Extracto
Gene
MAGEA1
pertenece a un grupo de genes de la línea germinal específica humanos que se basan en la metilación del ADN para la represión en los tejidos somáticos. Muchos de estos genes, denominados genes de cáncer de la línea germinal (CG), se convierten en desmetilado y activado en una amplia variedad de tumores, en los que codifican antígenos específicos de tumores. El proceso que conduce a la desmetilación del ADN de los genes en los tumores CG sigue siendo poco clara. Los datos previos sugirieron que la acetilación de histonas podría estar involucrado. A continuación, se determinó la contribución relativa de la metilación del ADN y la acetilación de histonas en la regulación epigenética de genes
MAGEA1
. Se demuestra que
MAGEA1
hipometilación del ADN en la expresión de las células del melanoma se correlacionó con un aumento local de la acetilación de la histona H3 (H3ac). Sin embargo, cuando
MAGEA1
células gramnegativas fueron expuestos a un inhibidor de la histona deacetilasa (TSA), sólo observamos la activación a corto plazo del gen y no detectó ningún desmetilación de su promotor. Como un ensayo más sensible, se utilizó un clon de célula que alberga un metilado
MAGEA1 /HPH
construir, que confiere resistencia a la higromicina en la re-activación estable. TSA induce transitoria única de la represión del transgén, y no dio lugar a la aparición de células resistentes a higromicina. En marcado contraste, el agotamiento transitoria de DNA-metiltransferasa-1 en el clon de células reportero dio lugar a una población resistente a la higromicina, en el que el re-activa
MAGEA1 /hph
transgén no sólo muestran marcada hipometilación del ADN, pero también significativa inversión de marcas de histona, incluyendo las ganancias en H3ac y H3K4me2, y las pérdidas de H3K9me2. En conjunto, nuestros resultados indican que la metilación del ADN tiene un papel dominante en la jerarquía de gobierno epigenética
MAGEA1
expresión
Visto:. Cannuyer J, Loriot A, Parvizi GK, De Smet C (2013) epigenética jerarquía dentro de la
MAGEA1
Cancer gene-línea germinal: Promotor de la metilación del ADN dictados local modificaciones de las histonas. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10.1371 /journal.pone.0058743
Editor: Wei-Guo Zhu, la Universidad de Pekín Centro de Ciencias de la Salud, China
Recibido: noviembre 30, 2012; Aceptado: 5 Febrero 2013; Publicado: 5 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Cannuyer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. JC es el receptor de una subvención FSR-FNRS-Télévie (http://www2.frs-fnrs.be/). GKP recibió una beca del FSR-FNRS-fria (http://www2.frs-fnrs.be/). Este trabajo fue apoyado por una beca FRSM del FSR-FNRS (ref. 3.4563.11, http://www2.frs-fnrs.be/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metilación del ADN, que ocurre principalmente en dinucleótidos CpG, es un potente mecanismo de la represión de genes en células de mamíferos [1]. patrones específicos de tejido de metilación de CpG, que se establecen durante el desarrollo embrionario, en general están bien conservados en células adultas, pero se vuelven profundamente alterada en las células del cáncer [2]. Ambos ganancias (hipermetilación) y pérdidas (hipometilación) de la metilación del ADN se pueden detectar dentro de la misma célula tumoral. hipermetilación aberrante en el cáncer a menudo afecta a la promotora de los genes supresores de tumores, y por lo tanto se ha asociado con la pérdida de las funciones supresoras de tumores [3]. hipometilación del ADN, por otra parte, se ha detectado en una variedad de secuencias dentro de los genomas de cáncer, incluyendo secuencias repetitivas [4], y fue demostrado que contribuyen a la mejora de la inestabilidad genómica [5]. Sorprendentemente, la hipometilación del ADN en los tumores se ha asociado con la activación transcripcional de sólo un número limitado de genes, la mayoría de las cuales tienen su sitio normal de expresión restringido a la línea germinal [6]. (CG) genes de este grupo particular de genes que se denominó el cáncer germinal [7]. En humanos, los genes CG comprenden alrededor de 50 genes o familias de genes que ejercen una variedad de funciones celulares [8]. La activación de estos genes se ha informado en una amplia gama de tipos de tumores, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, y el melanoma. Una consecuencia importante de la activación de genes CG en tumores es la producción de antígenos específicos de tumores, que pueden ser reconocidos por linfocitos T citolíticos [9]. Los ensayos clínicos de la vacunación contra el cáncer dirigidos contra dichos antígenos están en marcha [10]. Posiblemente, la comprensión de los mecanismos que contribuyen a la regulación de genes CG puede facilitar el desarrollo de estrategias de inducción de genes, que harían que las células tumorales sean más vulnerables a la inmunoterapia.
