adherencia
Extracto
-celular de la célula es de suma importancia en el suministro y el mantenimiento estructura multicelular y la transmisión de señales entre las células. En la piel, la interrupción de la conectividad de los desmosomas intercelulares regulado pueden dar lugar a trastornos de la queratinización y la enfermedad hiperproliferativa incluyendo el cáncer. Recientemente se acaba de ratones transgénicos que sobreexpresan antidesmogleína 2 (DSG2) en la epidermis desarrollar hiperplasia. Después de microarrays y análisis de redes de genes, se demuestra que DSG2 provocó un cambio profundo en el transcriptoma de los queratinocitos
in vivo
alterado y un número de genes importantes en la displasia epitelial incluyendo: las proteínas de unión a calcio (S100A8 y S100A9), miembros de la familia de proteínas ciclina, y la cisteína proteasa cistatina inhibidor A (CSTA). CSTA está desregulado en varios tipos de cáncer de piel, incluyendo los carcinomas de células escamosas (SCC) y la pérdida de función de las mutaciones conducir a trastornos recesivos fragilidad de la piel. Los resultados de microarrays fueron confirmados por qPCR, inmunotransferencia e inmunohistoquímica. CSTA se detectó un alto nivel a lo largo de la epidermis de ratones recién nacidos, pero se redujo drásticamente con el desarrollo y no se detectó predominantemente en las capas diferenciadas. En queratinocitos humanos, desmontables de DSG2 de siRNA o shRNA expresión reducida CSTA. Por otra parte, siRNA desmontables de CSTA dio como resultado la localización citoplasmática de DSG2, perturbado citoqueratina 14 tinción y niveles reducidos de desmoplakina en respuesta al estiramiento mecánico. Tanto desmontables de cualquiera DSG2 o CSTA pérdida de la adhesión celular inducida en un ensayo basado en dispasa y el efecto era sinérgico. Nuestros hallazgos aquí ofrecen una nueva vía de la regulación que implica CSTA DSG2 y una diafonía de potencial entre DSG2 y CSTA que modula la adhesión celular. Estos resultados apoyan aún más los recientes hallazgos genéticos humanos que la pérdida de función de las mutaciones en el gen CSTA de la fragilidad de la piel debido a la alteración de la adhesión célula-célula: ictiosis autosómica recesiva exfoliativa o descamación de la piel acral síndrome
Visto:. Gupta A, D Nitoiu, Brennan-D Crispi, Addya S, Riobó NA, Kelsell DP, et al. (2015) Cell ciclo- y asociados con el cáncer de genes redes activadas por DSG2: Evidencia de cistatina A La desregulación y un posible papel en la adhesión celular-celular. PLoS ONE 10 (3): e0120091. doi: 10.1371 /journal.pone.0120091
Editor Académico: Johanna M. Brandner, Hospital Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Alemania |
Recibido: 5 Septiembre, 2014; Aceptado: February 2, 2015; Publicado: 18 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Gupta et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. datos de microarrays se presentó a la Expresión Génica (número de acceso: GSE62814) Ómnibus
Financiación: Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (Mahoney, R01AR056067; Riobó, SR1 GM088256).. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los desmosomas son las principales estructuras de adhesión localizadas en las fronteras de célula a célula de las células epiteliales, donde los componentes de la placa citoplasmáticos, incluyendo el plaquinas (desmoplakina) y las familias de queratina, se ensamblan con el armadillo (plakoglobina y plakophilins) y la cadherina (desmogleínas y desmocollins) familias de proteínas [1,2]. Estas estructuras de adhesión son esenciales no sólo para el mantenimiento de la estructura celular y la integridad, sino también para el desarrollo de tejido y la morfogénesis. Las mutaciones dentro de la desmosome son la causa subyacente de muchos trastornos fragilidad de la piel con o sin anomalías cardíacas [3]. Además, también desmosomas servir como "centros de señalización" que juegan un papel activo en la modulación de varias vías importantes, incluyendo el /β-catenina y el factor potenciador del factor de células T /linfoide [4]. La creciente evidencia apoya su participación en la modulación de destino celular y la supervivencia. proteínas desmosómicas pueden activar la señalización intracelular a través de la modulación de los niveles de expresión y patrones, ambos de los cuales pueden alterar drásticamente la adhesión y la proliferación celular [5,6]. En la epidermis interfollicular, DSG2 normalmente se expresa en un nivel muy bajo y se limita a la capa de células basales proliferativa. Recientemente, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico que sobreexpresa antidesmogleína 2 (DSG2) en la piel [5]. Se determinó que la expresión ectópica de DSG2 activa múltiples vías de crecimiento y supervivencia que pueden promover el desarrollo y progresión del cáncer. Aunque los ratones transgénicos Inv-DSG2 desarrollado papilomas precancerosas y eran más susceptibles a la carcinogénesis inducida químicamente, el mecanismo por el cual DSG2 induce estos cambios sigue siendo poco clara. Recientemente, hemos mostrado que los asociados DSG2 con caveolina-1 proporcionando un mecanismo para la regulación de la señalización mitogénica y la modulación de la presentación en la superficie celular, ambos de los cuales pueden contribuir a la progresión maligna transformación y tumor [7]. En este informe, hemos tratado de identificar los genes asociados con el fenotipo hiperproliferativo comparando el perfil de expresión de ratones transgénicos Inv-DSG2 con ADNc a partir de ratones de tipo salvaje como control, a través de análisis de microarrays.
