Extracto
Antecedentes
Este estudio tiene por objeto investigar la importancia funcional de heparán sulfato (glucosamina) 3-
O
-sulfotransferase 2 (
HS3ST2
) hipermetilación en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
Metodología /Principales conclusiones
HS3ST2
hipermetilación se caracterizó en líneas celulares de cáncer de pulmón de seis, y su importancia clínica se analizó utilizando 298 parafina de tejidos fijados con formol y 26 tejidos frescos congelados de 324 pacientes con CPNM. MS-GRH (metilación específica de alta resolución de fusión) y EpiTYPER
TM ensayos mostraron hipermetilación sustancial de isla CpG en la región promotora del
HS3ST2 Hoteles en líneas celulares de cáncer de pulmón de seis. El gen silenciado se desmetiló y re-expresa mediante el tratamiento con 5-aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC). Un ensayo de promotor también mostró la actividad del promotor mínimo de HS3ST2 estaba regulada por metilación. expresión exógena de HS3ST2 en células de cáncer de pulmón H460 y H23 inhibe la migración celular, la invasión, la proliferación celular y que desmontables de HS3ST2 en NHBE células inducida por la migración celular, invasión y proliferación de células
en
vitro
. Se observó una correlación negativa entre los niveles de ARNm y de metilación de HS3ST2 en 26 tumores fresco congelado tejidos (ρ = -0.51,
P = 0,009;
de correlación de Spearman).
HS3ST2
hipermetilación se encontró en 95 (32%) de 298 NSCLC primarios. Los pacientes con
HS3ST2
hipermetilación en la etapa 193 ganglios negativos I-II NSCLC con un período de seguimiento medio de 5,8 años tenía mala supervivencia global (razón de riesgo = 2,12, 95% intervalo de confianza = 1,25 a 3,58,
P
= 0,005) en comparación con aquellos sin
HS3ST2
hipermetilación, después de ajustar por edad, sexo, tamaño del tumor, la terapia adyuvante, la periodicidad y la diferenciación.
Conclusiones /Importancia
El presente estudio sugiere que
HS3ST2
hipermetilación puede ser un indicador pronóstico independiente de la supervivencia global en el escenario con ganglios negativos I-II NSCLC
Visto:. Hwang JA, Kim Y , Hong SH, Lee J, Cho YG, Han JY, et al. (2013) epigenética La inactivación de heparán sulfato (glucosamina) 3-
O
-Sulfotransferase 2 en el cáncer de pulmón y su papel en la tumorigénesis. PLoS ONE 8 (11): e79634. doi: 10.1371 /journal.pone.0079634
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: 22 de mayo de 2013; Aceptado: September 25, 2013; Publicado: 12 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Hwang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Centro Nacional del cáncer (NCC 1110140-1 y 1110100-2), la Corea de tecnología sanitaria R & amp; D Proyecto, Ministerio de Salud, Bienestar & amp; Asuntos de la Familia, República de Corea. (A084947AA202308N100010A), y la Fundación Nacional de Investigación de Corea subvención (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST) (Nº 2011-0029138), República de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo. A pesar de los importantes avances en la detección temprana y el tratamiento en las últimas dos décadas, el pronóstico sigue siendo pobre, con la que asoma la tasa de supervivencia global a los 5 años a menos de 15% [1]. El mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón como resultado en gran parte de micrometástasis, lo que hace menos probable que curar, y en parte de la alta tasa de recurrencia después de la resección curativa; pacientes con cáncer de pulmón en estadio I tienen una supervivencia a cinco años de & lt; 50% si el cáncer se ha diseminado a los ganglios linfáticos cercanos u otras áreas. Más del 80% de las recidivas se producen dentro de los dos primeros años; las tasas de recurrencia después de la resección quirúrgica curativa con la linfa adecuada gama disección de los ganglios del 20% al 50%, dependiendo de la etapa patológica [2]. Por lo tanto, el descubrimiento de biomarcadores moleculares para la detección temprana y la identificación de pacientes con alto riesgo de recurrencia es claramente importante.
