Extracto
Antecedentes
Tanto los cánceres gástricos y colorrectales (CCR) están ocurriendo con mayor frecuencia neoplasias malignas en todo el mundo con la supervivencia global de estos pacientes sigue siendo insatisfecha. La identificación de los genes supresores de tumores (TSG) silenciadas por el promotor de la metilación CpG descubre mecanismos de tumorigénesis e identifica nuevos biomarcadores epigenéticos para la detección temprana del cáncer y la evaluación de pronóstico. funciones cistationina-beta-sintasa (CBS) en la vía de metabolismo del ácido fólico, el cual está íntimamente ligada a la metilación del ADN genómico. La desregulación de la metilación del ADN contribuye sustancialmente al desarrollo del cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
Para identificar potenciales ETG silenciados por la metilación aberrante promotor en el CCR, se analizaron los tejidos tumorales y adyacentes de los casos de CCR mediante el Illumina humana Methylation45 BeadChip. Se identificaron hipermetilación del
CBS
de genes en muestras de CRC, en comparación con los tejidos adyacentes. La metilación y la disminución de la expresión de ARNm de
CBS
se detectaron en la mayoría de las líneas celulares de CRC por PCR específica de metilación y RT-PCR semicuantitativa, así como en el cáncer gástrico. El tratamiento con 5-aza-2 'desoxicitidina y /o tricostatina A metilación inversa y restaurado
CBS
la expresión de ARNm que indica un efecto directo. metilación aberrante se detectó más en el 31% de CRCs primarios (29 de 96) y 55% de los tumores gástricos (11 de 20). En contraste, la metilación rara vez se encuentra en los tejidos normales adyacentes al tumor.
CBS
metilación se asoció con
KRAS
mutaciones en los CRC primarias (
P = 0,04
, por χ
2-test). Sin embargo, no se encontró asociación entre el
CBS
metilación o
KRAS
mutaciones con la recaída del cáncer /metástasis en pacientes en estadio II CRC.
Conclusión
Una novela la búsqueda de este estudio es que la enzima del metabolismo del folato
CBS
niveles de ARNm se downregulated con frecuencia a través de la metilación de CpG de la
CBS
gen en el cáncer gástrico y el CRC, lo que sugiere que
CBS
funciona como un gen supresor de tumor. Estos resultados justifican el estudio adicional de
CBS
como un biomarcador epigenético para el diagnóstico molecular de los cánceres gastrointestinales
Visto:. Zhao H, Li Q, J Wang, Su X, Ng KM, Qiu T, et al. (2012) Frecuente epigenética El silenciamiento del gen de folato que metabolizan los
cistationina-beta-sintasa Hoteles en cáncer gastrointestinal. PLoS ONE 7 (11): e49683. doi: 10.1371 /journal.pone.0049683
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 27 Julio, 2012; Aceptado: 11 Octubre 2012; Publicado: 13 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30.801.344), el programa Nova Pekín (núm 2009A70) y el programa Laboratorio Estatal (Nº 2060204). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tanto los cánceres gástricos y colorrectales son una patología de gran frecuencia en todo el mundo cuya incidencia ha aumentado en los últimos años [1], [2]. A pesar de las diversas modalidades de tratamiento novedosas, incluyendo quirúrgica, médica y radiológica, se han introducido, el curso clínico de cáncer gástrico y colorrectal (CCR) es variable y el pronóstico general sigue siendo insatisfactoria. Por lo tanto, la identificación de genes clave implicados en la patogénesis molecular de cáncer gástrico y el CRC es probable que resulte en nuevos y más eficaces estrategias terapéuticas.