concreto, hemos encontrado DSG2 se asoció con la regulación de la cistatina a (CSTA, ratón Csta1-3), también conocida como Stefin a, inhibidor de la proteasa cisteína ácido, keratolinin o "epidérmico inhibidor de la proteasa-SH", un miembro de los inhibidores de la proteasa cisteína tipo 1 [ ,,,0],8-11]. CSTA se expresa principalmente en tejidos epiteliales y linfoides donde protege el procesamiento proteolítico de las proteínas citoplasmáticas y citosqueléticas catepsinas inhibidoras, los papaína-como, proteasas de cisteína lisosomal [12-14]. por lo tanto, no es sorprendente que CSTA posee un número de funciones biológicas, incluyendo un papel bacteriostática para proteger los tejidos de las proteasas de cisteína que son producidas por los patógenos invasores [15]. en la piel, CSTA fue inicialmente identificado en la envoltura celular córnea y se sugiere para jugar un papel en la función de barrera dirigidas a las proteasas de ácaros del polvo [16]. Más recientemente, hemos descubierto que las mutaciones en el
CSTA
gen son la causa genética subyacente de la condición de fragilidad de la piel conocida como ictiosis exfoliativa con la adhesión célula-célula alterada en las capas inferiores de la epidermis [17]. Además, las mutaciones recesivas CSTA pueden estar asociados con una enfermedad de la piel peeling acral [18,19]. A continuación, describimos una serie de estudios que investigan DSG2 y CSTA en la adhesión de los queratinocitos.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética que opera en virtud de la Universidad Thomas Jefferson interna Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) aprobaron protocolos (642b y 642D).
Generación de ratones transgénicos Inv-DSG2
ratones transgénicos que expresan DSG2 previamente establecidos en el diferenciador capas de la epidermis bajo el control de la involucrina (Inv) promotor (Inv-DSG2) [5]. En pocas palabras, el ratón
DSG2
.
Bandera
ADNc se subclonó en el pH3700-PL2 vector paterno epítopo en el
No
sitio de restricción I aguas abajo del promotor involucrina. Genotipado y caracterización de los ratones transgénicos se han descrito previamente en detalle [5]. el control de tipo salvaje y Inv-DSG2 hermanos de camada transgénicos de aproximadamente 6 semanas de edad fueron utilizados para estos estudios.
Análisis de microarrays
tejidos de la piel del ratón, almacenados en RNAlater (Qiagen, Valencia, CA), se pulverizaron con un mortal y una maja y se homogeneizaron en un homogeneizador Dounce. El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y RNeasy (Qiagen) de acuerdo con los protocolos de los fabricantes. ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 2 g de ARN utilizando cebadores de hexa-aleatoria y M-MLV transcriptasa inversa (Sistema SuperScriptIII, Invitrogen). La primera cadena de cDNA se sintetizó a partir de 5 g RNA total (de tipo salvaje 2 y 2 muestras transgénicas) por transcripción inversa y se usa para generar ARNc marcado con biotina por
in vitro
transcripción. Los microarrays fueron procesadas usando estreptavidina-Alexa 647 conjugado. Después de la hibridación, se lavaron las diapositivas fueron escaneadas para adquirir señales fluorescentes para cada mancha con un escáner confocal ScanArray XL-5000 (PerkinElmer, Boston, MA). Para cuantificar la intensidad de fluorescencia para cada punto en la matriz, imágenes de 16 bits, se analizaron mediante el software Quant Matriz 3.0 (PerkinElmer). Después de procesamiento de imágenes, los datos se analizaron por software GeneSpring 11,5 (tecnologías de Agilent, Santa Clara, CA). los valores de fondo sobre la base de las intensidades de señal alrededor de cada punto se restaron, y los resultados se normalizaron cuantil normalización y el uso de la línea de base mediana de la transformación de todas las muestras. microarrays de datos fue sometido a Gene Expression Omnibus (número de acceso: GSE62814)
Se utilizaron parcelas Volcán para identificar los genes expresados diferencialmente (mayor o igual a 2 veces y la significación estadística de p & lt; 0,05) utilizando de Student
t-test
(sin pareja) y no hay correcciones de pruebas múltiples. La lista de genes expresados diferencialmente se cargó en el análisis Ingenuity Pathway (IPA 9.0) de software para el análisis de redes.