El proceso que conduce a la hipometilación del ADN y la posterior activación de los genes en los tumores CG sigue siendo poco clara [11]. Una posibilidad es que la desmetilación del ADN en los genes CG es una consecuencia de alteraciones en el nivel de las proteínas histonas, los componentes básicos de la cromatina. Los residuos específicos dentro de colas de las histonas se someten a una variedad de modificaciones químicas, incluyendo acetilación y metilación, que tienen un impacto en la estructura de la cromatina y la transcripción [12]. Varias modificaciones de las histonas también parecen regular los estados de metilación del ADN [13]. marcas de histona represivas, tales como la metilación de la lisina de la histona H3 9 o 27 (H3K9 o H3K27), se muestran a dictar la deposición de la metilación del ADN en loci específicos, favoreciendo el reclutamiento local de las metiltransferasas de ADN [14], [15]. Por otra parte, la activación de modificaciones de las histonas tales como la acetilación de histonas o la metilación de la lisina de la histona H3 4 (H3K4) parecen excluir la maquinaria de metilación del ADN [16], [17]. Por lo tanto, era tentador proponer que la desmetilación del ADN en los genes CG podría ser una consecuencia de alteraciones en el nivel de modificaciones de las histonas.
Estudios previos revelaron que los promotores de genes CG se asocian a menudo con H3K9 y H3K27 metilación en la no las células que expresan. Estas modificaciones represivas generalmente se perdieron después de la activación de genes CG en las células tumorales, y se sustituyen por las marcas de histona activos, tales como la acetilación de histonas y H3K4 metilación [18], [19]. Una cuestión crucial es si los cambios en el nivel de modificaciones de las histonas son una causa o una consecuencia de CG promotor del gen de la desmetilación del ADN en las células tumorales. Los estudios que utilizan inhibidores de H3K9 y H3K27 metiltransferasas mostraron que se trataba de su propia incapaz de inducir significativa desmetilación del ADN y la activación de los genes CG [18], [19]. Resultados similares fueron obtenidos como consecuencia de la inhibición de la desmetilasas H3K4 [19]. Por el contrario, varios estudios informaron que la expresión de genes CG podría ser inducida en las células tratadas con un inhibidor de histona desacetilasas [20] - [22]. En un informe [20], pero no en los otros, fue el tratamiento demostrado que induce la desmetilación del ADN de un promotor del gen de CG. Estas observaciones planteadas por lo tanto la posibilidad de que gana en la acetilación de histonas pueden ser un disparador suficiente para inducir la desmetilación del ADN y la activación de genes en las células tumorales CG
.
En el presente estudio, se evaluó el potencial de acetilación de histonas para inducir DNA desmetilación y la activación del gen
MAGEA1
, un miembro bien caracterizado del grupo CG de los genes. Esto se evaluó mediante el ensayo el efecto de la tricostatina A (TSA), un inhibidor de la histona desacetilasa, en células que no expresan de melanoma y en un clon de célula que alberga un metilado
MAGEA1 /hph
construir, que permite la selección (resistencia a la higromicina ) de las células donde se produjo la activación del transgén. Además, se utilizó este sistema de células reportero sensible en un experimento inverso, en el que se evaluó la capacidad de un inhibidor de la metilación del ADN para inducir cambios de marcas de histona dentro de la
MAGEA1
promotor.