heparán sulfato (HS) es un polisacárido lineal que se encuentra en todos los tejidos animales, y se produce como un proteoglicano en el que dos o tres de glicosaminoglicanos heparán sulfato lineales (GAG) cadenas están unidos covalentemente a residuos de serina específicos en una proteína núcleo a través de un enlazador tetrasacárido [3]. Las cadenas de HS se ensamblan en una proteína del núcleo por las enzimas en el aparato de Golgi y se componen de unidades repetidas de disacáridos de glucurónico (GlcA) o ácido idurónico (IdoA) y
alterna N
glucosamina -acetil (GlcNAc). Durante el montaje, se someten a una serie de modificaciones secuenciales que comienzan con
N
-deacetylation y
N
-sulfation de los residuos de glucosamina. Adyacente a esta primera modificación, algunos residuos GLCA se epimeriza a idurónico ácido por una epimerasa C5 y luego 2-O-sulfatado, con más de sulfatación en las posiciones 6-O y 3-O de los residuos de glucosamina para producir cadenas maduras [4,5 ]. Las modificaciones son importantes para la estructura fina de los proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG) y en la especificidad de la interacción proteína-sulfato de heparán.
El heparán sulfato gratis (
glucosamina
)
3-O-
sulfotransferasa
2 gratis (
HS3ST2
), un miembro de la heparán familia de enzimas de biosíntesis de sulfato, heparán sulfato posee glucosaminil 3-
O
actividad -sulfotransferase que modifica cadenas de GAG [6,7].
HS3ST2
hipermetilación Recientemente se ha informado en una variedad de cánceres, como el cáncer de mama [8,9], el cáncer colorrectal [8,10,11], cáncer gástrico [12], neoplasia hematológica [13], cáncer de pulmón [8], cáncer de páncreas [8], cáncer de próstata [14], y el cáncer cervical [15,16].
HS3ST2
hipermetilación se encontró en una alta frecuencia en el carcinoma ductal in situ de la mama [9] y en muestras de citología de neoplasia intraepitelial cervical 3 (CIN3) [15], lo que sugiere
HS3ST2
hipermetilación probablemente ocurre temprano durante la transformación maligna de la mama y de cuello uterino.
HS3ST2 también muestra
ha elevado metilación en cáncer de próstata con recidiva [14]. Además, la frecuencia de
HS3ST2
hipermetilación es alta en alto grado de lesión intraepitelial escamosa (HSIL) del cuello uterino en comparación con el bajo grado de lesión intraepitelial escamosa (LSIL) [16]. Sin embargo, el significado clínico-patológica de
HS3ST2
hipermetilación sigue siendo difícil de alcanzar en el cáncer de pulmón. Para obtener una mejor comprensión de la función de los
HS3ST2
hipermetilación en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que caracteriza
HS3ST2
hipermetilación en líneas celulares de cáncer de pulmón y seis investigó el efecto de la hipermetilación de
HS3ST2
sobre el fenotipo y el pronóstico de cáncer de pulmón en los tejidos incluidos en parafina de 298 no pequeñas de cáncer de pulmón de células primarias (NSCLC).
Materiales y Métodos
cultivo celular y muestras de tejido
Seis líneas celulares humanas de cáncer de pulmón (H23, H226, H460, H520, H1650 y A549) y dos líneas de células epiteliales bronquiales humanas (HBEC y NHBE) se obtuvieron de la American Type Culture Collection ( Manassas, VA). Las células se cultivaron en un medio de crecimiento designada suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (Hyclone, Logan, UT) y 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, EE.UU.). Veintiséis tumoral fresco congelado y los tejidos normales correspondientes, así como 298 tejidos tumorales incluidas en parafina, se obtuvieron de un total de 324 pacientes con CPNM que fueron sometidos a resección curativa en el Departamento de Cirugía Torácica y Cardiovascular, Samsung Medical Center, Seúl, Corea entre agosto de 1994 y noviembre de 2005. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional en el Centro Médico Samsung, y el consentimiento informado por escrito para el uso de tejidos se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía. Post-operatorio de seguimiento para la supervivencia o la recurrencia se realizó como [2] se describe anteriormente. el estadio TNM patológico se determinó de acuerdo con las directrices del Comité Conjunto sobre el Cáncer [17]
extracción de ADN genómico y sodio modificación con bisulfito
H & amp;. E (hematoxilina y eosina) de tinción fresca se realizó tejidos -frozen y embebidos en parafina; las áreas tumorales contenían al menos 75% tejido neoplásico. El ADN genómico de células cultivadas y de 26 tumor fresco congelado y tejidos normales y 298 tejidos tumorales embebidos en parafina se extrajo utilizando el Kit MagAttract DNA Mini (Qiagen, Hilden, Alemania) y el kit DNeasy Tissue (Qiagen, Valencia, CA) correspondiente, respectivamente. Un microgramo de ADN genómico fue modificado por bisulfito de sodio usando el kit de ADN EZ metilación-Gold (Zymo Research, Irvine, CA).