La inactivación de múltiples genes supresores de tumores (TSG) es un evento clave en la molecular multi-paso patogénesis genética de CRC [3]. Además de los cambios genéticos, la inactivación epigenética de ETG juega un papel importante en la carcinogénesis [4]. silenciamiento epigenético través de la metilación aberrante de islas CpG (CGI) en regiones promotoras TSG se produce en casi todos los tipos de tumores [4]. En particular, una lista creciente de aberrantemente metilados ETG se ha informado en los CRC, incluyendo
APC
,
MGMT
,
MLH1
,
p16
INK4A
,
BVS
,
RASSF1A
,
HIC1
,
CHFR
,
ADAMTS18
,
PCDH10 Opiniones y
DLEC1
[5] - [10], así como en el cáncer gástrico [11], [12]
en el presente estudio, se hacen pruebas de las ETG silenciados por la metilación aberrante promotor en el CCR. y se encontró hipermetilación del gen
cistationina-beta-sintasa gratis (
CBS
) que codifica para una enzima clave en el metabolismo del folato [13], [14]. El trabajo reciente se ha centrado en las enzimas implicadas en el metabolismo del folato, ya que la metilación del ADN es dependiente de estas vías [15] - [19]. La inestabilidad genética con desequilibrios cromosómicos característicos es un rasgo característico de la carcinogénesis. La homocisteína y ácido fólico está relacionada con el metabolismo de la integridad del ADN, y las variantes genéticas que influyen funcionalmente homocisteína y el metabolismo del folato están asociadas con diferentes tipos de cáncer como el CRC, el linfoma no Hodgkin, etc [20], [21]. El objetivo del presente trabajo fue examinar si
CBS
era un nuevo TSG potencial y para poner a prueba si
CBS
expresión de ARNm se downregulated por el promotor hipermetilación en el CCR, así como en el cáncer gástrico. También se investigó el papel potencial de
CBS
hipermetilación de genes como un biomarcador para predecir la recaída del tumor o metástasis en la etapa II (T
3 N
0M
0) pacientes con CCR.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de Helsinki para los estudios de sujetos humanos y fue aprobado por el Comité de Ética del hospital del cáncer, Academia china de Medicina Ciencias (CAMS), Beijing, China. firmado el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en el estudio para la recogida y análisis de muestras.
Líneas Celulares
Cuatro CRC (HCT116, HT29, LoVo y SW480) y 16 de cáncer gástrico (Kato III, YCC1, YCC2, YCC3, YCC6, YCC7, YCC9, YCC10, YCC11, YCC16, SNU719, AGS, MKN28, MKN45, snu1 y SNU16) se utilizaron las líneas celulares [10]. Las líneas celulares se mantuvieron rutinariamente en medio RPMI-1640 con 10% de FBS. La línea celular HCT116 con knockout genético de ADN genes metil-transferasa
DNMT1
y
DNMT3B gratis (doble knockout, HCT116
DKO) fue un regalo del doctor Bert Vogelstein, Johns Hopkins University [22] y se cultivaron en presencia de 0,4 mg /ml genecitin o 0,05 mg /ml de higromicina.
las muestras tumorales
Todas las muestras primarias que incluyen cuatro emparejados fresca CRC y los tejidos normales, 96 de formalina primaria parafina fija incrustados tejidos (FFPE) CRC y 20 FFPE cáncer gástrico de los tejidos, se obtuvieron del Departamento de Patología, hospital del cáncer, CAMS, Beijing, china. Además, para el estudio de metilación, se analizaron márgenes libres de tumor correspondientes de 20 cáncer gástrico y 17 pacientes de CRC. Todos los pacientes no se sometieron a quimioterapia o radioterapia previa, ya que presentan con tumores resecables. especímenes frescos se congelaron en N líquido
2, y posteriormente se almacena a -80 ° C hasta su procesamiento. El diagnóstico se confirmó mediante hematoxilina y eosina (HE) -staining y se realizó el análisis histopatológico para definir las regiones representativas de tumores. La información clínica estaba disponible para todos los pacientes con CRC, incluyendo los datos de seguimiento de género, la edad, la diferenciación y. La edad media de los pacientes con CCR fue de 68 años (rango 37-93), y la razón hombre-mujer era 1.4:1 (56:40). El número de casos así, moderados y pobres-diferenciación fue de 14, 56 y 26, respectivamente. Estadificación del cáncer (pTNM) se define de acuerdo a la 7
ª edición del American Joint Committee del cáncer [23]. Todos los pacientes de CRC son en la etapa II (pT
3 N
0M
0).