análisis cuantitativo PCR en tiempo real (QRT-PCR) de
RT-PCR y DSG2
,
Csta1
,
Csta2
,
Csta2l1
, y
Csta3
ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN utilizando la alta capacidad cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Exón-que abarca los cebadores qPCR fueron diseñadas de la siguiente manera:
DSG2
, adelante 5'-GAG GAA TTG AGT GCA GCA CAT AC-3 ', 5'-CTT inversa GCT TCC ACC GTC AAG G;
Csta1
: adelante 5'-TGC TAA CAA CAG GGT ACC TCA G-3 ', 5'-CCA revertir TGG TGT TTT CAG TCT GGT-3';
Csta2
: delantero 5'-TGA ATG GTG TAG GAC GTT GC-3 ', 5'-reversa GGG ATC AGG TCA AGT TGG AA-3',
Csta2l1
: delantero 5' TGT CTT AAG TGG TAT TTC CAG TGA AAA CGA C-3 ', 5'-CAT revertir CTC TTT ACA ATG GGG GGG GG-3';
Csta3
: delantero 5'-CGC CAT CAA TGA GTC AAG AAA-3 ', 5'-GGC revertir CTC TGA AGA CTT TCA TGT G-3' y por el control interno
GAPDH
: adelante 5'-CCC ATC ATC ACC TTC CAG GAG CGA-3 ', 5'-TCC inversa ACC CTT CAA GTG GGC CCC-3'. Los ADNc se amplificaron en tampón de PCR que contiene 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Qiagen), 200 mM dNTPs, solución Q 1 unidad, 0,5 M de cebadores. La amplificación de cada uno de los cDNA fue un paso de desnaturalización a 94
° C durante 3 min y 35 ciclos de desnaturalización a 94
° C durante 30 segundos, hibridación a 58
° C durante 1 min y extensión a 72
° C durante 1 min, seguido por el último ciclo de extensión a 72
° C durante 7 minutos.
niveles de expresión génica se analizaron mediante análisis de QRT-PCR mediante el uso de 1 l de el cDNA y SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) de acuerdo con un protocolo de amplificación estándar en un sistema de detección ABI Prism 7900 de la secuencia (Applied Biosystems).
GAPDH
expresión se utilizó para normalizar los datos. Las secuencias de los cebadores empleados para QRT-PCR para
DSG2
,
Csta1
,
Csta2
,
Csta2l1
, y
¿Cuáles son Csta3 incluida anteriormente.
