Extracto
defectuosa como resultado la pérdida de la inmunidad innata y sensibiliza las células a la muerte citolítica mejorado después Vesticular señalización IFN virus de la estomatitis (VSV) infección. El examen de la condición de la inmunidad innata de las células normales humanas bronquiales epiteliales Beas2B y 7 células del cáncer de pulmón reveló que la abrogación de la señalización de IFN en células de cáncer se asocia con una mayor sensibilidad a la infección por VSV. La interrupción de la vía de IFN en líneas celulares de cáncer de pulmón y los tejidos tumorales primaria es causada por el silenciamiento epigenético de interferón crítico transcripción sensible factores de IRF7 y /o IRF5. Aunque el tratamiento 5-aza-2 'desoxicitidina falla para reactivar IRF7 y IRF5 expresión o proteger las células de la infección por VEV, la manipulación de la señalización de IFN mediante la alteración de la expresión de IRF cambia la susceptibilidad viral de estas células. Las células cancerosas pueden ser parcialmente protegidos de la muerte viral usando IRF5 + IRF7 sobreexpresión, mientras que el IFN vía de interrupción por transfección de siRNAs a IRF5 + IRF7 aumenta la vulnerabilidad de las células a la infección viral. Por lo tanto, IRF5 y IRF7 son factores de transcripción clave en la vía de IFN que determinan la sensibilidad viral de las células de cáncer de pulmón; la alteración epigenética vía de IFN en los tejidos de cáncer de pulmón proporciona biomarcadores potenciales para la destrucción selectiva de las células cancerosas con éxito mediante terapia basadas en estos agentes
Visto:. Li Q, Tainsky MA (2011) El silenciamiento de la epigenética IRF7 y /o IRF5 de pulmón Las células de cáncer provoca un aumento de la sensibilidad a los virus oncolíticos. PLoS ONE 6 (12): e28683. doi: 10.1371 /journal.pone.0028683
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 15 de agosto de 2011; Aceptado: 13 Noviembre 2011; Publicado: 14 Diciembre, 2011
Derechos de Autor © 2011 Li, Tainsky. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Cátedra Barbara y Fred Erb en Genética del cáncer al Dr. Tainsky, los fondos del Instituto Karmanos del cáncer, el Centro de Medicina Molecular y Tecnología Genética Genómica Aplicada en la Universidad Estatal de Wayne, y los Núcleos de Genómica y Bioestadística del Instituto del cáncer Karmanos , P30CA022453. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a medida que la principal causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres, el cáncer de pulmón es responsable de más de 1 millón de muertes en el mundo cada año. Aunque el diagnóstico y el tratamiento han mejorado, la tasa de supervivencia a cinco años es sólo del 14% en gran parte debido al fracaso de la cirugía de reducción de volumen tumoral y la quimioterapia sistémica. La mejora del tratamiento del cáncer de pulmón es un importante objetivo de salud pública. Recientemente, de origen natural o por ingeniería genética de virus oncolíticos, incluyendo el virus del sarampión, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), VSV, adenovirus, reovirus y el virus del herpes simple ofrecen una alternativa terapéutica eficaz y prometedora para combatir esta enfermedad [1]. Se usa solo o en combinación con quimioterapia, virus oncolíticos destruyen selectivamente las células tumorales por la orientación defectos de cáncer en las vías principales, como supresor de tumores p53, ras transducción de señal y señalización de IFN vías [1], [2]. Actualmente se está evaluando la eficacia y seguridad de los diferentes virus oncolíticos en el tratamiento de varios tipos de cáncer en modelos animales preclínicos y ensayos clínicos fase I-III [3]. Entre ellos, un virus ARN de cadena negativa VSV, que puede activar los mecanismos de inmunidad innata, se ha demostrado ser eficaz contra malignas de glioma, melanoma, leucemias, hepatocelular, de mama, de vejiga y de próstata que tienen respuestas antivirales defectuosos. vía [4], [5], [6], [7].