ADN y ARN Extracción
Total RNA y DNA se extrajeron de las líneas celulares utilizando el Reactivo TRI (Molecular Research Centre). Para los tejidos tumorales recientes, se obtuvieron secciones congeladas y revisados para asegurarse de que el contenido del tumor fue de más del 80% del área de la sección. Se extrajo ADN de tejidos frescos y muestras FFPE utilizando el kit QIAamp® ADN Mini (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
farmacológica desmetilación
Dos líneas celulares de cáncer gástrico (YCC10 y SNU719) y uno CRC línea (HCT116) celular con silenciada
CBS
fueron tratados con 5 M de 5-aza-2'- desoxicitidina (aZA) (Sigma) durante tres días y siguió con 100 nM tricostatina a (TSA, Cayman) por un día como se describe anteriormente [24]. Después del tratamiento, el ADN total y se extrajo el ARN.
metilación del ADN Análisis
Todas las muestras de ADN fueron sometidas a modificación con bisulfito usando el EZ metilación del ADN Kit (Zymo Research) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una g de ADN genómico de cada muestra fue de bisulfito convertido y se eluyó en tampón de elución 18 l, y 5 l de cada muestra se analizó con el ensayo de la metilación del ADN Infinium Illumina usando el Methylation45 BeadChip Humano (Infinium metilación 450 K, Illumina), que es un ensayo específico de alelo con 480.000 CpG loci que cubren todo el genoma [25]. Los protocolos y la información de la sonda están disponibles en www.illumina.com. Se compilaron Los resultados del ensayo de metilación del ADN para cada locus utilizando el software Illumina Bead Studio (Illumina) y se informan como valores beta (beta), que son las puntuaciones de metilación del ADN que van de 0 a 1, lo que refleja el nivel de metilación del ADN fraccionada de una sola CpG sitio [25].
semi-cuantitativa de PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
RT-PCR se realizó como se describió anteriormente [9], utilizando
GAPDH como
controlar. Los cebadores para la
CBS
se enumeran en la Tabla 1. El programa de PCR utilizado una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, 35 ciclos (94ºC durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s), y un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
KRAS Mutation Detection
por PCR en tiempo real
Los siete mutaciones de punto de acceso dentro de codones 12 y 13 del
KRAS
gen fueron examinadas usando el humano
KRAS
kit de detección cualitativa mutación (ACCB Biotech Ltd.). Las sondas fluorescentes se han diseñado específicamente para detectar mutaciones puntuales diferentes 7 (G12V /S /R /D /A /C y G13D). El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante usando el sistema de PCR en tiempo real MX3000P (Stratagene). Presencia o ausencia de mutaciones se evaluó cualitativamente de la curva de amplificación de fluorescencia.
Tratamiento y bisulfito metilación específica de PCR (MSP) Análisis
bisulfito de modificación de ADN se llevó a cabo como se describió anteriormente utilizando 2.4M metabisulfito de sodio [26]. MSP se realizó como [9] se describe anteriormente. cebadores MSP se enumeran en la Tabla 1. MSP cebador de PCR especificidad se confirmó, ya que no amplifican moldes de ADN genómico no bisulfito tratados. Los productos MSP de muestras seleccionadas fueron confirmadas por secuenciación directa.
