiento tumoral maligna subyacente y progresión. A pesar de avances significativos, la mayoría de los enfoques terapéuticos no consiguen eliminar todas las células tumorales. Las células tumorales restantes a menudo resultan en la recidiva y metástasis. Recientemente, se propuso la hipótesis de las células madre de cáncer (CSC) para explicar el origen de las células cancerosas. Por definición, los CSC son una pequeña fracción de las células tumorales con la capacidad tanto de auto-renovación y proliferación ilimitada lenta. A menudo son resistentes a la quimioterapia y la radiación y por lo tanto son responsables de suministrar continuamente nuevas células del cáncer [1]. Una visión actual del modelo de los CAC se considera que las células madre adultas, células progenitoras o células diferenciadas pueden adquirir las múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas necesarios para convertirse en células madre cancerosas que están involucrados en la promoción y mantenimiento de la oncogénesis. Esta célula de cáncer de iniciación puede compartir algunas características con las células madre adultas que residen en el órgano, en el que se producen, ya sea porque los órganos y tejidos se originan a partir de células madre residentes o porque las células madre son agrupados por las propiedades de su nicho [2]. En este contexto, las células tumorales se pueden revertir epigenetically a las células madre específicas de tejido cuando se trasplantan en un nicho de células madre normal [3] - [6]
Es bien sabido que el microentorno puede ejercer profunda genética o epigenética. efectos sobre las células madre a través de interacciones entre las células, o a través de factores derivados de células procedentes de las células circundantes dentro del nicho. Estos efectos pueden ser transitorios, como se ve en la activación de vías de señalización regulación de la proliferación celular y la migración, o pueden estar asociados con alteraciones más estables, tales como la determinación del destino celular y la diferenciación [7]. Dado el papel crítico del microambiente en la regulación celular, varios estudios han demostrado recientemente que el microambiente de células madre embrionarias podría tener una influencia significativa en las características fenotípicas de las células cancerosas agresivas [8] - [10]. Sin embargo, en cuanto a si el microambiente tumorigénico puede afectar el destino de las células madre no ha sido suficientemente explorado.
En 2007, el grupo de Yamanaka [11] tuvo éxito en la generación de
Nanog
MIPS células mediante transducción retroviral de cuatro factores de transcripción (
octamer 3/4
(
octubre
3/4),
SRY caja que contiene el gen 2 gratis (
Sox2
),
Kruppel como factor de 4 gratis (
Klf4
) y
C-myc
) en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). GFP se expresó de forma estable en estas células, pero la expresión de GFP se extingue cuando se indujeron estas células a diferenciarse. Hasta la fecha, las células se han diferenciado MIPS con éxito en diversos tipos de células, incluyendo células hematopoyéticas y endoteliales [12], las células neuronales [13], las células cardíacas [14] y las células beta pancreáticas [15]. A pesar de estos informes exitosos de diferenciación in vitro, las células iPS no son del todo adecuadas para el trasplante en pacientes. El principal problema es que los problemas de seguridad en las células iPS tienden a formar teratomas y tienen un riesgo de transformación maligna [16] - [18]. Basado en la teoría de los CAC, hemos comprobado si los CAC se pueden derivar de células MIPS después de la exposición a un microambiente del tumor (Fig. 1).
células MIPS deben ser inducidas a algunos tipos de células progenitoras, tales como células hematopoyéticas y las células madre neurales, diferenciarse en diversos fenotipos, tales como macrófagos, monocitos, células neuronales, células cardíacas y células ß-pancreáticas, cuando se exponen al nicho normal. La hipótesis de que los CAC también puede derivar de células MIPS sólo cuando la exposición a un nicho maligno.