ensayo de MS-GRH, EpiTYPER
TM ensayo, y PCR
Para encontrar las regiones altamente metilados en el
HS3ST2
promotor, una región 2 kb que contiene la metilación específica los 1,5 kb
HS3ST2
promotor se analizó con una alta resolución de la metilación específica de fundir (MS-GRH) en un ensayo en tiempo real instrumento de PCR LightCycler®480 (Roche, Switerland). El estado de metilación de una región de 1,5 kb que se ha encontrado para ser altamente metilado mediante el ensayo de MS-GRH se analizaron cuantitativamente mediante el EpiTYPER
TM ensayo (Sequenom, San Diego, CA) para analizar los estados de metilación de CpG individuales. regiones analizadas están representados en la figura 1A. Los cebadores para cada ensayo fueron diseñados utilizando SEQUENOM (San Diego, CA) software EpiDesigner (Tabla S1 y S2). El estado de metilación de
HS3ST2 Hoteles en los 298 tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina se determinó mediante PCR específica de metilación (MSP) con dos juegos de cebadores (Tabla S3), que cubre la región del promotor, como se ha descrito anteriormente
2. Las reacciones se iniciaron caliente a 94 ° C antes de añadir 2,5 unidades de Taq polimerasa. La amplificación se llevó a cabo durante 35 ciclos (30 s a 94 ° C, 30 s a la temperatura de recocido, 30 sa 72 ° C), seguido de 4 minutos a 72 ° C. Los resultados del análisis de MSP se puntuaron visualmente por dos autores (Y Kim y Kim D-H). Las muestras con una intensidad de la banda más fuerte que el control negativo en la PCR específica de metilación se denotan metilado, y muestras sin producto de PCR visible fueron considerados como no metilado.
(A) CpG mapa de la isla de
HS3ST2
promotor y las regiones analizadas usando MS-GRH ensayo y EpiTYPER. estado (B) La metilación de
HS3ST2
se evaluó por primera vez en seis líneas celulares de cáncer de pulmón y dos líneas de células epiteliales bronquiales utilizando MS-GRH. (C) El estado de metilación de CpG individuales en una región promotora de 1,5 kb (HRM-04, 05, 06, 07, 08 y 09) se analizó cuantitativamente en las líneas celulares utilizando el ensayo TM EpiTYPER
. los niveles de metilación se representan como un cambio de color en una escala continua de rojo (0% metilado) al blanco (100% metilado). (D) Los niveles de transcripción de
HS3ST2
se compararon entre las líneas celulares de cáncer de pulmón altamente metilados y líneas de células epiteliales bronquiales por QRT-PCR (barra de color negro). La recuperación de
HS3ST2
transcripción fue evaluada después del tratamiento de líneas celulares de cáncer de pulmón de seis con 5-aza-DC durante 72 h (barra gris vs. barra blanca;
P
-valores se basan en Wilcoxon de ensayo firmado-rank). (E) El estado de metilación de CpG en la zona altamente metilado ATG del
HS3ST2
gen se evaluó después del tratamiento con 5-aza-DC durante 72 h. El mapa de calor muestra los patrones típicos de desmetilación en las células de cáncer en respuesta a 5-aza-DC, y los porcentajes indican los niveles promedio de metilación.