resultados
cambios histonas asociadas con
MAGEA1
la activación de líneas celulares de melanoma
con el fin de identificar los cambios de modificación de las histonas asociadas con
MAGEA1
de activarlo, se llevó a cabo la cromatina inmunoprecipitación (chip) en experimentos que no expresa y líneas celulares que expresan. Los experimentos se realizaron en inmortalizada fibroblastos de prepucio humano (HFF2-hTERT) y dos líneas celulares de melanoma que no expresan
MAGEA1
(SK-MEL-23 y EB16-MEL), así como en tres líneas celulares de melanoma que no expresar
MAGEA1 gratis (MZ2-MEL3.1, BB74-MEL y Mi13443-MEL). Como era de esperar, la evaluación de
MAGEA1
los niveles de metilación de ADN promotora por cuantitativa MS-PCR en estas líneas celulares, demostró altos niveles de metilación en la metilación que no expresan las células, y bajo en las células que expresan (Fig. 1A). chip experimentos, el examen de la
MAGEA1
región 5 ', revelaron el enriquecimiento preferencial de H3K9 dimethylated (H3K9me2) en
MAGEA1
-negativo frente a
MAGEA1
líneas de células positivas a (Fig . 1B). En contraste, la acetilación de la histona H3 (H3ac) y dimethylation de H3K4 (H3K4me2) dentro de la
MAGEA1
región 5 'mostró un marcado aumento en las tres líneas celulares que expresan, en comparación con las células no expresan (Fig. 1B). enriquecimiento significativo de H3K27 trimetilada (H3K27me3) dentro de la
MAGEA1
región 5 'se observó en las células HFF2-hTERT, pero no en ninguna de las otras líneas celulares. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la desmetilación del ADN y la activación de
MAGEA1
en células de melanoma se asocia con la pérdida de H3K9me2, y las ganancias de H3ac y H3K4me2 dentro de la región 5 'del gen. Esto fue consistente con un posible papel de la acetilación de histonas en la activación epigenética de
MAGEA1
en las células tumorales.
Un
,
MAGEA1
los niveles de expresión de ARNm (panel superior) y los niveles de metilación de ADN región 5 '(panel inferior) se evaluaron en tres líneas celulares que expresan los no (HFF2-hTERT, SK-MEL-23 y EB16-MEL), así como en las tres líneas celulares que expresan (MZ2 -MEL3.1, BB74-MEL y Mi13443-MEL). Los valores representan la media (± SEM) de dos experimentos QRT-PCR o SGC-PCR independientes, cada uno por duplicado.
B Opiniones, PCR cuantitativa chip-se aplicó a las mismas líneas celulares para evaluar el enriquecimiento de las modificaciones de las histonas que se indican en el directorio
MAGEA1
región 5 'o el
GAPDH
promotor (que representa un promotor ubicuo activo). Los datos se derivan a partir de al menos dos experimentos independientes chip, con dos medidas duplicadas qPCR en cada caso.
TSA induce la activación transitoria de
MAGEA1 Hoteles en células de melanoma
para evaluar la contribución de la acetilación de histonas en la regulación epigenética de
MAGEA1
, hemos expuesto las líneas celulares SK-MEL-23 y EB16-MEL a la histona deacetilasa (HDAC) TSA, y examinó su efecto sobre la transcripción y niveles de metilación del ADN del gen. En SK-MEL-23 células, la exposición a TSA se asoció con un aumento de 3,3 veces en
MAGEA1
nivel de ARNm, cuando se evaluó un día después del tratamiento. Sin embargo, este efecto se perdió en los días 4 y 7 después del tratamiento (Fig. 2A). En EB16-MEL, no hemos podido detectar ninguna activación significativa de
MAGEA1
después de la TSA (Fig. 2A), que era consistente con los datos anteriores que muestran que el efecto de la TSA en
MAGEA1
activación es célula de tipo dependiente [22]. Para la comparación, ambas líneas celulares se trataron con el inhibidor de la metilación del ADN 5-aza-2 'desoxicitidina (5-azadC). Debido a que este fármaco induce la desmetilación del ADN dependiente de la replicación, el tratamiento se mantuvo durante cuatro días antes de su análisis. Cuantitativos RT-PCR experimentos revelaron que 5-azadC (1 M) indujo significativa
MAGEA1
expresión en ambas líneas celulares. En SK-MEL-23 células, el nivel de
MAGEA1
mRNA observó después de 4 días de tratamiento con 5-azadC era 135 veces mayor que la observada después de un día de tratamiento TSA. Por otra parte, en ambas líneas celulares, la activación inducida por 5-azadC de
MAGEA1
se detecta aún en los días 3 y 6 después de la retirada del fármaco (Fig. 2B).