La inmunohistoquímica e inmunotransferencia
A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos eran de cualquiera de Sigma (St. Louis, MO) o Fisher (Waltham, MA). Para la histología, tejidos de la piel se fijaron en durante la noche la temperatura ambiente en una solución de formalina al 10%. Los tejidos fueron incluidos en parafina, seccionadas (4 micras), montados en portaobjetos de vidrio, y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Para la inmunotinción, tejidos embebidos en parafina fijados con formalina se calentaron a 60 ° C durante 1 hr y desparafinaron en xileno (3 veces), 100% EtOH (2 veces), 95% de EtOH (2 veces), 75% de EtOH, 50% EtOH, y H
2O [20]. Los antígenos fueron recuperados por microondas en Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, solución 1 mM EDTA, 0,05% de Tween 20, pH 9,0). Los tejidos se bloquearon en tampón de bloqueo (5% de suero de cabra normal, 1% de BSA, 0,1% Ttriton X-100 en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente (RT) y luego se incubaron con cistatina Un anticuerpo (01:50; AB4065, Millipore , Temecula, CA), DSG2 AB10 (1: 10.000) y la bandera M2 (1: 500, Sigma) en tampón de bloqueo, durante la noche a 4
° C. Los tejidos se lavaron en PBS (2 veces) y se incubaron con Alexa Fluor 488 anti-conejo IgG y anti-ratón IgG 594 (1: 400; Molecular Probes, Oregon) durante 1 hora, a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos se tiñeron con DAPI (1: 1000, Sigma) durante 1 min a TA en la oscuridad seguido de lavado en PBS
Para las transferencias Western, tejidos de la piel se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, pulverizado con mortal y mano de mortero. y se homogeneizaron en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS, inhibidor de la proteasa (PI) de cóctel (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y cóctel inhibidor de fosfatasa (Fisher). se determinó la concentración de proteínas (kit BCA Pierce, Pierce Biotech, Rockford, IL) y la inmunotransferencia se realizó tal como se describe anteriormente [21] con ~ 20 g de proteína en cada carril . resuelto sobre 4-20% de SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) anticuerpos primarios utilizados fueron: Flag M2 (1: 2000, Sigma); actina (1: 5000; Calbiochem, San Diego, CA); cistatina A (1: 1000; Millipore, Temecula, CA); DSG2 humana (1: 100; monoclonal Ab 10D2); DSP I /II (1: 250; Clone 5-11F; [22]); vinculina (1: 1000; . Abcam, Cambridge, Reino Unido) se detectaron señales con la adición de anticuerpo secundario conjugado con HRP (1: 5000; Jackson Labs, Bar Harbor, ME), se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Alternativamente, las señales se detectaron utilizando cabra específico anti-ratón de tinte IR 800 CW (1:. 20.000; LI-COR Cat 926 a 32.210) o de cabra anti-conejo IR tinte 800 CW (1:. 20.000; LI-COR Cat 926 -32.211) y más analizado y cuantificado por el sistema óptico Odyssey IR (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Las transferencias Western analizados por quimioluminiscencia se cuantificaron utilizando el software ImageJ desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud (página web: http://rsbweb.nig.gov/ij/). El análisis estadístico se examinó utilizando
t de Student
con un
p valor Red de & lt; 0,05 consideró significativo (*
p Hotel & lt; 0,05; **
p
& lt; 0,01; ***
p
. & lt; 0,001), con lo que las mediciones cuantificadas de tres experimentos independientes se normalizaron con el control de la carga actina
cultivo de células y siRNA desmontables de
DSG2
y
CSTA
(carcinoma epidermoide de la American Type Culture Collection, Bethesda, MD) A431 células se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina (P /S). Se cultivaron células A431 a ~ 60% de confluencia en placas de cultivo de 6 pocillos, privadas de suero durante 4 horas con 0,5% de FBS y 1% P /S antes de la incubación con 100 nM revueltos ARNsi de control (D-001810-10, Dharmacon, Thermo Scientific, Lafayette, CO) o siRNA agruparon a
DSG2 gratis (L-011645-00, Dharmacon) y
CSTA gratis (L-010020-00, Dharmacon) utilizando Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA) y medio Opti-MEM (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se volvieron a medio normal después de 18 horas y se incubaron durante 72 horas. Las células se lisaron en 9 M Urea entonces preparado para el análisis de transferencia Western como se describe anteriormente. células HaCaT se trataron con siRNA por transfección inversa según las instrucciones del fabricante utilizando Lipofectamine RNAiMAX. Por inmunofluorescencia, las células cultivadas fueron fijadas en MeOH -20 ° C durante 10 min y se permeabilizaron en 1% TX-100 durante 5 min. Después de los sitios no específicos se bloquearon, las células se incubaron con anticuerpo 10D2 para DSG2 o anticuerpo CSTA (ver arriba).
En algunos experimentos, las células tratadas con scrRNA o
CSTA
siRNA se sembraron en BioFlex placas de 6 pocillos que contienen una membrana de goma flexible recubierto con pronectin (Flexplates, Flexcell Internacional, Hillsborough, Carolina del Norte, EE.UU.). Las células fueron cultivadas a ~ 80% de confluencia, y las monocapas se destacaron mecánicamente con un sistema de tirantes Flexcell FX-4000 (Flexcell Internacional, Hillsborough, Carolina del Norte, EE.UU.) como se ha descrito anteriormente en detalle [17] (Blaydon et al., 2011). Las células se extendían a lo largo de 0-4 horas, y luego fijadas y teñidas de DSG2 (1: 500; Conejo AB10; [23]) y queratina 14 (1: 100; Clon LL001, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Las células también se lisaron en tampón de Laemmli para el Western Blot.