IFN tipo I de señalización se activa por la infección por VEV como la respuesta inmune innata primera línea para proteger los tejidos normales de muerte viral, y por lo tanto las células tumorales que han perdido su reactividad antiviral representan objetivos selectivos para VSV. La respuesta primaria a la infección viral y la absorción de los ARN de doble cadena es la activación TLR3 que está mediada por IRF-3, cJUN /ATF-2, y NFkB, induciendo de este modo la producción de genes de respuesta tempranos inmediatos principalmente IFNß. Esos IFNs de respuesta temprana se unen a los receptores de IFN de tipo I (IFNAR) de una manera autocrina o paracrina para activar STAT1 y inducir la expresión de genes de respuesta antivirales secundarias, incluyendo el factor de transcripción IRF7 que después promueve la expresión de otro IFN estimuló genes (ISGs). Por último, la onda transcripcional terciaria de IFNa establece un estado antiviral [8], [9].
El deterioro de la señalización de IFN está vinculado a un mayor riesgo de desarrollo de tumores [10] [11], [12, ] como la vía de IFN exhibe también actividades de vigilancia antiproliferativos e inmunológico contra el cáncer. En consecuencia, la mayoría (~ 80%) de NCI 60 panel de visualización de líneas celulares de cáncer interrumpido respuestas de inmunidad innata [9]. Hemos demostrado que la vía de señalización de IFN fue abrogada durante la inmortalización espontánea en fibroblastos de pacientes Síndrome de Li-Fraumeni (LFS), que están predispuestos a la aparición temprana y múltiples tumores debido a mutaciones en la línea germinal p53. Como un importante mecanismo de control epigenético, la hipermetilación del ADN de CpG en regiones promotoras reprime la expresión génica durante el desarrollo y la tumorigénesis. Varios ISGs se redujeron regulado por silenciamiento epigenético durante la inmortalización, un paso temprano y necesario en la carcinogénesis, y algunos de los mismos ISGs fueron hasta reguladas en la senescencia replicativa [13], [14], [15]. El tratamiento de las líneas de células inmortales de la EPA con 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-DC), un inhibidor de la DNA methyltransferases restaurado la señalización de IFN e indujo un estado de senescencia-como [13], [15].
los factores de transcripción de IFN-inducible, FIR, son mediadores esenciales de la IFN-respuesta. La falta de
IRF7
expresión aberrante correspondieron a la hipermetilación de islas CpG en el promotor y también fue identificado como uno de los genes silenciados metilación en varios tipos de cáncer incluyendo cáncer de pulmón, hepatocelular, gástrico y cáncer de páncreas [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. La reducción de expresión IRF5, otro factor de transcripción importante de la vía de IFN, se observó también en neoplasias hematológicas, lo cual es consistente con su papel para inducir el crecimiento de detención G2-M y la apoptosis [20]. inactivación epigenética de
IRF5
se observó de manera similar en hepatocelular y cáncer gástrico [21], [22]. Como inductores directos de la vía de IFN, IRF7 y IRF5 inducen la superposición de ISG perfiles de transcripción, sin embargo, los patrones de expresión diferencial y la cinética de ISGs acusados que poseen funciones redundantes y distintas en la respuesta inmune innata. En comparación con IRF7, IRF5 es un activador mucho más fuerte de los genes antivirales primeros incluyendo IFNß [23]. En un informe reciente se demostró que el aumento de expresión de IRF5 y /o IRF7 podría reactivar los genes relacionados con IFN, inhibir el crecimiento celular e inducir la senescencia [15]. El silenciamiento de estos FRI esenciales y la vía de IFN-supresora de crecimiento puede ser un evento temprano necesario en el desarrollo de cáncer, particularmente asociado con la inmortalización
.