Análisis de la expresión HS3ST2
Para examinar la expresión de HS3ST2 a nivel de mRNA, cDNA se sintetizó a partir de dos g de ARN total utilizando el superíndice
TM III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, CA). La expresión de mRNA HS3ST2 se analizó mediante RT-PCR cuantitativa y PCR en tiempo real (QRT-PCR). Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en un LightCycler
® 480 Real-Time PCR System (Roche Applied Science). GAPDH se utilizó como gen de referencia, y el nivel de expresión relativa se calculó usando la? C
método T (? C
T = C
T de GAPDH - C
T de HS3ST2). El experimento se realizó por triplicado y los cebadores QRT-PCR utilizados fueron los mismos que en el RT-PCR. Los cebadores se diseñaron para contener exón-exón cruce (Tabla S3).
tratamiento con 5-aza-DC in vitro
Seis líneas celulares de cáncer de pulmón se incubaron con 10 M 5-aza-2 '-deoxycytidine (5-aza-dC; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) durante 72 h. Después de la incubación, la expresión del ARNm y la metilación se cuantificó por cuantitativa en tiempo real PCR y ensayo TM EpiTYPER
, respectivamente.
Reportero ensayo
supresión construcciones en serie del promotor HS3ST2 fueron creados, y diferentes longitudes de las regiones promotoras (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) se amplificaron usando cebadores de PCR (Tabla S4) y se clonaron en el vector pGL3-basic. La secuencia promotora fue
in vitro
metilado por la específica de CpG
Sss
I metilasa (New England Biolabs, Ipswich, MA). Las actividades promotoras de construcciones metilados y no metilados se compararon mediante el ensayo de luciferasa dual (Promega, Madison, WI).
La migración celular, invasión y proliferación de ensayo
En
in vitro
migración celular, invasión, y los ensayos de proliferación, un pAcGFP1-C1-
HS3ST2
clon de ADNc se preparó usando los cebadores listados en la Tabla S3, y las células H460 y H23 se transfectaron con una g pAcGFP1-C1-
HS3ST2 Opiniones y pAcGFP1-C1 (vector vacío) utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, EE.UU.). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, la expresión HS3ST2 se confirmó por inmunotransferencia utilizando anticuerpos primarios dirigidos a GFP (sc-9996; Santa Cruz Biotechnology, CA) y α-tubulina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). La migración celular se ensayó por permitiendo que las células migren hacia abajo durante la noche a 37 ° C a través de un 8-m filtro de poro de inserción (BD, EE.UU.) y a continuación por tinción con 1% de cristal violeta; Se midieron las células disueltos en 564 nm en un lector de microplacas max VERSA
(Molecular Devices, USA). El ensayo de invasión se realizó mediante el recuento de Diff-Quick
TM (Sysmex, Japón) células teñidas en un inserto recubierto con Matrigel después de una incubación de 48 h. Para el ensayo de proliferación, los pocillos se sembraron con 1 x 10
se realizó 3 células por pocillo y un ensayo MTT cada 24 h; células proliferantes se midió por absorbancia a 570 nm.
Desmontables de HS3ST2
HS3ST2 específica pequeños ARN de interferencia (siRNA secuencia diana: Cat. 5 'CCCAGCTACTTTGTCACTCAA-3' Nº SI00442015, Qiagen) o un control negativo siRNA (art 10272810, Qiagen) se transfectó a las células NHBE. Después de 72 h de transfección, el silenciamiento de HS3ST2 fue confirmada por immonublotting utilizando anticuerpos primarios dirigidos a HS3ST2 (Cat. No. PA5-26522, Thermo Scientific) y se normalizaron con β-actina. El efecto de HS3ST2 caída sobre la migración celular, la invasión celular y la proliferación celular se analizó como se ha descrito anteriormente.
Quantitative PCR específica de metilación
estado de metilación de las islas CpG en la región promotora de
HS3ST2
en 26 tejidos tumorales fresco congelado se analizó cuantitativamente usando un ensayo de PCR basado en la fluorescencia cuantitativa en tiempo real, MethyLight, como se describe por Gonzalo et al [10]. Brevemente, las reacciones MethyLight se llevaron a cabo en un volumen final de 12,5 l que contenía 1,0 l de ADN tratado con bisulfito, 900 nM de cada cebador y sonda TaqMan 250 nM. reacciones de termociclado se llevaron a cabo utilizando un Sistema de 7300 PCR en tiempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA), y el
ALU-C4
gen se utilizó como referencia interna para normalizar la cantidad de ADN de entrada [18]. Los cebadores y sondas TaqMan marcados con fluorescencia utilizados en el presente estudio se presentan en la Tabla S5.