Resultados
Las células cultivadas MIPS en los medios de líneas celulares de cáncer mostró acondicionado y tumorigenicidad angiogénesis
in vivo
en este estudio, hemos diseñado dos procedimientos para tratar las células MIPS. células MIPS se cultivaron sin células alimentadoras en una mezcla de medio de MIPS y medio condicionado obtenido de las siguientes líneas celulares de cáncer de ratón: carcinoma pulmonar de Lewis (LLC), carcinoma embrionario de ratón (P19), melanoma de ratón (B16) y el carcinoma de mama de ratón (MC .E12) durante 4 semanas. MIPS células cultivadas bajo estas condiciones se denominan MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16 cm, y las células MIPS-MC.E12 cm respectivamente. MIPS células también fueron cocultured con cada línea celular de cáncer que habían sido previamente tratados con mitomicina C como células alimentadoras durante 4 semanas. Estas células se denominaron MIPS MIPS-LLCC, MIPS-P19c, MIPS-B16c y células MIPS-MC.E12c respectivamente. Las células MIPS que habían sido cultivadas con o sin células alimentadoras en las distintas condiciones fueron luego trasplantadas en ratones desnudos. Después de 4 semanas, las células formaron teratomas MIPS típicos que contenían tejidos diferenciados y sin metástasis (Fig. S1 A). Por el contrario, los aloinjertos de ratón de células MIPS que habían sido tratados con células medios acondicionados, MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-B16-MIPS MC.E12 cm cm, carcinomas indiferenciados formados que poseían las células con alta relación núcleoicitoplasma , pleomorfismo nuclear, aberrantemente altos índices mitóticos, y múltiples figuras mitóticas patológicos (Fig. 2A y S1B). Por otro lado, las células sólo MIPS-MC.E12c en el grupo de cocultivo formaron tumores malignos (Fig. S1B). La tumorigenicidad de las diferentes células se resume en la Tabla 1. Es de destacar que sólo los tumores que se derivan de células MIPS-LLCcm mostraron características de la angiogénesis y micrometástasis (Fig. 2A).
(A) Histología de MIPS células -LLCcm derivan tumor. El fenotipo maligno exhibido tumor con hiperplasia epitelial glandular (asterisco), alta relación entre núcleo al citoplasma, atipia nuclear grave y múltiples figuras de mitosis patológicos (puntas de flecha, recuadro) (arriba a la izquierda); micrometástasis (flecha, arriba a la derecha); y hipervascularización indicativo de la angiogénesis (parte inferior izquierda) mediante tinción con HE. El positivo de CD31 (anticuerpo monoclonal de rata, marrón) mediante tinción inmunohistoquímica mostró múltiples vasos vasculares en el tumor (abajo a la derecha). Las barras de escala: 100 micras (parte superior izquierda e inferior), 50 mm (superior derecha). (B) Cultivo primario derivado del tumor MIPS-LLCcm. El cultivo primario exhibió células madre similares (asterisco en la parte superior izquierda) que expresan GFP (arriba a la derecha) y células similares a fibroblastos (flecha en la parte superior izquierda) sin expresión de GFP (arriba a la derecha). Las células cultivadas a partir de esferoides el cultivo primario en suspensión (parte central izquierda) con la expresión de GFP (centro derecha). Las células esferoides se colocaron de nuevo en cultivo adherente mantuvieron células madre similares (asterisco en la parte inferior izquierda) con la expresión de GFP (abajo a la derecha) y células similares a fibroblastos (flecha en la parte inferior izquierda) y sin expresión de GFP (abajo a la derecha). (C) La tinción de inmunofluorescencia para Nanog Octubre 3/4 en células esferoide. Cryosections de células esferoides se tiñeron con anticuerpos primarios (de conejo anti-ratón Nanog o anti-Oct-3/4), seguido de anti-conejo o anti-ratón anticuerpos secundarios marcados con Alexa fluoróforos 555 (rojo) o 488 (verde). Las células se contratiñeron con DAPI (azul). Barras de escala: 20 m. (D) Los niveles de expresión de p53, MMP-2 y MMP-9 se analizaron por cuantitativa en tiempo real PCR. MIPS + LIF /-MEF, MIPS células cultivadas con LIF en el medio pero sin células MEFfeeder; esferoide MIPS-LLCcm, las células derivadas de células esferoide forma MIPS-LLCcm; MIPS-LLCcm esferoide LMT, las células derivadas de esferoides MIPS-LLCcm células de pulmón metastásico del tumor; células de carcinoma de pulmón LLC, Lewis.