A pesar de que las células cancerosas, con su IFN-vía-abrogada, pueden haber adquirido una ventaja de crecimiento /supervivencia sobre sus contrapartes normales, al mismo tiempo que pone en peligro su capacidad de protección antiviral. Aquí, se están explorando nuevos paradigmas terapéuticos que implican virus de ARN oncolíticos para dirigir el sistema inmune innato defectuoso en las células cancerosas. Se encontró que la sensibilidad a la oncolítico VSV fue fuerte y significativamente asociado con la interrupción de la vía de señalización de IFN. A falta de un máximo de regular la expresión de ARN de doble cadena ISG a la estimulación indicó una respuesta antiviral debilitada sensibilización de líneas celulares de cáncer de pulmón a la muerte celular inducida por oncolítico VSV. Sin embargo, no todas las células de cáncer de pulmón se pueden matar por la infección por VEV, ya que algunos de ellos poseen una vía relativamente normal inmunidad innata y, por tanto, son resistentes a la muerte mediada por virus VSV. secuenciación de bisulfito reveló la hipermetilación del promotor o bien
IRF7
y /o
IRF5
en varias líneas celulares de cáncer de pulmón. Del mismo modo, cuando se investigó el ADN de tejidos frescos congelados de cáncer de pulmón, se observó metilación del promotor de
IRF7
y /o
IRF5
, lo que sugiere que su respuesta antiviral IFN también fue silenciado epigenético como funcional y IRF7 se requiere IRF5 para una vía de IFN intacto. Sin embargo tratamiento con 5-aza-dC no pudo reactivar la expresión IRF5 o IRF7 o células de cáncer de pulmón de rescate de la infección por VSV. La alteración de la inmunidad innata mediante la manipulación de la expresión de IRF cambió la susceptibilidad viral de Beas2B normal de las células epiteliales bronquiales o células de cáncer de pulmón. Las células sin una respuesta funcional IFN están parcialmente protegidos de los virus de la siguiente IRF5 y IRF7 sobreexpresión, mientras que la interrupción de la señalización de IFN por la orientación IRF5 y IRF7 utilizando siRNAs aumentaron la vulnerabilidad células Beas2B 'a los efectos citolíticos de VSV. Por lo tanto, IRF5 y IRF7 son factores fundamentales en vía de IFN que determinan la sensibilidad viral de las células a los virus oncolíticos. La matanza de VSV altamente selectiva de las células de cáncer de pulmón con una vía de IFN alterada debido a la regulación a la baja de los FIR epigenetically indica que estos genes son ideales biomarcadores para determinar la susceptibilidad de los tumores a la terapia basadas en estos agentes.
Resultados
deficiencia en la señalización de IFN está asociado con sensibilidad VSV
la vía de IFN controla la respuesta celular a la infección viral y dsRNA. Las células que tienen un sistema antiviral innata completamente funcional son capaces de protegerse contra los virus, en gran parte debido a la inducción de IFN cascada de señalización. Hemos demostrado que la vía de IFN se inactivó epigenetically en fibroblastos de pacientes LFS después de inmortalización espontánea [14]. El examen del estado de la inmunidad innata en la línea de células epiteliales bronquiales normales Beas2B, sus
ras
transforma las células derivadas y 2 clones tumorigénicas reveló que a medida que la actividad de señalización de IFN disminuyó la sensibilidad a VEV matar aumentó durante la tumorigénesis de pulmón (Li y Tainsky, inédito datos). Debido a la inactivación funcional de la vía de IFN ha sido un rasgo común de muchos tipos de cáncer, se utilizaron 7 líneas celulares de cáncer pulmonar a largo plazo (4 adenocarcinomas: CRL5800, CRL5807, CRL5810 y CRL5872, 2 carcinomas escamosos: HTB172 y CRL5928 y 1 carcinoma de células pequeñas: CRL5869) para estudiar los cambios en su sistema inmune innato.
el uso de un conjunto representativo de ISGs en ensayos Q-RT-PCR, se analizó tanto los niveles basales de expresión de ISG y su expresión después de la estimulación de la vía de IFN sintético dsRNA polyI: C, que imita RNA viral [15]. Encontramos una menor expresión de línea de base de la mayoría de ISGs probados en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con células Beas2B (Tabla 1). La vía de IFN podría ser activado en las células Beas2B como 12 de los 14 genes fueron inducible por polyI: C estimulación. Por el contrario, polyI: C no inducir a los ARNm de los 14 genes probados en CRL5810 células, mientras que las deficiencias de inducción variable de genes esenciales respuesta antiviral como
IFN
,
IFNß
,
IRF7
,
IRF5
y
STAT1
se detectó en las células CRL5800, CRL5807, CRL5872 y CRL5869. Sorprendentemente, Q-RT-PCR demostró polyI:. C expresión inducible de 10 de cada 14 ISGs en HTB182 y CRL5928 células en niveles similares a Beas2B que indica una respuesta antiviral relativamente normal en esos dos células de cáncer de pulmón (Tabla 2)