Análisis estadístico
χ
2 pruebas se utilizaron para analizar las posibles correlaciones entre los parámetros clínicos,
KRAS mutación
y
CBS
estado de metilación de las muestras tumorales. Todos los análisis se realizaron con SPSS para Windows.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Identificación de
CBS
como hypermethylated gen en el CCR
analizada tumor y los tejidos adyacentes de cuatro casos de CCR chinos utilizando matriz metilación Illumina que detectan 480.000 CpG
loci
que cubre todo el genoma. Entre todos los sitios CpG que fueron hypermethylated en muestras de tumores (datos no mostrados), cuatro sitios CpG ubicados estaban en el
CBS
gen (Figura 1A). El análisis de la secuencia genómica de la
CBS
de genes, reveló que su promotor putativo, el exón 1 y el intrón 1 era un CGI típica y por lo tanto susceptible de silenciamiento epigenético (Figura 1A) [27].
Un
, diagrama esquemático de la
CBS
promotor isla CpG (CGI), con el exón 1 (rectángulo negro), los sitios CpG (líneas verticales cortas), se muestra la región MSP. El sitio de inicio de la transcripción se indica mediante una flecha curva. Los cuatro sitios CpG localizadas en el
CBS
región del gen identificado por matriz de metilación Illumina que se hypermethylated significativamente en el tumor en comparación con los tejidos no tumorales (CT /CN) se muestran.
B Opiniones, Expresión de
CBS
es fácilmente detectado en los tejidos normales.
C
, Expresión y metilación de
CBS Hoteles en líneas celulares de cáncer fueron examinados por RT-PCR y MSP, con
GAPDH
como control. M, metilado, U, no metilado.
El silenciamiento frecuente de
CBS fotos: por la metilación del promotor de múltiples CRC y el cáncer gástrico Líneas Celulares
Antes,
CBS
se ha demostrado que se expresa fuertemente en el cerebro, así como el hígado, el páncreas, los riñones y tejidos fetales [13]. Para examinar aún más la correlación entre la
CBS
metilación y la expresión de ARNm, lo primero que investigó un grupo de tejidos humanos normales por RT-PCR semicuantitativa. Nuestros resultados mostraron que
CBS
se expresó en todos los tejidos normales como el de colon, el recto y el estómago, aunque a diferentes niveles de expresión. El nivel de expresión más alta se encontró en el páncreas y el sistema respiratorio tejidos (laringe, tráquea y pulmón) mientras que la baja expresión se vio en el tejido de la médula ósea (Figura 1B).
Para contrastar
CBS
expresión en condiciones normales tejidos a células malignas, se analizaron líneas celulares de tumores gastrointestinales. RT-PCR semicuantitativa mostró que
CBS
expresión fue disminuida o silenciados en el 56,3% (9/16) de cáncer gástrico y el 75,0% (3/4) de las líneas celulares de CRC (Figura 1C).
CBS
estado de metilación también fue analizado por MSP en estas líneas celulares. Se encontró que las líneas celulares con reducida o silenciados
CBS
expresión se había metilado promotores, mientras que no se encontró en la metilación de la normal
CBS
líneas celulares de expresión (Figura 2B) lo que indica que
CBS
promotor de la metilación es un mecanismo importante para el silenciamiento transcripcional de este gen en la mayoría de las líneas celulares de cáncer gástrico CRC y examinados.
un
, farmacológica o genética utilizando desmetilación Aza con TSA induce
CBS
expresión en líneas celulares metilados y silenciados. A + T: Aza y el tratamiento de la TSA.