La inmunohistoquímica de Ki-67
El análisis inmunohistoquímico de Ki-67 se llevó a cabo como se describe anteriormente [19] . La fracción de células Ki-67-positivas (el índice de etiquetado Ki-67) se define como el porcentaje de núcleos teñidos positivamente con el anticuerpo.
El análisis estadístico
La prueba de suma de rangos de Wilcoxon ( o
t-test
) y la prueba exacta de Fisher (o la prueba de Chi-cuadrado) se utilizaron para el análisis univariado de las variables continuas y categóricas, respectivamente. los niveles de mRNA HS3ST2 entre los tejidos tumorales y tejidos normales emparejados se compararon mediante la prueba de rangos con signo de Wilcoxon. coeficiente de correlación de Spearman se calculó para la evaluación de la correlación entre la expresión y la metilación de
HS3ST2
. El efecto de
HS3ST2
hipermetilación en la supervivencia o la repetición se estimó mediante curvas de supervivencia de Kaplan-Meier y la significación de las diferencias en el pronóstico entre los grupos se evaluó mediante la prueba de log-rank. Cox de riesgos proporcionales de análisis se realizó para estimar los índices de riesgo de
HS3ST2
hipermetilación para la supervivencia, después de controlar los posibles factores de confusión.
Resultados
Análisis de la metilación del promotor de todo el HS3ST2
el estado de metilación de
HS3ST2
alrededor de la
HS3ST2
promotor se analizó el uso de MS-GRH (Figura 1B) y EpiTYPER
TM ensayos (Figura 1C) de cada seis líneas celulares de cáncer de pulmón y dos líneas de células epiteliales bronquiales normales. estado de metilación de una región de 2,0 kb que contiene la secuencia del promotor de
HS3ST2
se proyectó por primera vez por MS-GRH. Se observó notable disociación curva de fusión en seis fragmentos (HRM-04, 05, 06, 07, 08, y 09) entre las líneas celulares de cáncer de pulmón y líneas de células epiteliales bronquiales normales (Figura 1B). Debido a que la citosina metilada requiere una temperatura de fusión más alta que la citosina no metilada, las curvas de fusión de los fragmentos de metilados desplazan a la derecha en comparación con líneas de células normales. Para evaluar los estados de metilación de CpG individuales en la región promotora de 1,5 kb que incluye los seis fragmentos, se analizaron cuantitativamente los CpG individuales con el ensayo TM EpiTYPER
(Figura 1C). líneas de células normales se hypomethylated en las secuencias de 1,5 kb enteras, pero las líneas celulares de cáncer de pulmón por lo general se hypermethylated alrededor del sitio de inicio de la traducción ATG. Aunque algunos CpG en el lugar de inicio de la traducción ATG de
HS3ST2
fueron parcialmente metilado en H226 y H1650 células, la mayoría de los CpG eran altamente metilados en otras líneas celulares de cáncer de pulmón.
desmetilación inducida por 5-aza-DC y la re-expresión de los silenciados HS3ST2
Para investigar si la regulación a la baja de
HS3ST2
depende de la hipermetilación del gen, se analizó la re -expresión (Figura 1D) y desmetilación (Figura 1E) del silenciadas
HS3ST2 fotos: por QRT-PCR y ensayo TM EpiTYPER
después del tratamiento de las células de cáncer de pulmón con 10 M 5-aza-dC durante 72 h. HS3ST2 niveles de mRNA fueron sustancialmente más bajos en líneas celulares de cáncer de pulmón que los seis en dos líneas de células epiteliales bronquiales (barra negro; Figura 1D). Silenciado
HS3ST2
se re-expresa en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón después del tratamiento con 5-aza-DC (barra blanca; Figura 1D). El cambio en el nivel de metilación en respuesta a 5-aza-DC se analizó más a fondo en los CpG individuales alrededor de la zona altamente metilado ATG del
HS3ST2
gen (Figura 1E). Aunque el grado de desmetilación difería entre las líneas celulares, desmetilación se encontró en todas las líneas celulares después del tratamiento 5-Aza-dC. La desmetilación se produjo de forma más sustancial en H460 o células H1650, que eran menos densamente metilado, que en las células H23 densamente metilado. Estos hallazgos sugieren que
HS3ST2
hipermetilación puede estar asociada con la regulación negativa de la transcripción del gen.
