Extracto
El diagnóstico molecular de los cánceres humanos pueden aumentar la precisión en el pronóstico, facilitar la selección del régimen terapéutico óptimo , mejorar los resultados del paciente, reducir los costos de tratamiento y el desarrollo a favor de enfoques personalizados para el cuidado del paciente. Por otra parte la sensibilidad y la especificidad son características fundamentales de cualquier método de diagnóstico. Hemos desarrollado un microarray de alta sensibilidad para la detección de KRAS comunes y BRAF mutaciones oncogénicas. En el cáncer colorrectal, KRAS y BRAF mutaciones se han mostrado para identificar un grupo de pacientes que no responden a las terapias anti-EGFR; por lo tanto, la identificación de estas mutaciones es clínicamente muy importante. Para verificar las características técnicas del sistema de microarrays para la correcta identificación del estado mutacional del gen KRAS en los dos codones 12 y 13 de zona interactiva y de la BRAF
mutación V600E en el tumor colorrectal, se seleccionaron 75 muestras previamente caracterizadas por convencional y CO- amplificación en Baja temperatura de desnaturalización-PCR (COLD-PCR) seguida de alta resolución análisis y secuenciación directa de fusión. Entre estas muestras, 60 fueron recogidos durante la cirugía e inmediatamente impregnados de RNAlater mientras que los 15 restos fueron tejidos embebidos en parafina (FFPE) fijado en formol e. El límite de detección del método propuesto fue diferente para las 7 mutaciones de KRAS probados y para la mutación V600E BRAF. En particular, el sistema de microarrays ha sido capaz de detectar un mínimo de aproximadamente 0,01% de los alelos mutados en un fondo de ADN de tipo salvaje. Una validación ciega muestra completa concordancia de los resultados. La excelente concordancia de los resultados mostró que el nuevo sustrato de microarrays es altamente específica en la asignación del genotipo correcto sin ningún tipo de estrategia de enriquecimiento
Visto:. Galbiati S, F Damin, Pinzani P, Mancini I, Vinci S, M Chiari , et al. (2013) Un nuevo Microarray Sustrato para genotipificación ultrasensible de KRAS y BRAF variantes de genes en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10.1371 /journal.pone.0059939
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Julio, 2012; Aceptado: February 21, 2013; Publicado: 25 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Galbiati et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Definición de la firma molecular de los cánceres humanos podrían estar en el centro para el desarrollo de un enfoque personalizado de atención al paciente. De hecho la identificación de biomarcadores adecuados podría aumentar la precisión en el pronóstico, facilitar la selección del régimen terapéutico óptimo, mejorar el resultado del paciente y reducir los costos de tratamiento [1]. Por lo tanto, la estratificación de los pacientes individuales basados en las características moleculares y genéticos es la evolución esperada de la oncología clínica moderna.
Recientemente agentes terapéuticos dirigidos variantes genéticas específicas y los patrones moleculares bien caracterizados se han desarrollado. Este es el caso de la KRAS oncogén que es parte de la vía de señalización de varias moléculas diferentes. Ganancia de la función de las mutaciones de sentido erróneo son a menudo adquiridos somáticamente en el cáncer colorrectal, prevalentemente en tres puntos calientes representados por los codones 12, 13 y 61. Desafortunadamente, en estos niveles el número de sustituciones es alta, por lo que su detección más compleja con el alelo específica técnicas. Constitutivamente, la activación de mutaciones en estos sitios de puntos calientes puede determinar la resistencia a las terapias dirigidas a EGFR que deberían mejorar de otro modo significativamente la tasa de supervivencia y la calidad de vida de los pacientes [2], [3], [4], [5]. El potencial de KRAS codón 12/13 mutaciones marcadores moleculares como eficaces para la selección de medicamentos ha recibido considerable atención que conduce a su uso en el cuidado rutinario de los pacientes con cáncer colorrectal [6]. La autoridad sanitaria europea (http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.), Así como la Sociedad Americana de Oncología Clínica [7] y la National Comprehensive Cancer Network (NCCN , http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) requerirá un análisis mutacional del gen KRAS en cáncer colorrectal antes de la terapia anti-EGFR
.
Otro prometedor biomarcador de la resistencia anti-EGFR está representado por BRAF
mutación V600E, que se produce en aproximadamente el 10% de los cánceres colorrectales. BRAF es el efector aguas abajo inmediata de KRAS en la vía de señalización Ras /Raf /MAPK y BRAF
V600E mutación activadora es mutuamente exclusiva para las mutaciones KRAS [6]. A pesar de los datos actualmente limitados, y la falta de consenso completo, es probable que las mutaciones de BRAF tienen un papel en la determinación de la respuesta al tratamiento anti-EGFR mAb y se asocia con un peor pronóstico, independientemente del tratamiento [8], [9]. Por otra parte, los pacientes con tumores que llevan BRAF mutante también podrían beneficiarse de los inhibidores de BRAF selectivos tales como PLX-4032 [10].