B Opiniones, resultados Representante MSP de
CBS
metilación en cáncer primario gástrico (CG) y el cáncer colorrectal (CCR). T: MSP para el promotor metilado, M:. MSP para el promotor metilado
Restauración de
CBS
Expresión genética y farmacológica por desmetilación
Para determinar si la metilación media directamente la disminución de
CBS
la expresión de ARNm, una metilado CRC (HCT116) y dos líneas celulares de cáncer gástrico metilados (YCC10 y SNU719) fueron tratados con Aza, un inhibidor de la ADN metiltransferasa, y TSA. Después del tratamiento,
CBS
expresión fue restaurado en líneas celulares metilados, junto con un aumento marcado de los alelos metilados promotor (Figura 2A). También se encontró que
CBS
podría reactivarse en el HCT116
línea celular DKO CRC que se demethylated genéticamente a través de la doble knockout tanto DNMT1 y DNMT3B. Al mismo tiempo, no metilado
se detectaron CBS
alelos en Aza-tratada y HCT116
DKO células, lo que indica que la metilación del
CBS
promotor conduce directamente a su silenciamiento en el CRC y el cáncer gástrico.
frecuente
CBS
metilación en el CCR primaria y tumores gástricos
además, investigó la presencia de
CBS
promotor de metilación en 96 CRC primaria y 20 muestras de cáncer gástrico utilizando el análisis de MSP.
se detectó CBS
promotor de la metilación en el 30% de CRC (29/96) y el 55% de los tumores gástricos (11 de 20), pero se encontró con poca frecuencia en gástrica normal (1/20, 5%) o el colon tejido (0/17, 0%) muestras (Figura 2B). No hubo asociación significativa de
CBS
metilación con el género, la edad o la diferenciación del tumor en pacientes con CCR (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la hipermetilación del
CBS
promotor es un evento común en el CRC y el cáncer gástrico.
Correlación de
CBS
metilación y
KRAS Mutación
los tumores en la primaria CRC
mutaciones comunes de los codones 12 y 13 en el exón 2 de la
KRAS
gen se examinaron en el 96 CRC primaria, donde
CBS
estado de metilación fue previamente analizadas (Tabla 2).
se detectó KRAS
mutación en el 45% (13/29) de
CBS
-methylated y el 24% (16/67) de
CBS
CRC primarias -unmethylated que indican una correlación positiva entre el
CBS
metilación y
KRAS
mutaciones (
P Hotel & lt; 0,05). Un análisis posterior mostró ninguna correlación de
CBS
metilación y
KRAS mutación
con la recaída del cáncer /metástasis en pacientes en estadio II CRC (Tabla 2).
Discusión
para nuestro conocimiento, este es el primer informe para identificar los
CBS
como candidato metilado TSG en los cánceres gastrointestinales. Hemos demostrado que
CBS
la expresión del ARNm estuvo ausente en varias líneas celulares de cáncer colorrectal y gástrico debido a la metilación del promotor. Por otra parte, el
CBS
gen fue frecuentemente metilado en el CCR y los pacientes con cáncer gástrico, lo que sugiere que
CBS
actúa como una ETG en el CCR y el cáncer gástrico siendo frecuentemente inactivado por metilación.
El gen
CBS
, situado en el cromosoma 21q22.3, codifica una importante enzima implicada en la transulfuración de la homocisteína producida durante el metabolismo metil-grupo [27]. En particular,
CBS
causas de deficiencia de aumento de los niveles de metionina en plasma y la disminución de los niveles de cisteína [14], [28] que a su vez se sabe que se correlacionan con homocistinuria, enfermedad cardiovascular y el carcinoma hepatocelular [14], [21]. La vía de transulfuración vincula el metabolismo de la metionina a la biosíntesis de moléculas redox de control de celulares, tales como cisteína, glutatión, y taurina [18]. La cisteína generado a través de la vía de transulfuración determina los niveles de moléculas redox de control de celulares, tales como células de glutatión y taurina protección contra las especies inducida reactiva daños [29] de ADN a través de la base y del azúcar modificaciones, sitios de base libre, entrecruzamientos de ADN-proteína, y hebra se rompe [30], [31]. Por lo tanto, regulados a la baja expresión de
CBS
puede afectar a la producción de glutatión facilitando así la tumorigénesis [16]. Además, el desequilibrio redox estimula vías que conducen a la inhibición de la apoptosis y que resulta en la muerte celular necrótica de la proteína quinasa y poli- (ADP ribosilación), seguido de las respuestas inflamatorias y el desarrollo de tumores [32]. Hay algunos estudios que han evaluado la asociación entre la susceptibilidad del tumor maligno y polimorfismos del
CBS
gen (844ins68) en el CCR [19], [33] pero no en esófago o cáncer gástrico [15]. Además,
CBS
844ins68 se asocia con una disminución de la supervivencia en la cabeza y el cuello escamoso cáncer de células [34].