HS3ST2
promotor de la actividad disminuyó con la metilación del promotor
La actividad del promotor se midió en células H23 (Figura 2A) y células HEK-293T (Figura 2B) mediante el ensayo de luciferasa Dual para determinar si
HS3ST2
metilación afecta a la transcripción de genes. Se produjeron cuatro construcciones (-984 ~ + 12, -742 ~ + 12, -495 ~ + 12, -245 ~ + 12) para cada uno secuencias promotoras metilados y no metilados. construcciones metilados de
HS3ST2
promotor se obtuvieron con SSS I metilasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) en presencia de S-adenosilmetionina. La actividad del promotor entre las construcciones no metilados de
HS3ST2
promotor no era proporcional a la longitud de cada construcción en las células, pero la actividad del promotor se redujo notablemente cuando se eliminaron las secuencias promotoras entre -742 pb y -495 pb. Para construcciones metilados, la actividad del promotor fue similar en todas las construcciones y sustancialmente bajo en comparación a la de las construcciones no metilados correspondiente. Esta observación sugiere que el promotor de núcleo comprende una región de ADN de -742 pb a través de -495 pb desde el sitio de iniciación de la transcripción.
Las actividades de luciferasa duales de cuatro HS3ST2 construcciones del promotor se midieron en H23 (A) y HEK- líneas celulares 293T (B). Una construcción de promotor kb fue suprimido en serie, y la actividad de la luciferasa de cada construcción se comparó entre los constructos tratados con (barra gris) y sin SSS I metilasa (barra de color negro).
HS3ST2 inhibe la migración celular, invasión y proliferación
Para investigar la función de
HS3ST2
en la tumorigénesis de pulmón, la migración celular, invasión y proliferación eran examinado en células de cáncer de pulmón H460 y H23.
HS3ST2
cDNA se clonó en pAcGFP-C1 y se transfectaron en células H460 y H23: datos de H23 células son en la Figura S1. La sobreexpresión de transfectada pAcGFP-C1-
HS3ST2
se controló mediante RT-PCR (Figura 3A), QRT-PCR (Figura 3B), y la inmunotransferencia (Figura 3C). La sobreexpresión de
HS3ST2
redujo significativamente la capacidad de migración de las células en un 53% (
P = 0,0017
Las figuras 3D y 3E). la actividad de la invasión de células se redujo en un 83% en células H460 transfectadas con pAcGFP-C1
HS3ST2 gratis (
P = 0,0019;
Figuras 3F y 3G); proliferación celular también disminuyó considerablemente con el tiempo (Figuras 3H & amp; 3I). Estas observaciones sugieren que
HS3ST2
puede inhibir la tumorigénesis de pulmón mediante la reducción de la migración celular, invasión, o la proliferación celular en el cáncer de pulmón.
(CA) pAcGFP-C1
HS3ST2
era transfectadas en células de cáncer de pulmón H460. sobreexpresión específica de
HS3ST2
en comparación con el vector vacío fue confirmada por RT-PCR (A), QRT-PCR (B), y el Western Blot (C). (DG) H460 células fueron sembradas en una cámara de Boyden con un vector vacío o con una g pAcGFP-C1
HS3ST2 Hoteles en Transwell migración (D & amp; E) y ensayos de invasión (F & amp; G) como se describe en los Materiales y Métodos. Stained migración de las células y las células invasoras se muestra en (D) y (F), respectivamente; células que migran se midieron mediante absorbancia a 564 nm; células invasoras se contaron bajo un microscopio. Los resultados se presentan en relación con el
en
in vitro
la migración o invasión de las células no inducidas H460 (100%). (H & amp; I) H460 células transfectadas con un vector vacío o pAcGFP-C1
HS3ST2
se cultivaron en un plato de 96 pozos para analizar el efecto de
HS3ST2
sobre el crecimiento celular. La proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT y la absorbancia se midió a 570 nm. Los datos se presentan como media ± error estándar (SE) de los experimentos por triplicado.