En el escenario actual de las estrategias de cribado, los métodos actuales de análisis de secuenciación (convencionales, pirosecuenciación, etc. .) son mucho tiempo, costoso y carecen de robustez. Otro tema emergente está conectado a la sensibilidad real de estos métodos que parecen detectar alelos mutados minoritarias solamente cuando está presente a concentraciones mayores que 10 a 20%. En trabajos anteriores [11], [12], hemos subrayado la importancia de la sensibilidad en la detección de alelos minoritarios mutado en muestras biológicas y se confirmó la utilidad de COLD-PCR para su enriquecimiento, especialmente en muestras con bajos porcentajes de células tumorales. En promedio, el 15% de los pacientes inicialmente clasificadas como negativas para KRAS BRAF o
V600E variantes se encontraron positiva después de COLD-PCR [11], [12].
Las micromatrices representan una herramienta barata y precisa de forma paralela genotipado de múltiples marcadores, adecuados para el análisis de rutina en el diagnóstico médico [13]. Aquí, se presenta en el desarrollo de un microarray de alta sensibilidad para la detección de mutaciones de KRAS y BRAF. La micromatriz se desarrolla utilizando un portaobjetos de silicio cristalino recubierto por un dióxido de silicio crecido térmicamente (SiO
2) de capa y funcionalizado por adsorción de un copolímero de dimetilacrilamida (DMA), N-acryloyloxysucinimide (NAS) y meta-acryloy silano propil trimetoxi (MAPS), copoli (DMA-NAS-MAPS), desarrollado originalmente para los microarrays de ADN de vidrio [14]. La cadena principal del polímero consta de DMA, un monómero que se adsorbe a la superficie por enlaces de hidrógeno; NAS es el monómero químicamente reactivo que reacciona covalentemente con bio-sondas, mientras MAPAS contribuyen a la estabilidad filmar por condensación con silanoles superficiales. El procedimiento de revestimiento es simple y reproducible, si se compara con organo-silanización, un proceso que requiere condiciones muy controladas y sufren de mala reproducibilidad. Este polímero funcional se ha aplicado ampliamente en el campo biosensor para la bio-funcionalización de poliestireno nanobeads [15], microcantilevers de silicio [16], polidimetilsiloxano [17], y de nitrocelulosa [18] sustratos.
La elección de sustrato de silicio recubierto por una capa de SiO
2 de 100 nm de espesor conduce a una fuerte intensificación de la fluorescencia en la superficie resultante de la interferencia constructiva entre la óptica incidente y reflejado luces de la radiación fluorescente. La condición de interferencia constructiva en la superficie del sustrato se cumple en varios tipos de portaobjetos de vidrio recubiertos con capas de películas dieléctricas o de metal [19]. Sin embargo, la estrategia involucrada en la producción de este tipo de estructuras multicapa complejas a menudo sufre una baja reproducibilidad y control de procesos difíciles. La configuración más sencilla de lograr una mejora fluorescente cerca de la proporcionada por las diapositivas de múltiples capas consiste en el reflector plano de silicio recubierto con una fina capa de SiO
2 [20], [21] propuesto por este trabajo.
para evaluar las prestaciones técnicas de la plataforma de nuevo desarrollo y verificar su capacidad para corregir el genotipado del gen KRAS y BRAF
mutaciones V600E en muestras de tumores colorrectales, se seleccionaron 60 muestras de tejido ya clasificadas para estas variantes genéticas mediante protocolos completos de convencional y FRÍO -PCR, de alta resolución de fusión análisis y secuenciación directa. El excelente resultado de los resultados serán discutidos con el fin de mostrar las ventajas y los inconvenientes de ambas tecnologías.
Materiales y Métodos
Ética
Las muestras de tejido fueron recogidos en Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi en Florencia (Italia) a partir de 75 pacientes sometidos a cirugía de CRC en el período 1/6 /2009-2 /5 /de 2011. Todos los individuos incluidos en este estudio proporcionaron su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por la junta de revisión de la Universidad de Florencia. Por otra parte, se utilizaron dos líneas celulares proporcionadas por ATCC-LGC Standards Asociación: la línea celular CCRF-CEM como referencia para KRAS mutación p.G12D (heterocigoto) y el melanoma humano A375 línea celular como la fuente de homocigotos BRAF
ADN V600E . La línea humana de células de carcinoma colorrectal SW620 (usado como referencia por la mutación KRAS pG12V, homozygousand la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 (de tipo salvaje para ambos genes KRAS y BRAF) fueron suministrados por Banca Biologica fábrica e célula (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino -. IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)
preparación de la muestra
se recogieron Sesenta muestras de tejido durante la cirugía e inmediatamente sumergidos en RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Alemania) a 4 ° C durante 24 horas y se almacena posteriormente a -80 ° C hasta el análisis. los tejidos se rompieron mediante Tissue Lyser con perlas de acero inoxidable de 5 mm (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. purificación del ADN se realizó con QIAcube ™ y QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen )
La concentración de ADN se determinó con Nanodrop ND-1000 espectrofotómetro (Thermo Scientific, dE, EE.UU.)