Desmontables de DSG2 por shRNA
células A431 transfectadas establemente con el vector retro-puro pSuper llevar nucleótidos específicos dirigidos shRNA a GFP (shGFP) o DSG2 (shDsg2) se establecieron como se ha descrito previamente en detalle [24]. En resumen, dos oligos ( '5-GAT CCC CGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT TCA AGA GAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC TTT TT-3' y '5-AGC TTA AAA AGA GAG GAT CTG TCC AAG AAT CTC TTG AAT TCT TGG ACA GAT CCT CTC GGG-3 ') fueron sintetizados, recocido, y se ligó en pSuper retro-puro (oligo-motor, Seattle, WA). la producción de retrovirus y la infección se llevó a cabo en las células Phoenix. A431 células transfectadas se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de SFB y puromicina (2 mg /ml).
disociación celular basada en dispasa ensayo
Para evaluar los efectos de la cistatina A y DSG2 en células adhesión, las células A431 Mock y shDsg2 se sembraron en placas de cultivo de seis pocillos a una densidad de 2 X 10
5 células /pocillo y después se trató con 50 nM revueltos ARNsi de control o siRNA a
CSTA
como se describe encima. Después de 72 horas, las células se lavaron con solución salina equilibrada de Hank y se incubaron con dispasa (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.) durante 5 min. Las láminas de células levantadas se sometieron a dispasa basado en ensayo de disociación pipeteando cinco veces mediante el uso de una pipeta de 1 ml. fragmentos de células fueron fijadas en solución de formalina al 3% y se tiñeron con cristal violeta. Los experimentos se repitieron al menos 3 veces. Observamos aquí, que estos experimentos se realizaron sin añadir calcio extra.
Resultados
Análisis de microarrays la comparación de tipo salvaje y Inv-DSG2 ratón transgénico de la piel
recientemente mostraron que la sobreexpresión de DSG2 bajo el control del promotor de la involucrina en la piel de ratones transgénicos (Inv-DSG2) dio lugar a la hiperplasia de la epidermis y la sensibilidad a la inducción de tumor [5] mejorada. Por otra parte, los ratones transgénicos Inv-DSG2 también desarrollaron papilomas benignos y son más susceptibles a la carcinogénesis inducida químicamente la piel de dos etapas. Estos resultados nos llevó a cabo una comparación de los perfiles de expresión génica entre los transgénicos y de control de ratones INV-DSG2. Para evitar las fluctuaciones y variaciones de fondo, nuestros ratones transgénicos DSG2 se cruzaron de nuevo al menos 5 generaciones de fondo C57BL6. Hemos optado por utilizar la piel de espesor total con el fin de observar los cambios en la expresión génica en la dermis que pueden haber sido introducidas por la epidermis suprayacente. Por lo tanto, de nuevo la piel de los compañeros de camada a las 6 semanas después de que se utiliza nacimiento
H & amp;. Secciones de tejido teñidas con E de las muestras de piel transgénicas exhiben extensa hiperplasia en comparación con la de la piel de tipo salvaje (S1A Fig.). La expresión del transgén se confirmó por análisis de transferencia Western mediante el cual el anticuerpo de la bandera de detectar la proteína de 160 kDa en el Dsg2.Flag transgénicos pero no en la piel de ratón de tipo salvaje (Fig S1B.). Además, la microscopía de inmunofluorescencia verificó la expresión de la proteína DSG2 Bandera de etiquetado en la epidermis superficiales de la transgénico, pero no los ratones de tipo salvaje (S1C Fig.). Estos resultados demuestran, como se describe anteriormente [5], que la expresión ectópica de DSG2 induce hiperplasia epidérmica sin alterar la expresión endógena de DSG2. En ambos ratón y humanos interfollicular epidermis, DSG2 se expresa a nivel significativamente bajo en la capa de células basales, y que el nivel de expresión disminuye aún más con el desarrollo [5,25]. En tejidos adultos, sólo se detecta una señal minuto cuando el nivel de exposición es mayor. Se hicieron intentos de co-inmunotinción para DSG2 y CSTA utilizando anticuerpos anti-DSG2. Sin embargo, debido a la naturaleza de dichos anticuerpos, baja expresión de DSG2 endógena, y el fondo es demasiado alto (datos no mostrados), se optó por utilizar anticuerpos anti-FLAG para detectar el transgén DSG2 Bandera de etiquetado. DSG2-Flag se expresa en la epidermis superficial bajo el control del promotor de involucrina de los ratones transgénicos como se ha descrito previamente en detalle [5].