Desmontables de HS3ST2 aumento de la migración celular, invasión celular y la proliferación celular
Para confirmar los datos de HS3ST2 ectópico expresión, los efectos de
HS3ST2
caída sobre la migración celular, invasión y proliferación de las células se analizaron en células epiteliales bronquiales NHBE. Después de 72 horas de
HS3ST2
caída, el silenciamiento se confirmó mediante inmunotransferencia (Figura 4A). Desmontables de
HS3ST2
provocó un aumento de la proliferación celular (Figura 4B). La migración celular y la invasión también se incrementaron en un 45% y un 79% en las células silenciadas NHBE, respectivamente (Figuras 4C y 4D amp;).
(A) HS3ST2 siRNA se transfectó en las células NHBE, y desmontables mediada por siRNA se confirmó por Western blots. viabilidad (B) de la célula se midió mediante el ensayo de MTT determinado mediante la evaluación de la absorbancia del colorante convertido a una longitud de onda de 570 nm. (C & amp; D) El efecto de HS3ST2 caída sobre la migración celular (C) y la invasión (D) también se midió en las células NHBE. NC indica normal de control sin tratar.
Relación de las características clinicopatológicas con HS3ST2 hipermetilación
Antes de analizar el significado clínico-patológica de
HS3ST2
hipermetilación en el CPNM, la relación entre el
HS3ST2
hipermetilación y su expresión se analizó en los tejidos frescos congelados. Quantitative PCR en tiempo real se realizó en tumor fresco congelado y coincide tejidos normales de sólo 26 pacientes, debido a la pequeña cantidad de tejidos, y la PCR cuantitativa a metilación específica se llevó a cabo en los tejidos tumorales de los pacientes. los niveles de mRNA HS3ST2 fueron significativamente mayores en los tejidos normales que en los tejidos tumorales (prueba de
P = 0,0004
, los signos de Wilcoxon; Figura 5A), y no se observó correlación negativa entre la expresión y la metilación del
HS3ST2
de 26 tejidos tumorales (ρ = -0.51,
P = 0,009
, correlación de rangos de Spearnman; Figura 5B). El estado de metilación de
HS3ST2
se analizó en 298 tejidos embebidos en parafina fijados con formalina utilizando PCR específica de metilación (MSP) (Figura 5C). Las relaciones entre las características clinicopatológicas y
HS3ST2
hipermetilación se describen en la Tabla 1.
HS3ST2
hipermetilación se encontró en 95 (32%) de 298 pacientes.
HS3ST2
hipermetilación no se asoció con la edad del paciente (
P
= 0,12), el tamaño del tumor (
P
= 0,14), sexo (
P =
0,33), la histología (
P
= 0,12), la diferenciación (
P
= 0,31), el estadio patológico (
P
= 0,66), o la recurrencia del tumor (
P
= 0.20). Sin embargo,
HS3ST2
hipermetilación se asoció significativamente con paquetes-año de fumar (
P
= 0,01) y era más frecuente en los actuales fumadores que en los no fumadores (
P
= 0,002).
niveles (A) HS3ST2 ARNm se compararon cuantitativamente primera entre los 26 tejidos tumorales congeladas frescas y los correspondientes tejidos normales (con signo de Wilcoxon-rank test,
P = 0,0004
). Los datos se presentan como la media 2
-ΔC
valor T de experimentos por triplicado, y las barras representan desviaciones estándar. (B) Correlación negativa entre la expresión y la metilación niveles de
HS3ST2
se observó mediante análisis de correlación de Spearman en 26 tejidos tumorales (ρ = -0.51,
P
= 0,009). (C) La metilación del
HS3ST2
promotor se analizó en los tejidos incluidos en parafina de pacientes con NSCLC usando PCR específica de metilación (MSP). los números de identificación del paciente se indican. "M" y "U" representan la amplificación del alelo metilado y no metilado, respectivamente. "Pos" representa los controles positivos para los alelos metilados y no metilados. muestras de control negativo sin ADN se incluyeron para cada PCR. (D) Expresión de Ki-67 se analizó por análisis inmunohistoquímico. Las cifras muestran ejemplos representativos de la expresión positiva de Ki-67 en el adenocarcinoma (izquierda) y el carcinoma de células escamosas (derecha) (Ampliación: x 200). (E) Asociación de
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hipermetilación con Ki-67 índice de proliferación se evaluó en 298 NSCLC. Las barras de error representan el error estándar. "Adenoca" y "escamosas" indican el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas, respectivamente. "Met (+)" y "Met (-)" representan la presencia y ausencia de
HS3ST2
hipermetilación, respectivamente
HS3ST2
hipermetilación.