SK-MEL líneas celulares de -23 y EB16-MEL fueron expuestas a 300 nM TSA durante 24h (
a
), o 1 M 5-azadC durante 96 horas (
B
), y el ARN se extrajo a partir de las células en los días 1, 4 y 7 después del tratamiento TSA o en los días 4, 7, 10 después de 5-azadC tratamiento.
MAGEA1
niveles de expresión se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa. Valores, que se derivan de tres experimentos independientes, se normalizaron por el
ACTINB
nivel de expresión, y se expresan con respecto a los niveles encontrados en las células no tratadas (CTRL). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001.
C
, el efecto de TSA y 5-azadC en
MAGEA1
región 5 'desmetilación del ADN se evaluó mediante la aplicación de MS-PCR para muestras de ADN extraído 10 días después del comienzo de los tratamientos. Datos (desmetilación veces) corresponden a la cantidad relativa de secuencias no metiladas en las células tratadas reportados a la de las células no tratadas (CTRL). Los valores representan la media (± SEM) de tres experimentos SGC-PCR independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01
De acuerdo con nuestros estudios de expresión, cuantitativos resultados MS-PCR reveló que la TSA no indujo disminución significativa en el
MAGEA1
nivel de metilación del promotor, ya sea en SK-MEL-23 o líneas celulares EB16-MEL (Fig. 2C). desmetilación significativa de la
MAGEA1
promotor se observó lugar en ambas líneas celulares después de tratamiento con 5-azadC (Fig. 2C).
En conjunto, estos resultados sugieren que mientras que la TSA puede inducir transitoria de la represión de
Hoteles en MAGEA1 inicialmente no expresan las células, que no conduce a la desmetilación del ADN y largo plazo activación de la transcripción del gen.
modificaciones de las histonas asociadas con un
in vitro
metilado
MAGEA1
transgén
Nuestra incapacidad para detectar la TSA inducida por desmetilación y largo plazo activación del gen
MAGEA1
, como se informó aquí anteriormente, podría ser debido a las limitaciones experimentales . Es posible, en efecto, que el impacto epigenética de la TSA en
MAGEA1
se produjo en sólo una pequeña proporción de las células, por lo que es muy difícil de detectar cambios significativos de activación de genes y la metilación del ADN en la población de células tratadas. Por otra parte, la activación epigenética abierta de
MAGEA1 fotos: por la TSA podría requerir la presencia de factores de transcripción pertinentes, que pueden no estar presentes en SK-MEL-23 o células MEL-EB16 líneas. Hemos demostrado, en efecto, que la activación a largo plazo de
MAGEA1
requiere no sólo un proceso de desmetilación del ADN, sino también la presencia de activadores de la transcripción para evitar remetilación posterior del promotor [23].
por tanto, decidimos volver a evaluar el efecto de la TSA en un sistema de células previamente establecido (MZ2-MEL.TrHM) que contiene un seleccionable
MAGEA1
construir [24]. células MZ2-MEL.TrHM contienen un transgén (
MAGEA1 /hph
) que comprende una gran parte de la
MAGEA1
locus (incluyendo la región promotora), seguido de la secuencia que codifica la resistencia a higromicina (
HPH
; Fig. 3A). El transgén fue metilado
in vitro
antes de la transfección, y se mantiene metilado y silencio en las células MZ2-MEL.TrHM, que por lo tanto son sensibles a la higromicina. Sin embargo, se demostró que (hygro
r) clones de células resistentes a higromicina surgen cuando el
MAGEA1 /HPH
transgén se activa de forma estable, por ejemplo después del tratamiento con 5-transitoria azadC [24]. Es importante destacar que las células MZ2-MEL.TrHM se derivaron de un
MAGEA1
expresando línea celular de melanoma. Por tanto, estas células contienen todos los factores de transcripción necesarios para asegurar la activación a largo plazo del promotor del gen, como lo demuestra la presencia de un activo y no metilado endógena de
MAGEA1
gen.