Las células MIPS-LLCcm tenían una capacidad de auto-renovación
treinta y un cincuenta por ciento de las células fueron positivas para GFP en los tumores derivado de las células MIPS-LLCcm mientras que menos del cinco por ciento fueron positivas en el teratoma diferenciado (Fig. S2). Desde GFP fue diseñado bajo
Nanog
promotor para expresar de forma estable sólo en las células que eran indiferenciado y quedarían silenciados en los tejidos diferenciados [11], la mayoría de las células MIPS fueron considerados para ser diferenciados en los teratomas. Por otra parte, los tejidos malignos implícita para contener las células madre no diferenciadas como. Los cultivos primarios de tumor deben ser un método eficaz para eliminar potencialmente las células diferenciadas con el fin de obtener más células madre similares a derivados de MIPS-LLCcm. Así, el tejido del tumor derivado de las células MIPS-LLCcm se sometió a cultivo primario, de la que se observaron dos tipos distintos de las poblaciones de células. Uno de ellos era células madre similares que expresaban GFP, mientras que la otra población era de células similares a fibroblastos que no pudieron expresar GFP (Fig. 2B). Dado que las células malignas con propiedades madre-como pueden ser propagadas in vitro como esferas no adherentes [19], [20], las células se transfirieron a placas de cultivo no adherentes para facilitar el crecimiento de esferoides. En la suspensión, se observó expresión de GFP (Fig. 2B) en estas esferas tumorales, mientras que las células similares a fibroblastos no podría sobrevivir sin adhesión a la parte inferior del plato y era GFP negativa. Los esferoides de tumores derivados de MIPS-LLCcm se tripsinizaron y se confirmaron en repetidas ocasiones por la capacidad de formar esferoides en condiciones no adherentes. Indivisual células disociadas de las esferas fueron capaces de formar nuevas esferas durante el paso en serie en cultivos de tejidos, lo que demuestra que las células podrían auto-renovación [21]. Las esferas tumorales se transfirieron a placas de cultivo adherentes (Fig. 2B) y se sometieron a tinción inmunofluorescente para Nanog y Oct 3/4 (Fig. 2C). La tinción positiva de Nanog Octubre 3/4, que son factores críticos para mantener el estado no diferenciado y la auto-renovación de células madre [11], [21], confirmó la expresión de los marcadores de células madre en estos esferoides. Un aspecto de cancerización de las células esferoide MIPS-LLCcm estaba dirigida a la expresión del gen p53 mediante RT-qPCR. Como resultado, se encontró que la expresión downregulated al nivel en células de cáncer LLC (Fig. 2D). Esta regulación a la baja puede indicar la malignidad de las células. Para evaluar la tumorigenicidad de las células tumorales dentro de las esferas, 1 × 10~4 × 10
6 de estas células se trasplantaron subcutáneamente en ratones desnudos (Tabla 2). Después de 4 semanas, los tumores formados y exhibieron extensa angiogénesis (Fig. 3A), que fue similar a los tumores MIPS-LLCcm derivados. Sin embargo, estos tumores aparecieron más agresivos debido a la alta tasa de crecimiento. Para examinar el potencial metastásico, 1 × 10
5 células esferoides se inyectaron en la vena de la cola del ratón. Un mes más tarde, se encontraron múltiples nódulos metastásicos que expresan GFP en pulmones muestran que se obtuvieron a partir de células de esferoides (Fig. 3B y 3C). Y el nivel de expresión de MMP-2 se encontró significativamente upregulated en las células esferoides derivados de MIPS-LLCcm células de pulmón tumor metastásico (MIPS-LLCcm LMT esferoide) (Fig. 2D), lo que implicaba que las células MIPS-LLCcm poseen el potencial metastásico causado por inducción de MMP-2 de expresión, y la población de células altamente metastásicas podría ser aisladas a partir de células MIPS-LLCcm través de paneo in vivo.
(a) Histología del tumor derivado de las células esferoide. El tumor mostró un poco de estructura glandular (asteriscos) con múltiples figuras patológicas mitóticas (puntas de flecha), inserción (izquierda), altas tasas mitóticas (puntas de flecha en el centro), y hipervascularización (derecha) mediante tinción con HE. Barras de escala: 100 m. (B) la metástasis de pulmón después de la inyección en la vena caudal de las células esferoide. Los pulmones fueron ocupadas por los nódulos tumorales metastásicas. (C) Las metástasis mostraron algún tipo de estructura glandular (asteriscos) con múltiples figuras de mitosis patológicos (puntas de flecha en la parte superior izquierda); hipervascularización (arriba a la derecha); invasión en el tejido del parénquima pulmonar (parte inferior izquierda) mediante tinción con HE. La expresión de GFP (anticuerpo policlonal de conejo, marrón) se encontró en estos nódulos metastásicos mediante tinción IHC (abajo a la derecha). T, tumor; L, el tejido pulmonar. Barras de escala: 100 m. (D) La inmunohistoquímica de la CK y la localización de GFP en los tumores derivados de MIPS, MIPS-LLCcm y células esferoide. Serial secciones fueron teñidas con CK (anticuerpo monoclonal de ratón, marrón) y GFP (anticuerpo policlonal de conejo, marrón), y el contraste con hematoxilina. región glandular fueron CK GFP positivo, pero negativo en los tumores. Las barras de escala: 100 micras.