muestras de ARN total aislado de la piel de dos transgénico y dos de tipo salvaje los ratones se usaron para generar sondas de ARNc marcadas con biotina y después se hibridaron a microarrays de oligonucleótidos que representan 21,619 genes de ratón (Fig. 1A). Una comparación de las señales promedio de genes reveló aproximadamente 492 genes alterados por más de dos veces en la respuesta a la expresión DSG2 (Tabla 1 y la Tabla S1). Un volcán parcela reveló que 275 transcripciones se upregulated y 217 downregulated con significación estadística (p & lt; 0,05, muestran en rojo, la figura 1B.). Estos 492 genes modulados en respuesta a DSG2 fueron analizados por el Programa de Análisis de Ingenio (Qiagen), que describe los 5 mejores redes de genes en función de su grado de adecuación a las moléculas de red admisibles en nuestro conjunto de datos (Tabla S2). Este análisis reveló una fuerte asociación con el ciclo celular (S2A Fig.) Y vías de regulación cáncer (S2B Fig.). Un número significativo de genes involucrados en diferentes fases de la regulación del ciclo celular se upregulated (rojo) en respuesta a DSG2 (y además resume en la Tabla S3). Del mismo modo, muchos genes implicados en la tumorigénesis también se upregulated en respuesta a DSG2 incluyendo, el punto de control mitótico proteína quinasa (
BUB1
) (S1 Tabla) y el 4-homeobox-distal menor (
DLX4
) y la proteína de susceptibilidad al cáncer (
BRCA1
) (S2 B Fig.). Es interesante sin embargo, dos miembros de la familia forkhead de factores de transcripción,
FOXC1
(-9,0 veces) y
FOXC2
(-11,7 veces), fueron regulados a la baja en los ratones transgénicos Inv-DSG2. FOXC2, en particular, induce la transición epitelial-mesenquimal y desempeña un papel en el cierre de los párpados [26,27]. Desmontables de expresión FOXC2 en células de cáncer de mama abroga su potencial metastásico [28], que implican a su papel en el desarrollo del cáncer. El papel de FOXC2 en la homeostasis de la piel y el desarrollo del cáncer no se conoce.
(A) ARN total fue aislado de la piel de 2 de tipo salvaje y 2 ratones transgénicos Inv-DSG2, transcripción inversa, marcado con biotina y se aplicó a una micromatriz de ADNc de ratón. El dendograma (mapa de calor) muestra que 492 genes estaban bien hasta reguladas (rojo /naranja) o ratones (azul /verde) en ratones transgénicos (T1 y T2) y de control (W1 y W2) las reguladas. plot (B) muestra el volcán log2 (cambio) en el eje x frente al log10-(valor p) en el eje y. Los puntos que tienen un factor de cambio inferior a 2 (log2 = 1) se muestran en gris. Las líneas verticales verdes delimitan en el que el factor de cambio es igual a 2 (línea derecha) es igual o-2 (línea izquierda). La línea verde horizontal demarca donde el valor p es de 0,05, con puntos por encima de la línea que tiene p & lt; 0,05 y puntos por debajo de la línea que tiene p & gt; 0,05. Se representan en rojo son los genes que exhiben un cambio mayor que 2 veces con una p & gt; 0,05 en epidermis transgénicas comparado con el control. Las flechas indican los genes de interés. (C) en tiempo real el análisis RT-PCR cuantitativo revela una media de 34,33 ± 1,32 veces mayor en la expresión del ARN DSG2 en Inv-DSG2 transgénicos (Tg) en comparación con la de tipo salvaje (WT). Además, la expresión de ARN para transgénico en relación con el control fueron:
Csta1
, 113,24 ± 2,23;
Csta2
, 1227,04 ± 1,26;
Csta2l1
, 1,11 ± 0,47;
Csta3
, 26,97 ± 0,44 (Barra = media ± DE; (* p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001;. De
t
prueba) Estudiante
la Tabla 2 enumera los diez primeros genes que son modulados en respuesta a DSG2. Esta lista compuesta por codifican proteínas implicadas en la tumorigénesis, incluyendo L-treonina deshidrogenasa (
TDH
, 39,2 veces ) y la proteína de secreción rica en cisteína (
CRISP3
, 8,8 veces) el hallazgo más sorprendente fue la mayor expresión de CSTA (
Csta1
, 18,4 veces;.