, la representación esquemática de la estructura y el estado de metilación del ADN de los no metilados (círculos vacíos) activos
MAGEA1
gen y los (círculos rellenos) inactivos metilados
MAGEA1 /hph
transgén en MZ2-MEL .TrHM células. Las cajas negras corresponden a los
MAGEA1
exones, el cuadro gris oscuro dentro de la
MAGEA1 /HPH
transgén representa el
unidad de transcripción HPH
, y el asterisco (*) es la el sitio donde se insertó una secuencia de etiqueta de 12 pb (que lleva un
Xba
sitio de restricción I). El panel inferior es una ampliación de la amplificación que se amplificó en el chip experimentos, e indica los tamaños de los fragmentos esperados después de
Xba
I digestión.
B Opiniones, chip experimentos se aplicaron a MZ2-MEL.TrHM. La resultante
MAGEA1
amplificados fueron digeridos con
Xba I y
separaron en geles de agarosa, revelando así el enriquecimiento relativo de las modificaciones de las histonas que se indican en el directorio
MAGEA1
gen (banda superior ) o el
MAGEA1 /HPH
transgén (banda inferior).
C
, enriquecimiento relativo de las marcas de las histonas en el transgén se dedujo mediante la cuantificación de las intensidades de banda en el gel de electroforesis imágenes (software ImageJ), y calculando la proporción inferior /superior. Los datos, que se normalizaron por la relación inferior /superior en muestras de entrada, se derivan de al menos dos experimentos independientes chip, con dos análisis de PCR /XbaI /electroforesis en cada caso. *
P Hotel & lt; 0,05, ***
P
. & Lt; 0,001
Hemos llevado a cabo la primera chip experimentos para identificar las modificaciones de las histonas asociadas con la silenciosa
MAGEA1 /HPH
transgén en las células MZ2-MEL.TrHM. La presencia de una secuencia de etiqueta en el
MAGEA1 /HPH
transgén, se inserta en la posición 158 con relación al sitio de inicio de transcripción y que contiene un
Xba
-I sitio de restricción, nos permitió distinguir
MAGEA1
amplicones procedentes de o bien el transgen exógeno o el gen endógeno. Por lo tanto, MZ2-MEL.TrHM cromatina derivado
MAGEA1
amplificados se digirieron con
Xba
-I, produciendo de este modo una banda superior (330 pb) se deriven de la endógena de
MAGEA1
gen y una banda inferior (269 pb) se deriven de la
MAGEA1 /HPH
transgén después de la electroforesis en agarosa (Fig. 3A, B). Mediante la aplicación de este procedimiento para el análisis de muestras de cromatina chip derivados, encontramos que H3ac y H3K4me2 marcas de histona fueron fuertemente agotarán en el
MAGEA1 /HPH
transgén, en comparación con el endógena de
MAGEA1
gene. Por el contrario, la marca represivo H3K9me2 apareció enriquece predominantemente dentro del transgén (Fig. 3B, C). Estos resultados indican que, tras la integración en el genoma MZ2-MEL.TrHM, el
in vitro
metilado
MAGEA1 /HPH
transgén marcas de histona adoptados normalmente asociados con el estado reprimido de la
MAGEA1
gen en células que no expresan.
la falta de activación a largo plazo de
MAGEA1 /HPH
después del tratamiento TSA
a medida que nos encontramos bajo la acetilación de histonas en el silencio
MAGEA1 /HPH
transgén, hemos probado la capacidad de la TSA para inducir la activación estable del transgén, y por lo tanto la aparición de higro
r clones entre la población de células MZ2-MEL.TrHM tratada. Además del tratamiento 24h TSA convencional, una exposición de 72h TSA-largo se aplicó a las células MZ2-MEL.TrHM, como se informó de que el tratamiento prolongado con inhibidores de HDAC puede en algunos casos ser necesario para inducir localizada desmetilación del ADN [25]. La concentración de TSA en el tratamiento de 72 h se redujo a 80 nm, ya que las dosis más altas se encontraron para matar a la mayoría de las células durante este período de tiempo. Además de las células tratadas con TSA, también analizaron las células tratadas con una dosis subóptima de 5-azadC (20 nM; Fig. 4A). 5-azadC a esta dosis fue encontrado para inducir
MAGEA1 /expresión de ARNm de hph
a un nivel comparable a la observada en el día 1 después del tratamiento 24h TSA (Fig. 4B). Por lo tanto, el tratamiento con la dosis subóptima de 5-azadC nos permitió verificar si nuestro procedimiento de selección de higromicina todavía era eficaz en condiciones en las que se produjo sólo la activación de bajo nivel del transgén.