El tumor derivado de las células MIPS-LLCcm se compone de los adenocarcinomas y células tumorales indiferenciadas abundantes
A continuación se investigó el tipo de tumor maligno por IHC. Pan-citoqueratina (CK, una células tumorales epiteliales marcador), vimentina (un marcador de tumor mesenquimal), α-actina (un marcador de tumor miogénica), CD31 (un marcador para la vasculogénesis), NF-M y GFAP (marcadores de neurogénica tumor) se utilizaron para teñir los tumores (datos no mostrados). CK se encontró que estaba fuertemente manchado en los tumores. La expresión de CK y GFP se evaluó a continuación en múltiples secciones en serie. regiones glandulares fueron CK positivo, pero estas células eran GFP negativa en los tumores (Fig. 3D). Treinta a cincuenta por ciento de las células tumorales fueron positivas para GFP en los tumores que habían sido derivadas de ambas células MIPS-LLCcm y células esferoidales primarias, mientras que no hay regiones fueron GFP positivo en el teratoma. Por lo tanto, estos tumores fueron juzgados los adenocarcinomas mezcladas con células tumorales indiferenciadas abundantes.
Las células derivadas expresan los marcadores de células madre embrionarias
marcadores de células madre embrionarias y los cuatro factores de transcripción que se transduced luego se comprobaron por PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR). células MIPS-LLCcm y células esferoide mostraron expresión de los marcadores de células madre embrionarias (Fig. 4A), pero los niveles de expresión eran algo diferentes entre estas células tumorales y las células originales MIPS (Fig. 4C). Específicamente, por RT-qPCR
Nanog
y
Rex1
fueron significativamente elevados en las células tumorales MIPS-LLCcm, en cultivos primarios derivados de estos tumores o en los cultivos de esferoides en comparación con las células MIPS crecido en ausencia o en presencia de células alimentadoras. En contraste, se encontró que la expresión de los cuatro factores de transcripción que ser disminuido en grado variable tanto en las células MIPS-LLCcm y células esferoide en comparación con las células MIPS que se propagan en células de alimentación (Fig. 4B y 4D).
análisis (A) RT-PCR de la expresión de gen marcador de células madre embrionarias. (B) Análisis de RT-PCR de los cuatro factores de transcripción MIPS. Los productos de PCR fueron las regiones codificantes (totales), transcripciones endógenos solamente (Endo.), Y transcripciones transgén solamente (TG). niveles (C) la expresión de gen marcador de células madre embrionarias fueron analizadas por cuantitativa en tiempo real PCR. (D) Los niveles de expresión de los cuatro factores de transcripción celular MIPS fueron analizados por cuantitativa en tiempo real PCR.
Discusión
Las células MIPS-LLCcm mostraron la formación de esferoides en cultivo en suspensión, una alto potencial tumorigénico en diluciones limitadas y un alto potencial metastásico, que eran consistentes con las características básicas de los CAC [19], [22], [23]. rápido crecimiento del tumor requiere de novo la angiogénesis en el que el nicho vascular proporciona señales promotoras del crecimiento. Los tumores derivados de células MIPS-LLCcm incluyendo las células esferoides también mostraron un alto grado de angiogénesis, que no se observó en los teratomas derivados de células MIPS. La estrecha asociación de células madre cancerosas y los vasos sanguíneos se ha documentado anteriormente en el sistema nervioso y estos nichos vasculares ayudar en el mantenimiento de células madre cancerosas [24]. IFN, una molécula reguladora negativo importante de la angiogénesis, se ha demostrado que disminuye la expresión de MMPs, inhibir la migración de células endoteliales, así como inducir el factor angiostático IP-10 a través de activación de la vía de señalización JAK-STAT [25]. evaluación de microarrays comparación de las células y las células MIPS MIPS-LLCcm mostró baja regulación de IFNγR en las células MIPS-LLCcm (Materiales y Métodos S1, el cuadro S1), que podrían ser responsables de la angiogénesis en células MIPS-LLCcm tumorales derivadas. De la expresión de MMP-2 en células MIPS-LLCcm LMT dan el potencial metastásico de células MIPS-LLCcm podría ser el resultado de la reducción de IFNγR, aunque se requiere un análisis más detallado. Tomando la regulación a la baja de la MMP-9 expresión génica en ambos MIPS-LLCcm y MIPS-LLCcm LMT células en consideración, MMP-2 parece responsable de la angiogénesis y la metástasis en este estudio.