Debido a la señalización inmune innato comprometida a menudo conduce a aumento de la sensibilidad a la muerte viral, se investigó la sensibilidad VSV para determinar si la falta de activación de ISG corresponde a la vulnerabilidad elevada a la muerte viral oncolítico en las células de cáncer de pulmón. Como era de esperar, las células Beas2B con IFN respuesta intacta resistieron la infección por VEV que presenta pocos cambios en la viabilidad celular. Además, HTB182 y CRL5928 eran relativamente resistentes en comparación con otras células de cáncer de pulmón como más de 60% de las células estaban todavía vivos en alta dosis VSV (MOI5), incluso sin tratamiento previo IFNa exógena (Figura 1A). Por el contrario, el resto de las líneas celulares de cáncer de pulmón pierde su capacidad de forma variable para protegerse de VSV. Un número creciente de células de cáncer de pulmón IFN-señalización deficientes (de ~ 30% a ~ 70%) murieron elevando dosis de exposición VSV y la adición de IFN en el medio de no inhibir la citotoxicidad de altas dosis de VSV (MOI5) en CRL5800, células CRL5810 y CRL5869 (Figura 1A). Curiosamente, los niveles basales reducidos de la mayoría de ISGs en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón sugirieron ninguna asociación entre la susceptibilidad VSV y los niveles de ISG basales (Tabla 1). La sensibilidad variable a la muerte viral correspondió al de la supresión diferencial de la respuesta de IFN en líneas celulares de cáncer de pulmón. Los efectos virolytic selectivos de VSV fueron más significativo en CRL5810 células consistentes con los defectos más graves en su sistema anti-viral innata (Tabla 2 y la Figura 1a). También se identificaron 5 ISGs (
IRF5
,
IRF7
,
STAT1
,
IRF3
y
IFI16
), cuya expresión era distintivamente elevado & gt; 3 veces en respuesta a poli I: C tratamiento sólo en líneas celulares de VSV-resistentes (Tabla 2 y la Figura 1A). El análisis de transferencia Western confirmó que la elevada expresión de ARNm ISG sobre polyI: inducción C resultó en niveles de proteína en las células upregulated VSV-resistentes. Ser727 fosforilación de STAT1 sólo puede ser inducida por IFNß pero no por IFNa [24], y se usó como un marcador específico de la activación de genes de respuesta temprana de la vía de IFN. Un fuerte polyI: C-inducción de fosforilados-STAT1 (p-STAT1, Ser727), STAT1, IRF5 y IRF7 los niveles de proteína fue consistente con la resistencia de las células Beas2B normales y las dos células cancerosas, HTB182 y CRL5928, a la infección por VSV y vice versa de la línea celular de cáncer de pulmón viral sensible. Mild fosforilación Ser727 de STAT1 se puede detectar en células CRL5807 indicando relativamente normal de señalización temprana IFN en esta línea celular en comparación con otras líneas de células VSV-sensible. IRF5 y los niveles de proteína IRF7 no fueron uniformemente inducible sobre polyI: tratamiento C en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón de virus sensibles (Figura 1B). Ningún cambio significativo de la proteína IRF3 se observó por polyI: Tratamiento C entre todas las células de cáncer de pulmón tal vez debido a que su actividad es principalmente regulada después de la traducción por cambios en la fosforilación (datos no mostrados). Por lo tanto, nuestras observaciones apoyan la asociación inversa entre la sensibilidad oncolítico de VSV y la capacidad de inducción de la señalización de IFN en las células epiteliales bronquiales células normales y cancerosas de pulmón Beas2B.
A. citotoxicidad selectiva de VSV en células de cáncer de pulmón con vía de IFN defectuoso. Beas2B y 7 líneas celulares de cáncer de pulmón se evaluaron por su capacidad para inducir una respuesta antiviral a la infección por VSV con o sin tratamiento previo por IFNa citopaticidad inducida por el virus usando el ensayo de MTT. Los valores se normalizaron al valor de las células no infectadas de control, que se establece en 100% a partir de al menos dos experimentos independientes (
n
= 3) con SD en & lt; 10%. (-): No hay control de la infección por VEV. MOI0.05: multiplicidad de infección de 0,05, una dosis baja de la infección por VEV. MOI5: multiplicidad de infección 5, alta dosis de la infección por VEV. B. niveles de expresión de proteínas de varios ISGs en polyI: C tratados Beas2B y las células de cáncer de pulmón se compararon con las células no tratadas utilizando transferencias Western. Doblar cambios IRF5 y expresión IRF7 después polyI: El tratamiento C se indica. Tubulina se utilizó como control normalizador.