Un
, esbozo esquemático del experimento. células MZ2-MEL.TrHM fueron tratados o no (control) con 300 nM de TSA durante 24 horas, 80 nM de TSA durante 72 h, o con 20 nM de 5-azadC durante 72 h. Después de tres días, 10
6 células de cada grupo se transfirieron a dos matraces (75 cm
2) y se seleccionaron en un medio que contenía higromicina (180 mg /ml) durante 13 días.
B Opiniones, el nivel de expresión de la
MAGEA1 /HPH
transgen se cuantificó mediante qRT-PCR en el punto de tiempo indicado (D1 o D3) en cada grupo de células. Los datos representan la media (± SEM) de los mínimos AL tres experimentos independientes. ***
P Hotel & lt; 0,001.
C
, el nivel de la desmetilación de ADN de la
MAGEA1 /hph
región 5 'en los diferentes grupos de células se evaluó por cuantitativa MS-PCR, utilizando cebadores que amplifican específicamente el transgén etiquetado secuencia. Los datos (sofá desmetilación del ADN) se calcularon como en la figura 2C, y corresponden a la media (± SEM) de al menos tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05.
D
, El número de clones que sobrevivieron a la selección de higromicina fueron contados en el día 16 en los tres grupos de células. Los datos se derivan a partir de al menos dos experimentos independientes, cada una por duplicado.
experimentos RT-PCR cuantitativa reveló que mientras que la baja pero significativa
MAGEA1 /HPH
se observó la inducción de ARNm en el día 1 siguiente el tratamiento TSA 24h, esta inducción ya se había perdido dos días más tarde (Fig. 4B). células MZ2-MEL.TrHM que habían sido expuestos al tratamiento 72h TSA muestran un aumento muy modesto en
MAGEA1 /HPH
expresión de ARNm (no significativo,
p = 0.1428
), en comparación con las células de control (Fig. 4B). Este bajo nivel de inducción fue probablemente atribuible a la disminución de la concentración de TSA en esta condición. Por otra parte, cuantitativa MS-PCR dirigido específicamente hacia la transgénico
MAGEA1
región 5 ', no reveló la desmetilación de esta secuencia de ADN en cualquiera de las poblaciones de células tratadas con TSA, en comparación con las células no tratadas (Fig. 4C) . Por el contrario, las células tratadas con la dosis subóptima de 5-azadC muestran moderada, aunque significativa, desmetilación del ADN de la
MAGEA1 /HPH
transgén.
Con el fin de detectar células raras donde
MAGEA1 HPH
activación /transgén podría haber ocurrido y que puede haber permanecido invisible en nuestra RT-PCR y MS-PCR análisis, presentamos las poblaciones de células MZ2-MEL.TrHM tratados de manera diferente a la selección en higromicina. Después de 13 días de selección, se contaron hygro
r colonias. La frecuencia media de higro
r clones obtenidos ya sea después de las 24h o 72h el tratamiento TSA (6 × 10
-6 y 5,5 × 10
-6, respectivamente) no fue superior a la observada para el control sin tratar las células (9,5 × 10
-6), y por lo tanto, corresponde al nivel de fondo de forma espontánea hygro
r células revertientes (Fig. 4D). En comparación, el tratamiento con la dosis subóptima de 5-azadC dio lugar a la aparición de un número mucho mayor de hygro
clones R (& gt; 3 × 10
-4). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la TSA no induce la desmetilación del ADN y la activación estable de la
MAGEA1 /HPH
transgén, ni siquiera en una pequeña proporción de las células MZ2-MEL.TrHM tratados
desmetilación del ADN induce la reversión de las marcas de las histonas en
MAGEA1 /HPH
Teniendo en cuenta los estudios previos de otros [18], [19], y las observaciones que aquí descrito anteriormente, parece poco probable que los cambios a nivel de modificaciones de las histonas pueden por sí mismos ser un disparador suficiente para causar la desmetilación del ADN y la activación a largo plazo de la
MAGEA1
gen. Por consiguiente, era razonable proponer que la reversión de las marcas de las histonas asociadas con
MAGEA1
activación es más bien una consecuencia de la desmetilación del ADN. Para probar esta hipótesis, hemos recurrido a un higrómetro previamente establecido
r subpoblación de células MZ2-MEL.TrHM (H
r de población, Fig. 5A y [24]), que se había obtenido después de la exposición transitoria de las células a los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra
DNMT1
, la ADN metiltransferasa predominante en estas células [24]. Decidimos realizar experimentos chip en el H
r la población con el fin de determinar el impacto de la desmetilación del ADN en H3ac, H3K4me2 y H3K9me2 marcas de histona dentro del
MAGEA1 /HPH
transgén. Los análisis también se realizaron en un clon de células (H
r clon 1), que había sido aislado a partir de la H
población r (Fig. 5A). Quantitative RT-PCR y secuenciación de bisulfito de sodio confirmaron robusta activación y ADN desmetilación transcripcional del
MAGEA1 /hph
transgén en el H
población r y H
r clon 1 (Fig. 5B).