Auto-renovación es citado con frecuencia como una característica de las células madre cancerosas. Sin embargo, hay limitaciones técnicas para evaluar estrictamente auto-renovación. Para las células madre de tejido normales, la prueba estándar de auto-renovación requiere el clonal en la demostración in vivo de auto-renovación y diferenciación multi-linaje en trasplantes primarios de células madre, seguido de la demostración de las mismas propiedades en trasplantes de serie de las mismas células. Auto-renovación en células de cáncer tumorigénicas generalmente ha sido evaluada por la demostración de transplantability serie de tumores policlonales y por la demostración de una heterogeneidad fenotípica similar en los xenoinjertos tumorales parentales y progenie [26]. La secuencia de experimentos utilizando células MIPS-LLCcm que se derivaron de tumores primarios y su subcultura repetida como esferoides demostró la capacidad de auto-renovación de las células MIPS-LLCcm obtención de tumores secundarios que presentan la misma histología y fenotipo que los tumores primarios [21] .
por otra parte,
Nanog
, un marcador ampliamente asociado con 'stemness' todavía se expresó en niveles más altos en las células MIPS-LLCcm y células esferoide en comparación con las células MIPS.
Nodal
y
¿Cuáles son los morfógenos Cripto1 embrionarias que son responsables de la maintaince de la pluripotencia /auto-renovación de las células madre embrionarias y que realizan un papel fundamental en el mantenimiento del estado indiferenciado de células [7]. En las células MIPS-LLCcm,
Nodal
y
Cripto1
niveles de expresión fueron significativamente mayores en comparación con las células MIPS, lo que confirmó el estado relativamente indiferenciado de las células MIPS-LLCcm. La disminución de la expresión de Nodal por 70% en las células esferoide probablemente demostró la diferenciación de las células esferoide de células madre pluripotentes a células madre unipotentes como células madre cancerosas. Una regulación a la baja significativa de los marcadores de células madre se observó en los teratomas que se derivaron de las células MIPS ya que estos tumores contienen poblaciones de diferentes tipos de células diferenciadas mezcladas. Por el contrario, en los tumores derivados de células MIPS-LLCcm y células esferoides, los niveles de expresión de estos marcadores también disminuyeron, pero seguían siendo mucho más alto que los de teratomas. Estos resultados, que eran consistentes con los de IHC, dan a entender que había una cierta cantidad de las células madre cancerosas en los tumores malignos, mientras que casi todas las células se diferenciaron en los teratomas.
Las células tumorales desarrolladas en este estudio MIPS a partir de células crecieron como esferoides en cultivo en suspensión, mostró un alto potencial tumorigénico y la angiogénesis y la metástasis in vivo. Además, la capacidad de auto-renovación y mantenimiento de un estado indiferenciado según la evaluación de la expresión de marcadores que se asocian con las células madre embrionarias sugieren que estas células MIPS-LLCcm primarias y las células esferoides que se derivan de células MIPS-LLCcm contienen una alta proporción de células madre cancerosas. Scaffidi y Mistreli han informado recientemente de la producción de células CSC-como de fibroblastos, que pueden ser rastreadas a las células madre somáticas [27]. Se transdujeron genes oncogénicos de antígenos hTERT, H-Ras V12 y SV40 T para producir células CSC-como por la reprogramación. Debe ser digno de mención que nuestro modelo CSC fue desarrollado sin necesidad de utilizar la transducción de genes. Este es el primer informe para demostrar el desarrollo de una población CSC a partir de células MIPS que se pueden lograr por factores que son secretadas por las células tumorales, aunque se desconoce la identidad de estos factores (s) soluble. Exógena introducida
C-myc Hoteles en las células MIPS puede contribuir a la transformación ya la reactivación de
C-myc realizado por un retrovirus se consideró que se asocia con la formación de tumores en el 20% de los ratones quiméricos [11]. Por otra parte, estas filtraciones expresión de los transgenes también puede inhibir la diferenciación celular completa MIPS y la maduración, lo que lleva a un mayor riesgo de formación de teratomas inmaduros [28]. Sin embargo, nuestros resultados mostraron que los transgenes que se utilizaron para generar células MIPS fueron casi completamente en silencio en las células MIPS-LLCcm y células esferoide en comparación con las células MIPS cultivados en células alimentadoras y que los dos oncogenes,