epigenética silenciamiento de los factores de transcripción críticos
IRF7
y
IRF5
resultados en la abrogación de la vía de IFN
hipermetilación promotor es un mecanismo epigenético de la regulación de genes conocidos para silenciar la expresión de genes en los mecanismos de determinación del destino celular y la carcinogénesis. Hemos informado anteriormente de que la vía de IFN ha sido abrogada por el silenciamiento epigenético de un mediador clave de la defensa antiviral IRF7 en fibroblastos LFS inmortales [14], [15]. Curiosamente, otro estudio encontró exposición al humo del cigarrillo condujo a la supresión de la señalización de IFN debido a
IRF7
la hipermetilación del promotor, lo que dio lugar a las defensas antivirales disminución del epitelio respiratorio [25]. Por lo tanto, se investigó si la metilación del promotor de
IRF7
también podría ser la causa de la interrupción de la vía de IFN en líneas celulares de cáncer de pulmón. La secuenciación del ADN genómico de ADN tratado con bisulfito de sodio reveló
IRF7
promotor hipermetilación en líneas celulares de cáncer de pulmón 2 (CRL5810 y CRL5869), lo que sugiere que el silenciamiento epigenético de
IRF7
ha jugado un papel en el interrupción de IFN señalización en estas líneas celulares (Figura 2A). Desde IRF5 indujo un perfil de transcripción más fuerte de los principios de los genes antivirales [23] y ha sido recientemente identificado como un nuevo marcador para el cáncer de metilación [21], [22], hemos examinado aún más el estado de metilación de
IRF5
promotor regiones en las células de cáncer de pulmón. El aumento de
IRF5
hipermetilación se encontró en CRL5800, CRL5807, CRL5872 y CRL5810 líneas celulares (Figura 2B), por lo tanto la misma susceptibilidad del virus de
IRF7
-unmethylated CRL5800, CRL5807, CRL5872 células fue la consecuencia epigenético de
IRF5
inactivación. Por otra parte, la hipermetilación del promotor de ambos
IRF7
y
IRF5
explica la mayor sensibilidad a VEV se manifiesta por CRL5810 células. Por el contrario, las regiones promotoras de los ni
IRF7
ni
IRF5
resultaron ser metilado en Beas2B, CRL5928 y HTB182 líneas celulares compatibles con su inmunidad innata intacto y resistencia a matar virus oncolítico. En total, la pérdida selectiva de protección viral en células de cáncer de pulmón está relacionada con la inactivación epigenética de al menos una de las FIR que implican la necesidad de tanto IRF7 y IRF5 ser activo para una vía de IFN funcional.
El estado de metilación de islas CpG en el
IRF7
y
IRF5
regiones promotoras en Beas2B, líneas celulares de cáncer de pulmón y tejidos humanos primarios se examinó mediante la secuenciación de bisulfito tratados ADN genómico. A. IRF7. B. IRF5. Los círculos cerrados, C metilado en dinucleótidos CpG; círculos abiertos, C metilado en dinucleótidos CpG. TSS, sitio de inicio de la transcripción.
Dado que los eventos epigenéticos pueden producirse durante el cultivo a largo plazo, que no estaban presentes en el cáncer original, que examinó los patrones de metilación del promotor de IRF-en tejidos de cáncer de pulmón primario fresco congelado . El
IRF7
promotor metilado fue totalmente en 6 de cada 20 NSCLC, mientras que otros 5 tumores tenían metilación 5'-parcial (Figura 2B) como un evento inicial que puede diseminarse hacia los sitios CpG [26]. De forma paralela, se encontró metilación pesado en 4 de 20 muestras de NSCLC y otros 11 tenían metilación parcial de los
IRF5
regiones promotoras. En general, 15 de cada 20 muestras de pacientes tenían promotor de metilación de uno o ambos los FIR, eventos suficientes para atenuar su respuesta de IFN. Sin aberrante
IRF7
o
se detectó IRF5
hipermetilación en los que coinciden con los ADN de la capa leucocitaria de estos mismos pacientes que indican que la hipermetilación del promotor IRF no fue el resultado de los cambios epigenéticos en la línea germinal. Por lo tanto la metilación
IRF7
o
IRF5
promotores que se encuentran en las líneas celulares de cáncer de pulmón, probablemente tuvo su origen en el tumor en lugar de ser un evento seleccionado durante al cultivo celular. Nuestros resultados demostraron que el aumento de la susceptibilidad a la infección viral es mediada por mecanismos epigenéticos abajo de la regulación clave reguladores de la vía de defensa antiviral IRF5 y IRF7. La prevalencia de silenciamiento epigenético de los FIR y su estrecha asociación con la sensibilidad VSV los hacen ideales teranósticos biomarcadores para evaluar a los pacientes con cáncer de pulmón para una posible terapia basadas en estos agentes.