Un
, Representación esquemática de la derivación de la H
población R y H
r 1 clon de células MZ2-MEL.TrHM (véase la referencia [24] para más detalles) . células MZ2-MEL.TrHM se transfectaron repetidamente con oligonucleótidos antisentido dirigidos contra
DNMT1
(
DNMT1-AS
) durante 7 días, y se transfirieron después en medio que contenía higromicina. Después de 9 días de selección con higromicina, una población resistente emergió (H
población r), y un clon (H
r clon 1) fue aislado de esta población por dilución limitante. El H
Población R y H
r clon 1 fueron posteriormente cultivadas sin selección con higromicina.
B Opiniones, El nivel de expresión de ARNm (relación de 10
4
ACTINB
) y la región 5 'estado de metilación del ADN (% CpG metilados) del
MAGEA1 /HPH
transgén se determinaron en células MZ2-MEL.TrHM, el H
población R y H
r clon 1 de QRT-PCR y secuenciación de bisulfito, respectivamente.
C
, chip-qPCR se utilizó para evaluar el enriquecimiento de H3K9me2 dentro del
MAGEA1 /HPH
transgén en los tres grupos de células (véase el texto para más detalles). Doblez niveles de enriquecimiento se obtuvieron mediante la presentación de informes de los
MAGEA1
región 5 'enriquecimiento de los valores a la del
GAPDH
región 5' en la misma muestra. Los datos representan la media (± SEM) de dos a tres experimentos chip, con dos qPCR mediciones duplicadas en cada caso. ***
P Hotel & lt; 0,001.
D
, el chip /PCR /
Xba
procedimiento (véase la Fig. 3A, B) se aplicó para evaluar el enriquecimiento de H3ac y H3K4me2 dentro de la región 5 'del
MAGEA1 /HPH
transgén en los tres grupos de células.
E
, ImageJ análisis de electroforesis en gel imágenes fueron utilizados para cuantificar el
relación transgén /gen MAGEA1
región 5 '. Los datos representan la media (± SEM) de dos experimentos independientes chip, con dos análisis de PCR /XbaI /electroforesis en cada caso. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
Para el análisis de H3K9me2, muestras de astillas fueron sometidos a PCR cuantitativa con cebadores no distinguir entre endógeno y transgénico
MAGEA1
secuencias. La falta de H3K9me2 dentro de la endógena activa
MAGEA1
gen en las células MZ2-MEL.TrHM (ver Fig. 3B, C) implícita, sin embargo, que la mayoría de los amplicones derivados de chip se originarían de la
MAGEA1 /HPH
transgén. Los resultados, que se representan en la figura 5C, fueron consistentes con una disminución del enriquecimiento H3K9me2 dentro de la región 5 'de
MAGEA1 /HPH
en el H
r la población y en el H
clon R1 , en comparación con las células de control MZ2-MEL.TrHM. Para el análisis de H3ac y H3K4me2, hemos recurrido al chip-PCR
Xba
procedimiento descrito anteriormente (Fig. 3A). Los resultados mostraron que mientras que el
MAGEA /hph
transgén no se asoció con H3ac y H3K4me2 en células de control MZ2-MEL.TrHM, que muestra el enriquecimiento significativo de estas dos marcas de activación en el H
r y población en el H
r clon 1 (Fig. 5D, E). En conjunto, estos resultados indican que la depleción transitoria de DNMT1 en las células MZ2-MEL.TrHM, dio lugar a la aparición de higro
r las células, en el que la re-activa
MAGEA1 /HPH
locus no está representada sólo marcó hipometilación del ADN, pero también una inversión significativa de su perfil de la modificación de histonas hacia una configuración activa.