Por otra parte, la pérdida de
CBS
expresión podría conducir a la acumulación de homocisteína, que se recicla a la metionina por la metionina systhase través de la vía remetilación [14]. Como metionina actúa como la fuente de donante de grupos metilo para la metilación del ADN, su aumento causado por la pérdida de
CBS
expresión puede dysregulate metilación del ADN. Nuestros resultados revelaron metilación frecuente de
CBS Hoteles en líneas celulares de cáncer gastrointestinal y tumores primarios. Por lo tanto, la supresión de
CBS
por la metilación del promotor, en lugar de alteraciones genéticas, también daría lugar a una perturbación del metabolismo de metil-grupo y contribuir al desarrollo del cáncer con un mayor daño en el ADN por el estrés oxidativo, deteriorando la capacidad antioxidante, y dysregulating la metilación del ADN. Sin embargo,
CBS
metilación no se asoció con recurrencia en nuestra cohorte de pacientes con estadio II CRC. Sugerimos que las cohortes más grandes de pacientes son necesarios para estudiar esta asociación potencial con la suficiente potencia estadística.
El valor pronóstico de
KRAS
mutaciones en pacientes con CCR sigue siendo controvertido. Un estudio realizado por Roth
et al.
Sugirió que el valor pronóstico de
KRAS
estado de mutación para la SLP y la SG era deficiente en pacientes con estadio II y III resecado el cáncer de colon [35]. Sin embargo, se ha informado de que los pacientes en estadio III que tiene
KRAS
mutaciones que se muestra la supervivencia libre de enfermedad significativamente peor en comparación con los que tienen de tipo salvaje
KRAS
[36]. Más importante aún, pocos estudios se han diferenciado
KRAS
mutaciones en el codón 12 de los que en el codón 13 con respecto a las características clinicopatológicas y la supervivencia [37] - [40]. En este estudio, no hemos podido identificar
KRAS
estado de la mutación como un factor pronóstico de recidiva o metástasis en pacientes con estadio II resecado CRC. En lugar de ello, encontramos que
CBS
metilación se asoció significativamente con
KRAS
mutaciones. Esta característica está en línea con un informe anterior muestra que el fenotipo isla CpG methylator (CIMP) está asociada con
KRAS
mutaciones [41].
En resumen, el hallazgo relevante de este estudio es que
CBS
es suprimida por metilación en el promotor colorrectal y cáncer gástrico. Se encontró que el silenciamiento de la metilación mediada por
CBS
podría invertirse por desmetilación genético o farmacológico, lo que sugiere que
CBS
funciona como un supresor de tumores en estos tipos de cáncer. La desregulación de los
CBS
y su asociación con un fenotipo tumor maligno es potencialmente asociados con el papel crucial de la CBS en el metabolismo de la metionina y el mantenimiento de la homeostasis redox intracelular. Nuestro estudio merece mayor análisis de los
CBS
como un biomarcador epigenético para el diagnóstico molecular de la CRC y el cáncer gástrico.
Reconocimientos
Agradecemos a los profesores Qian Tao y Wang Jing de utilidad comentarios y apoyo técnico, y los doctores Sergio Rey y Yuan Qiao para la edición crítica de este manuscrito. También agradecemos al Dr. Bert Vogelstein para la línea celular HCT116
DKO y el Dr. Keith Robertson para las muestras de ADN de algunas líneas celulares de CRC.