Manipulación de IFN vía de señalización de orientación FRI altera la sensibilidad del virus VSV
Hemos demostrado previamente que el 5-aza-dC tratamiento desmetilación podría restaurar la expresión de genes silenciados de epigenetically
IRF7
y otra ISGs reactivando así la vía de señalización de IFN en líneas celulares de fibroblastos de la EPA inmortales [14], [15] . Para nuestra sorpresa, los niveles de expresión y IRF7 IRF5 permanecieron ausentes (Figura 3A, a menos de 1,5 veces mayor tanto para IRF5 y IRF7) en la línea celular de cáncer de pulmón después del tratamiento CRL5810 5-aza-DC durante el tiempo sólo 4 semanas. Sorprendentemente, la secuenciación de ADN tratado con bisulfito en el
IRF5
y
IRF7
regiones promotoras reveló que la aplicación prolongada 5-aza-DC no fue capaz de revertir la hipermetilación del promotor FRI en CRL5810 células (datos no mostrada). se encontró resistencia similar al tratamiento 5-aza-dC para la otra línea celular de cáncer de pulmón IRF7-metilado CRL5869 (datos no mostrados). Como resultado, el tratamiento desmetilación extendida con 5Aza-dC fue incapaz de afectar a la sensibilidad VSV de CRL5810 células (Figura 3B) y además indican que IRF5 y IRF7 son dos de los factores fundamentales en la señalización de IFN que pueden regular la sensibilidad viral oncolítico.
A. transferencias Western revelaron ningún aumento de IRF7 o IRF5 expresión de la proteína después del tratamiento 5-aza-dC de CRL5810 células. Doblar cambios IRF5 y expresión IRF7 se indica en la parte superior de la columna 5-aza-dC tratada. células B. CRL5810 seguían siendo sensibles a los efectos de VSV cytolyic después de 5-aza-DC tratamiento.
Ninguno de estos dos factores de transcripción IRF fue capaz de ser inducida en células de cáncer de pulmón VSV-sensibles (Tabla 2 y la Figura 1B), mientras que la sobreexpresión de IRF5 y /o IRF7 en fibroblastos LFS inmortales upregulated otra ISGs, manifiesta una señalización inmune innata rápido y más fuerte a la estimulación dsRNA, que es suficiente para inducir la senescencia [15]. Con el fin de reactivar la respuesta de IFN discapacitados en células de cáncer de pulmón, y IRF5 solo o en combinación IRF7 fueron transfectadas de forma estable en células CRL5810, en el cual sostenidos tratamiento con 5-aza-DC sin efecto sobre la desmetilación del promotor IRF. El análisis de transferencia Western confirmó la expresión de la proteína basal elevada de los FIR en IRF5 y IRF7 que sobreexpresan las células (Figura 4A). restauración individuales de expresión IRF protegida parcialmente CRL5810 células de VSV citolisis con el mayor aumento de la viabilidad celular de ~ 50% a más del 85% en MOI0.05, y de ~ 30% a ~ 50% en MOI5 de la infección por VSV en células que sobreexpresan tanto IRF5 y IRF7 comparación con las células de control de vector (Figura 4B). Nos explicó la modesta ganancia de protección viral incluso después de IRF5 y IRF7 transfección combinado por la pérdida severa de otros ISGs importantes en CRL5810 células como se indica por la falta de efecto sobre exógeno IFN.