C-myc
y
Klf4
, se redujeron drásticamente en las células MIPS-LLCcm y células esferoide. Esto sugiere que los transgenes pueden no ser los principales factores responsables de la transformación de las células MIPS en este modelo actual. Además, debido a la formación de tumores no se observó en los casos de MIPS-P19c, -B16c, y de ningún sobreviviente de MIPS-LLCC, que eran todos en el "grupo de co-cultivo", debe haber poca posibilidad de la transferencia o contribución de virus tumorales de ratón en la tumorigenicidad de células MIPS cultivadas en el medio condicionado. Teniendo en cuenta la ausencia de tumorigenicidad en estas células en el grupo de co-cultivo, la condición no óptima de la cultura iPS debe ser difícil de explicar la conversión de células MIPS mientras que la posibilidad de transfección viral permanece aún en los casos de MIPS-MC.E12 cm y -MC.E12c [29]. Por otra parte, cuatro obras independientes informan sobre los análisis genómicos de iPS y revelan una presencia preocupante de mutaciones en estas células [30] - [33], que puede ser MIPS de referencia es más fácil de ser afectados por el factor (s) soluble existido en microambiente tumoral . Los exosomas son 40-100 nm vesículas de membrana bilipídica que son secretadas por la mayoría de los tipos de células. Se cree que mediar en la comunicación de célula a célula y facilitar los procesos biológicos como el crecimiento celular y transformación maligna [34], [35]. Sobre la base de los informes recientes de los exosomas tumorales [36], [37], vale la pena aclarar el papel significativo de los exosomas secretadas por las células LLC en la conversión de células MIPS de células madre cancerosas. Además, nuestra conclusión de downregluration de expresión del gen p53 en células MIPS-LLCcm indica que la red de p53 alterada es uno de los mecanismos de la conversión de las células MIPS de células madre cancerosas. Se ha informado de que las células tumorales pueden inhibir la inducción de p53 en fibroblastos adyacente [38]. Es pena notar que un mecanismo de esta supresión debe depender del factor secretado a partir de células tumorales, pero no en la interacción directa de célula a célula. Definición y caracterización de las alteraciones genéticas y los factores secretados en el microambiente tumoral, que convierten las células MIPS a un CSC serán eficaces para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer.
La expresión de marcadores de superficie celular específico tiene sido ampliamente utilizado para identificar células madre cancerosas. Algunos de estos marcadores de superficie son conocidos por ser comunes a diferentes población CSC. Sin embargo, estos marcadores todavía pueden estar asociados con las células madre normales [1]. Diferencialmente expresado marcadores de superficie que se distinguen las células madre normales de células madre cancerosas son en gran parte desconocido [19]. Es imperativo identificar marcadores que pueden distinguir entre células madre cancerosas y las células madre normales. Este modelo celular en este documento debería servir como una herramienta viable para identificar marcadores de buena fe de las células madre cancerosas potencialmente. Dichos marcadores podrían ser objetivos potenciales en el desarrollo de nuevas terapias contra las CSC sin afectar negativamente a las funciones normales de células madre.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células madre pluripotentes inducidas
Mouse (MIPS; nombre de la celda: IPS-MEF-Ng-20D-17; Lote No. 012) fueron adquiridos de Riken Cell Bank (Japón) y se mantuvieron en medio (DMEM que contenía FCS al 15%, NEAA 0,1 mM, 2 mM L- La glutamina, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 1,000 U /ml de LIF, 50 U /ml de penicilina y 50 U /ml de estreptomicina) en capas de alimentación de células de ratón tratado con mitomicina-C de fibroblastos embrionarios (MEF) (ReproCELL, Japón). cáncer de pulmón de ratón Lewis células (LLC) se adquirieron de ATCC (EE.UU.) y se mantuvieron en DMEM que contiene 10% de FCS; células de carcinoma embrionario de ratón (P19) se adquirieron de Riken Cell Bank (Japón) y se mantuvieron en aMEM que contiene 10% de FCS; las células de melanoma de ratón (B16 /BL6) (ATCC, EE.UU.) y células de tumor mamario de ratón (BALB-MC.E12) (Riken Cell Bank, Japón) se mantuvieron en MEM que contiene 10% de FCS.