Csta2
, 5,7 veces; y
Csta3
, 12,4 veces) y varios miembros de la familia S100 de proteínas de unión a calcio (
S100A8
, 7,9 veces;
S100A9
, 4,1 veces; y
S100A4
, 2,3 veces) (Fig 1B;.. Tabla 3) Las proteínas S100A8 y S100A9 forman un complejo conocido como la calprotectina, que exhibe actividades antimicrobianas y se muestra para proteger las células epiteliales contra patógenos invasores [29]. Por otra parte, la expresión de genes de cuatro miembros de la familia de las proteínas ciclina también se incrementaron, incluyendo ciclina A2 (
CCNA2
, 5,8 veces), la ciclina B2 (
Ccnb2
, 5.4 veces), ciclina B1 (
ccnb1
, 4,6 veces), y la ciclina E1 (
CCNE1
, 2,6 veces), mientras que la expresión de uno de los miembros, la ciclina A1 (
ccna1
, -2.0 veces se encontró) para disminuir (Tabla 3). La familia de la ciclina de las proteínas regula las quinasas dependientes de ciclina y controla la progresión de las células a través del ciclo celular [30]. Este hallazgo es consistente con los resultados anteriores que muestran que DSG2 aumenta la proliferación celular. CSTA se ha demostrado que poseen actividad anti-apoptótica [31], está regulada positivamente en varias neoplasias epiteliales derivadas incluyendo SCC [32], y está mutado en trastornos defectuoso epidérmicas de adhesión célula-célula heredados [17-19]. Además, CSTA inhibe catepsinas [33,34], que también están desregulados en el cáncer de piel [35-37]. Por estas razones, nos hemos centrado el resto de este estudio sobre CSTA. La relevancia funcional de las proteínas S100 y ciclina se examinará en detalle en un estudio futuro.
Confirmación de DSG2-modulación de la expresión CSTA
Se confirmaron los resultados de microarrays mediante el examen de la expresión de mRNA CSTA ratón (1, 2, 2L1 y 3) por RT-PCR (S3 Fig.) y en tiempo real qPCR (Fig. 1C). En primer lugar, el ARN total fue aislado de la piel de dos de tipo salvaje representante individual y ratones transgénicos Inv-DSG2, cDNA se generó y se utiliza como molde para la PCR de confirmar la regulación al alza de
DSG2
,
Csta1
,
Csta2
, y
Hoteles en Csta3 transgénico en comparación con los ratones control (S3 Fig.). No se observó ningún cambio en la expresión de ARN con
Csta2l1
y
GAPDH
. Csta2l1 es altamente expresado en el hígado fetal, médula ósea y el bazo y se usó aquí como control negativo para la piel [38]. Los datos de RT-PCR fue validado por qPCR en tiempo real a partir de biopsias de la piel a partir del 3 de tipo salvaje y 3 ratones transgénicos (Fig. 1C). Una vez más, sobre regulación de
DSG2 gratis (34,33 ± 1,32) se observó en la piel de ratones transgénicos en comparación con la piel de los animales de control. Por qPCR en tiempo real, se observó un aumento de
Csta1 gratis (113.24 ± 2.23),
Csta2 gratis (1227,04 ± 1,39), y
Csta3 gratis (26,97 ± 0,44) , pero no
Csta2l1 gratis (1,11 ± 0,47). Con la excepción de
Csta2l1
, todos los cambios de transgénicos en comparación con las muestras de control fueron estadísticamente significativas. Curiosamente, la diferencia de cambio veces obtenida por qPCR en tiempo real fue significativamente diferente de la obtenida a partir del análisis de microarrays. Esto no es inusual y se ha observado en otros sistemas [39]. En resumen, el análisis de qPCR confirmó los datos de microarrays que demuestran que la expresión ectópica de DSG2 en la epidermis causó un aumento en la expresión del ARN del ratón
CSTA
familia de proteínas y que esta mayor expresión está regulada por la sobreexpresión de DSG2 en la piel.