Discusión
hipometilación del genoma se observa con frecuencia en las células tumorales, y se ha asociado con la progresión maligna. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a esta alteración epigenética son todavía desconocidos. Teniendo en cuenta el estrecho vínculo existente entre la metilación del ADN y las histonas modificaciones, era razonable proponer que la hipometilación del ADN en los tumores podría ser una consecuencia de los cambios que se producen a nivel de marcas de histona. Las alteraciones de los perfiles de modificación de las histonas de hecho se han observado en diferentes tipos de tumores, y en algunos casos han sido asociadas con mutaciones en enzimas modificadoras de histonas [26].
En el presente estudio, hemos analizado la relación entre la metilación del ADN y modificaciones de las histonas en el
MAGEA1
gen, ya que pertenece al grupo único de genes CG, para la que se observa con frecuencia promotor hipometilación en una variedad de tumores y fue consistentemente asociada con la activación transcripcional [11]. Se ha informado anteriormente de que la desmetilación y la activación de los genes en los tumores CG se asocia generalmente con las pérdidas de las marcas de las histonas represivas, y las ganancias en la activación de las marcas de las histonas [18], [19]. Tal asociación se confirmó en nuestro estudio, ya que encontramos que
MAGEA1
desmetilación y la activación de las células del melanoma se correlacionaron con las pérdidas de H3K9me2 y ganancias en H3ac y H3K4me2. Estudios anteriores, sin embargo, demostró que la expresión de
MAGEA1
no pudo ser activado simplemente modulación de los niveles H3K9me2 o H3K4me2, lo que sugiere que estas dos modificaciones de las histonas juegan sólo un papel secundario en la regulación epigenética de este gen [18], [19]. Los inhibidores de la histona deacetilasa TSA, entre ellos, se encontró que en lugar de inducir la activación de
MAGEA1
, lo que implica que la acetilación de histonas podría contribuir más activamente a la regulación epigenética de este gen [22], [27]. Nuestros datos actuales, sin embargo, indican que el tratamiento TSA sólo conduce a la activación transitoria de
MAGEA1 Opiniones y no induce la desmetilación del ADN en el promotor del gen.
Nuestro estudio ofrece un análisis en profundidad del efecto de la TSA en
MAGEA1
de activación, ya que hemos comprobado su impacto no sólo en que no expresan líneas celulares, sino también en el clon de células MZ2-MEL.TrHM, que contiene un
in vitro
metilado transgén que comprende la porción 5 'de
MAGEA1
seguido de la secuencia que codifica la resistencia a la higromicina. Este sistema de células ofrece alta sensibilidad, ya que permite la selección de células (incluso si son rara), en el que la activación de la
ocurrieron MAGEA1
promotor. Además, debido a que las células expresan el endógena de
MAGEA1
gen, es obvio que contienen todos los factores necesarios para asegurar la activación transcripcional de los transgénicos
MAGEA1
promotor, una vez que se desata de las limitaciones de la cromatina. Es importante destacar, puso de manifiesto que, a diferencia de la endógena de
MAGEA1
promotor del gen, la exógena
MAGEA1
promotor del transgén en las células MZ2-MEL.TrHM se asoció con altos niveles de H3K9me2 y bajos niveles de H3ac y H3K4me2. Esto sugiere que, a partir de su integración en la cromatina huésped, el
in vitro
metilado
MAGEA1
transgén aprobó el perfil de la modificación de histonas represivas típicamente asociado con el
MAGEA1
gen en constitutivamente