Categoría Subcategoría
No (N = 203)
Sí (N = 95)
P-valor
Edad
a62 ± 860 ± 110.12Pack años
a26 ± 2.432 ± 250.01Size (cm)
A3.9 ± ± 2.10.14SexWomen4526Men158690.33Smoking 1.94.3 statusNever7315Former3217Current98630.002HistologyAdeno
b7748Squamous
b10739Others1980.12Differentiation
cWell2517Moderately9537Poorly2918Undifferentiated720.31Pathologic stageI11858II5319III3017IV210.66RecurrenceNo11059Yes93360.20Table 1. Características clinicopatológicas (N = 298)
aMean ± estándar deviationbAdeno, adenocarcinoma.; , datos cDifferentiation escamosas carcinoma de células escamosas no están presentes en 68 casos CSV Descargar CSV
Para analizar la relación de
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hipermetilación de la proliferación celular, la expresión de Ki-67 fue evaluada por tinción inmunohistoquímica (Figura 5D). Se encontró que el índice de proliferación Ki-67 a ser significativamente diferente de acuerdo con el estado de metilación de
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(
P
= 0,02; figura 5E): el índice de proliferación media de Ki-67 fue del 29% y 22% en los tumores con y sin
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hipermetilación, respectivamente. La relación entre el índice de proliferación Ki-67 y
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hipermetilación también fue similar en el adenocarcinoma (
P
= 0,04) y el carcinoma de células escamosas (
P
= 0,009).
El análisis de supervivencia
supervivencia libre de recidiva (RFS) y la supervivencia global fueron comparados según el estado de metilación de
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través de la etapa del tumor. Para analizar el efecto de
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hipermetilación en el pronóstico del paciente, se estratificó de datos por el estadio del tumor, porque el estadio del tumor se asocia significativamente con la supervivencia de los pacientes en el CPNM.
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hipermetilación no se asoció con la SSR (datos no mostrados). Sin embargo, el efecto de
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hipermetilación en la supervivencia global mostró un patrón diferente de acuerdo con la participación de los ganglios linfáticos en 248 estadios I-II NSCLC. Por 193 ganglios negativos en estadio I-II NSCLC, la tasa de supervivencia a los 5 años fue del 59% y el 71% en pacientes con y sin
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hipermetilación, respectivamente (Figura 6A). Y, esta diferencia fue significativamente diferente (
P
= 0,04). Sin embargo, la supervivencia global no fue significativamente diferente entre los pacientes con y sin hipermetilación de
HS3ST2 Hoteles en 55 casos con ganglios positivos. (
P
= 0,69; Figura 6B) guía
En general la supervivencia se comparó acuerdo con el estado de metilación de
HS3ST2 Hoteles en fase 193 ganglios negativos I-II NSCLC (a) y en 55 etapas con ganglios positivos I-II NSCLC (B).
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hipermetilación en un grupo que no tienen implicación de los ganglios linfáticos mostró un efecto adverso significativo sobre la supervivencia global (
P
= 0,04).
Cox- El análisis de riesgos proporcionales
estratificado proporcional de Cox análisis de riesgos (Tabla 2) para 248 en estadio I-II se realizaron NSCLC al control de los posibles efectos de confusión de las variables, como la edad, el sexo, el tamaño del tumor, la terapia adyuvante, la recurrencia, y la diferenciación, y para calcular el índice de riesgo (HR). Los pacientes con
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hipermetilación en 193 NSCLC ganglios negativos tenían un 2,12 veces (intervalo de confianza del 95% [IC] = 1,25 - 3,58;
P
= 0,005) mayor riesgo de fracaso en comparación con aquellos sin
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hipermetilación. Sin embargo, la supervivencia global en pacientes con la implicación de los ganglios linfáticos no fue significativamente diferente de acuerdo con el estado de metilación de
HS3ST2 gratis (HR = 0,84; IC del 95% = 0,34 - 3,82;
P =
0,69).
HS3ST2
hipermetilación
HR
a
IC del 95%
a
P