a continuación, los lisados de la piel de los ratones de control recién nacidos y adultos (n = 3 cada uno) fueron immunoblotted para CSTA revelando alto nivel en la piel del recién nacido, pero disminuyeron drásticamente en la piel del adulto (Fig. 2A), corroborando con observaciones anteriores [40]. Curiosamente, se observó tinción citoplasmática y nuclear tanto para CSTA en la piel del recién nacido ratón por inmunofluorescencia (Fig. 2B). No se observó ninguna diferencia significativa en el nivel de CSTA entre el tipo salvaje y los ratones recién nacidos transgénico Inv-DSG2 (no mostrado). Sin embargo, desde CSTA fue baja en la piel de ratones adultos, la expresión ectópica de la DSG2 mejorado dramáticamente nivel CSTA (Fig. 2C). El anticuerpo Flag detectó la proteína Bandera de etiquetado DSG2 en el transgénico, pero no los ratones de tipo salvaje (Fig. 2C). Se observaron resultados similares utilizando el anticuerpo específico 10D2 DSG2 demostrando que la expresión ectópica de DSG2 en la epidermis superficial no alteró el nivel DSG2 endógeno (datos no mostrados). Debido a la naturaleza de los anticuerpos, no se pudo llevar a cabo la co-inmunomarcación para DSG2 y CSTA. Sin embargo, las condiciones fueron optimizados para inmunotinción para la DSG2 Bandera de etiquetado (anticuerpos anti-Flag) y CSTA (Fig. 2D). En la piel DSG2 Tg, CSTA se expresó en células, independientemente de la expresión del transgén, lo que sugiere un efecto no autónomo. La tinción para CSTA también se detectó en los corneocitos de ratones de tipo salvaje y aumentó en los ratones transgénicos (Fig. 2D). Aunque CSTA no se detectó por Western blot utilizando lisados totales de la piel, no podemos descartar que en el envoltura córnea, CSTA puede ser altamente reticulado y por lo tanto resistentes a la lisis en tampón de lisis SDS /DTT.
(A ) Western blot de lisados de la piel del recién nacido 3 y 3 adultos ratones C57Bl6 muestra alta expresión de CSTA en el recién nacido, pero prácticamente indetectable en la piel del adulto. Actina se utilizó como control para la igualdad de la carga. (B) Tinción de inmunofluorescencia confirma los resultados de transferencia Western que muestran alto nivel de CSTA en la piel del ratón recién nacido de tipo salvaje. Imagen ampliada en el recuadro muestra citoplasmática, así como la tinción nuclear para CSTA. (C) El análisis de Western de DSG2 y CSTA de tipo salvaje de adultos e Inv-DSG2 piel de ratón transgénico. Los resultados mostraron una expresión de la DSG2 Bandera de etiquetado y CSTA en el transgénicas, pero no los ratones de tipo salvaje. Actina mostró la igualdad de carga. (D) La inmunofluorescencia se realizó en la piel del adulto de tipo salvaje y ratones transgénicos que revelan aumento de los niveles CSTA en piel transgénica. Los núcleos fueron contra el teñidas con DAPI (azul).
A diferencia de los humanos con una sola
CSTA
gen, hay múltiples
CSTA
genes en ratones [41 ]. Mientras que el análisis de microarrays detectado tres
Csta1
,
Csta2
y
Csta3
, se desconoce cuál isoforma se expresa en la piel del ratón. Además, no se sabe que el ratón CSTA es reconocido por los anticuerpos disponibles en el mercado ya que no se han mapeado los epítopos para estos. Sin embargo, se especula que los anticuerpos pueden reconocer a todos Cstas debido a la alta homología de secuencia entre humanos y de ratón y entre las diferentes isoformas de ratón.
DSG2 modula la expresión CSTA
Para determinar si DSG2 modula CSTA humana en los queratinocitos, las células A431 fueron tratados con siRNA específico para DSG2 (siDsg2), CSTA (siCSTA) o ARN revueltos (scrRNA). Tres días después de la transfección, con scrRNA y siCSTA, análisis de transferencia Western mostraron que desmontables de CSTA no afectó la expresión de DSG2 (S4 Fig.). Por el contrario, una reducción dramática de DSG2 por siDsg2 pero no scrRNA, resultó en una reducción pequeña pero reproducible de CSTA (Fig. 3A, B). Para confirmar aún más el efecto de DSG2 sobre la expresión CSTA, se establecieron líneas celulares estables A431, con la eliminación de DSG2 utilizando ARN corto horquilla (shRNA) [24]. La inmunotransferencia reveló que DSG2 fue significativamente regulada en células shDsg2, en comparación con células shGFP (Fig. 3C, D). Actina se utilizó como control de carga.