Para preparar condicionado medio (CM) a partir de las diferentes líneas celulares de cáncer de ratón, el medio se recoge de los platos confluentes y se filtra usando 0,45 micras filtro (Millpore, Irlanda). A continuación, se añadieron 3 ml de CM en 3,5 cm noche a la mañana plato para confirmar que no había células cancerosas que sobreviven en CM. Para los experimentos de medio acondicionado, las células MIPS (sin células alimentadoras MEF) se mantuvieron en medio descrito anteriormente sin LIF. La mitad del medio se cambió cada día con CM durante 4 semanas. MIPS células sin tratamiento con CM se utilizaron como control. Para los experimentos de cocultivo, las líneas de células tumorales de ratón fueron tratados con 0,4 mg /ml de mitomicina C (Sigma, EE.UU.) y después se utilizaron como células alimentadoras y cocultivaron con células MIPS (sin células alimentadoras MEF) durante 4 semanas. se pasaron las células MIPS cada 3 días y la morfología celular fue fotografiado usando un microscopio Olympus IX81 equipado con un dispositivo de fluorescencia de luz (Olympus, Japón).
Para el cultivo primario de aloinjertos de ratón se cortaron en trozos pequeños (aproximadamente 1 mm
3) en HBSS. Después de lavar tres veces, los tejidos se transfirieron a un tubo de 15 ml con 0,25% de tripsina de 5-6 veces el volumen a 37 ° C durante 40 min. Cinco microlitros de DMEM que contiene 10% de FCS se añadió entonces para terminar la digestión. Después, la suspensión celular se colocó en un tubo nuevo y se centrifugó a 1000 rpm durante 10 min. El sedimento celular se resuspendió en 5 ml de HBSS, y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 min. A continuación, el sedimento de células se colocó en un volumen apropiado de medio de MIPS sin LIF y se sembraron las células en un plato a una densidad de 5 × 10
5 /ml. Las células se pasaron se observó cada 3 días y las células de morfología y fotografiado usando Olympus IX81 microscopio equipado con un dispositivo de fluorescencia de luz (Olympus, Japón).
Los cultivos en suspensión para generar esferoides se realizaron como se describe en Dontu et al [39 ]. Brevemente, las células individuales se sembraron en placas no revestidas (plato de cultivo bacteriano) a una densidad de 2 × 10
4 /ml en cultivo primario. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero MIPS sin LIF. células esferoides se recogieron por centrifugación suave (500 rpm) después de 7-10 días y se disociaron enzimáticamente (0,025% de tripsina /EDTA).
Los experimentos con animales
ratones Nude (Balb /c Slc
-nu /nu
, femenino, 6~8 semanas) fueron adquiridos de Charlesriver, Japón. Se revisó el plan de experimentación animal, aprobado por el comité de ética de la experimentación con animales de la Universidad de Okayama bajo el ID de Oku-2.008.211, Oku-2.009.144, 2.010.179 y Oku-Oku-2011-305
.
Para los estudios de trasplante, células (que se muestran en la Tabla 1 y 2) se suspendieron en 100 l DMEM que contiene 10% de FCS y se inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos. Después de 4 semanas, los tumores se extirparon y se fijaron en solución de tampón de formalina neutra al 10% (Wako, Japón).
Para los estudios de micrometástasis, 1 × 10
5 de las células esferoide MIPS-LLCcm se suspendieron en 100 l DMEM que contenía FCS al 10% y se inyecta en la vena de la cola de ratón desnudo (n = 6).
el análisis histológico e inmunohistoquímica (IHC)
Los tumores se fijaron durante 24 horas y luego procesados usando una cera de rutina -embedding procedimiento para el examen histológico. Tres secciones gruesas micrómetro se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE).
IHC para GFP, pan-citoqueratina, vimentina, α-actina, CD31, NF-M, GFAP se realizó utilizando embebidos en parafina de tejido fijado en formalina secciones y procedimientos estándar. Brevemente, 3 micras secciones de tejido se desparafinaron y el antígeno recuperados se ha realizado mediante la exposición de microondas a 95 ° C durante 5 minutos en un tampón de citrato (pH 6,0) o la incubación en proteinasa K (40 mg /ml) a 37 ° C durante 30 minutos.