A. los niveles de expresión de proteínas de STAT1, IRF5 y IRF7 se analizaron mediante transferencias Western en IRF estable transfectaron células CRL5810. anticuerpo anti-flag se aplicó para detectar los niveles de proteína IRF transfectadas, mientras IRF5- y anticuerpos específicos IRF7 se utilizaron para la expresión de proteínas totales IRF. B. La sobreexpresión de IRF5 y /o IRF7 aumentó parte la resistencia a CRL5810 células a la infección por VEV con los más aumento en el trasfection combinado. * P & lt; 0,02, ** p & lt;. 0.001
La replicación selectiva de VSV en los tumores con IFN vía comprometida es la piedra angular para su aplicación clínica como terapia basadas en estos agentes. Sin embargo, no todos los tipos de cáncer con cáncer de pulmón de pacientes son deficientes en su vía inmune innato. Para superar este obstáculo y destruir esas células VSV-resistente, siRNAs a IRF5 (siIRF5) y IRF7 (siIRF7) se aplicaron para suprimir la respuesta de IFN en las células con IFN vía activa. En comparación con las células transfectadas con Beas2B control mezclado siRNA, las células transfectadas con siIRF5 o siIRF7 resultaron en una disminución de la IRF5 y la inducción IRF7 después polyI: tratamiento C, mientras que la transfección de ambos siIRF5 + siIRF7 totalmente eliminado IRF activación (Figura 5A). La transfección de siIRF5 solo polyI inhibió significativamente: C-activación de ambos IRF5 y IRF7, que puede ser explicado por un papel esencial para IRF5 como un fuerte inductor de la IFNß [23]. IRF5 expresión disminuida por siIRF5 fue mucho menor producción IFNß que reduzca la estimulación de la respuesta secundaria IRF7 gen. Como era de esperar, la supresión de estos 2 genes por siRNAs resultó en una pérdida significativa de la protección contra la infección por VSV con el aumento más citotoxicidad a casi 40% a la dosis más alta exposición VSV en las caídas de combinación en comparación con el control de siRNA (Figura 5B). Se observaron resultados similares en estudios de transfección paralelas de células CRL5928 VSV-resistentes, que tienen la señalización de IFN relativamente intacto (datos no mostrados). Esto demuestra claramente que IRF5 y IRF7 son funcionalmente esencial para la inmunidad innata que determina la sensibilidad viral de estas células.
A. Abrogación de IRF5 y /o inducción IRF7 de siRNAs sobre polyI: treatmentwas C representadas por Western blot. Doblar cambios IRF5 y expresión IRF7 después polyI: El tratamiento C se indica. Si (-): control de siRNA. B. IRF5 y IRF7 son factores importantes que determinan la sensibilidad viral de las células. La inhibición de estos 2 genes como resultado la pérdida de la protección de la infección por VSV con el aumento más citotoxicidad en la caída de combinación. * P & lt; 0,03, ** p & lt;. 0.001
En resumen, la pérdida de la señalización de IFN es necesario y suficiente para una mayor sensibilidad a la muerte por virus oncolíticos. La manipulación de la vía de IFN a través de los factores de transcripción y IRF5 IRF7 alteran la respuesta de las células a la infección por VEV. Análisis de la vía de IFN usando estos biomarcadores de metilación IRF puede proporcionar nuevos biomarcadores teranóstica para determinar la sensibilidad de un paciente a los virus oncolíticos.
Discusión
Un sistema antiviral inmune innato funcional protege a las células contra la infección viral, principalmente debido a la inducción de la cascada de señalización de IFN defensiva, lo que parece ser la base para la resistencia a virus y propiedades estimulantes inmunes. Aquí, hemos demostrado la relación inversa fuerte y convincente entre la respuesta innata antiviral eficaz y la susceptibilidad del virus oncolítico usando líneas celulares de cáncer de pulmón. Por otra parte, los factores de transcripción y IRF5 IRF7 fueron identificados como reguladores críticos de sistema inmune innato y biomarcadores útiles para la susceptibilidad del virus oncolítico en células de cáncer de pulmón ya que ambos tienen que ser inducible por una vía de IFN funcional. La inactivación de cualquiera IRF5 o IRF7 debilita la respuesta antiviral con la pérdida más significativa cuando ambos fueron silenciadas en los FIR epigenetically en CRL5810 células. El grado variable de muerte citolítica se relaciona con la gravedad diferencial de los defectos de la vía de IFN. A pesar de la presencia de IFN exógeno, CRL5810 son células no responden y siguen siendo vulnerables a VSV matar correspondiente a la interrupción completa de la actividad de la vía de IFN.
La pérdida de la expresión del gen supresor de tumores por metilación aberrante promotor es un primitivo común evento epigenética durante el inicio y la progresión del cáncer [27]. Hemos demostrado silenciamiento epigenético de
IRF5
y
IRF7
en las islas CpG de regiones promotoras de cáncer de pulmón. La orientación farmacológica de los cambios epigenéticos aberrantes por parte de agentes de desmetilación ha demostrado eficacia clínica en varias neoplasias malignas hematológicas [28]. Sin embargo, estos inhibidores de la metilación no pueden prevenir la recurrencia de la hipermetilación y nos han presentado pruebas de que la desregulación epigenética no puede ser totalmente revertida en una serie de líneas celulares de cáncer de pulmón. El fracaso de los agentes de desmetilación para restaurar la expresión de ISG fundamental indica que las células de cáncer de pulmón son objetivos ideales para la terapia viral oncolítico.
Aunque los niveles basales de la mayoría de ISGs se redujeron en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón en comparación con epitelio bronquial normal de las células, la sensibilidad del virus oncolítico se asocia únicamente con polyI: C-inducible niveles de expresión de ciertos ISGs clave como IRF7 y IRF5. Sin embargo, IRF5 y la sobreexpresión IRF7 no es suficiente para restaurar completamente vía de IFN y células sólo parcialmente rescatado de la infección viral debido a la deficiencia de otras ISGs importantes. Si no se induce la fosforilación de Ser727 a polyI: Tratamiento C sugirió defectos adicionales de inmunidad innata en varias líneas celulares sensibles VSV (Figura 1B). Además, el ARNm de otros 3 ISGs (STAT1, IRF3 y IFI16, Tabla 2) se induce constantemente en las células VSV-resistentes. Se necesitan más estudios para confirmarlos como biomarcadores teranósticos y pueden identificar ISGs adicionales como biomarcadores en el cáncer de pulmón cuya activación podían distinguir resistente a los virus de cánceres sensibles al virus.
Hemos presentado evidencia de que la inactivación funcional de IRF5 y es IRF7 el principal mecanismo para interrumpir IFN señalización en células de cáncer de pulmón. Sin embargo, diversos tumores malignos albergan diversos defectos moleculares de esta vía. Desregulados L vías JAK3 y RNasa en las células de cáncer de próstata LNCaP [29], STAT1 defectuosa y la activación STAT2 en células de fibrosarcoma y melanoma [30], [31] y las reguladas IFNAR en el cáncer de vejiga de alto grado [32] han sido reportados a desactivar la señalización inmune innato. En general, la vía de IFN es frecuentemente downregulated durante la tumorigénesis a pesar de que grupos distintos de ISGs son suprimidas por diferentes mecanismos de forma cáncer de tipo específico.
Un fallo para activar la respuesta inmunidad innata a la infección por virus de ARN conduce a oncolítico la holgura muy selectiva de las células tumorales IFN-no responde. Además de VSV, otros virus de ARN tales como NDV [33] y el virus de la influenza [34] también se han demostrado tener citotoxicidad selectiva del tumor mediante el mismo mecanismo para dirigirse a las células con actividad de IFN disminuida. Los ensayos clínicos de la administración intravenosa de NDV (PV701) demostraron sus efectos oncolíticos iniciales en varios tumores sólidos [35]. Además, VSV cepas con mutaciones de la proteína M (AV1 y AV2) activan más robusta respuesta antiviral debido a sus defectos en la capacidad de señalización de apagado IFN; estos mutantes se destruyen selectivamente en las células IFN-sensible a una dosis terapéutica más baja sin dejar de ser altamente lítica en células de cáncer [9]. La expresión de proteínas estimulantes inmunes como interleucina-2 (IL-4) o IFNß en VSV por ingeniería genética también se ha generado para promover respuestas citolíticas virales [5], [6]. Por lo tanto, las respuestas de impulso anti-virales en células normales mejorar la selectividad oncolítico en los tumores de IFN-no responde.
Aunque una respuesta antiviral reducida puede ser una característica común de una amplia gama de tipos de cáncer, la eficacia oncolítica de ARN de origen natural virus todavía puede ser relativamente baja, ya que algunos tumores manifiestan robustas respuestas de inmunidad innata que inhiben la replicación viral y la propagación.