Por otra parte, también se analizaron 15 tejidos FFPE;.. se extrajo el ADN de tejidos FFPE usando el kit de tejido FFPE (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
muestras de ADN fueron en primer lugar investigados por medio de PCR convencional y la amplificación COLD-PCR seguido de HRM y secuenciación directa. Posteriormente fueron sometidos a ciegas con el análisis realizado por el dispositivo de micromatriz de nuevo desarrollo para evaluar su capacidad de KRAS y BRAF mutaciones genotipado.
muestras de control positivo fueron representados por el ADN de líneas celulares con mutaciones en los genes diana (Ver anterior sección de Ética). En particular de tipo salvaje y mutante muestras se analizaron por separado como muestras individuales y como mezclas, a fin de obtener porcentaje conocido de alelo mutado (de 6% a 0,01%) para ser utilizado para la determinación de la sensibilidad del ensayo para KRAS p.G12D y BRAF V600E variantes.
por otra parte, se utilizó ADN plasmídico que contiene las secuencias de tipo salvaje y, alternativamente, todas las variantes consideradas para obtener muestras reconstituidas para probar la sensibilidad del ensayo y la especificidad para todas las otras mutaciones KRAS.
Mutagénesis
plásmidos que llevan mutantes se genera a través de la clonación de productos de PCR específicos mutagenizadas que albergan las siete mutaciones probados en el ensayo y el fragmento de tipo salvaje correspondiente. fragmentos mutagenizados se prepararon utilizando una modificación del método descrito anteriormente [22]. Brevemente, la mutagénesis se consigue dividiendo cada amplicón en dos fragmentos. A continuación, el fragmento 5 'se amplificó con el cebador directo original y un cebador inverso mutagénesis de la introducción de una transversión conservador. En paralelo, el fragmento 3 'se amplificó con el cebador inverso original y un cebador directo mutagenizado la introducción de la misma variación de nucleótidos como anteriormente (véase la Tabla S1). Esto condujo a la producción de dos fragmentos que se superponen parcialmente, que eran cada gel-eluyó en un volumen final de 50 a 100 l de agua destilada para eliminar los cebadores no incorporados. Mezclamos 2 l de cada solución eluida juntos; a continuación, cada mezcla se alarga durante 15 ciclos en presencia de la mezcla de reacción de PCR que contenía todos los reactivos, pero cebadores. El producto de reacción de elongación, lo que resulta en un larga duración fragmento mutado en el centro, era aún más amplificado por PCR de 20-30 ciclos por adición de la mezcla completa de PCR y se clonó en el vector de plásmido (clonación TOPO TA, Invitrogen, Life Technologies, Milán, Italia ) según el protocolo del fabricante. La secuenciación directa confirmó que el cambio de nucleótido deseado se introduce en el control mutado
Las condiciones de PCR
El exón 2 del gen KRAS se amplificó con el siguiente conjunto de cebadores:. 5'-CGC TGC TGA AAA TGA CTG AA-3 '(hacia delante) y 5'-ATG AGA GTC CTG CAG CAC TAA-3' (5-amino-modificado, inversa) generando un fragmento de 167 pb. Los cebadores usados para la amplificación del exón 15 BRAF (tamaño de amplificación de 173 pb) fueron 5'-TGC TTG CTC TGA TAG GAA AAT G-3 '(hacia delante) y 5'-CCA CAA AAT GGA TCC AGA CA-3' (5-amino -Modificado, inversa).
PCR para ambos genes se realizó en la reacción 25 l que contiene 15 ng de ADN, 200 uM de cada desoxinucleótido, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 m m KCl, 1,5 mM MgCl
2, 1,5 U de ADN polimerasa (AmpliTaq Gold; Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y 10 pmoles de cada cebador. Las condiciones de ciclación implicaban una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s, y una elongación final a 72 ° C durante 10 min .
purificación de PCR
Después de que el proceso de amplificación, cada uno de amplificación se purificó y se desala con el uso de una placa de 96 pocillos (placas Multiscreen-PCR MANU 030), junto con el sistema de separación Multiscreen (Millipore Corporation, Billerica, MA, EE.UU.). Los productos de PCR se eluyeron en 35 l de 1 x tampón de impresión (150 mM de fosfato de sodio pH 8,5).
diseño
Reportero y estabilizador
Los reporteros fueron diseñados en un formato de transferencia en punto con la variación de la base correspondiente a los puntos de acceso ubicados internamente (Tabla 1). Se utilizó un formato de etiquetado universal (Figura 1), sobre la base de la prensa que contienen una cola específica de secuencia que se hibrida con Cy3 universal o Cy5 sondas marcadas (sonda de tipo salvaje: CTC AAT GTT CGG ACT CAG-Cy3; sonda mutante: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23]
etapas de hibridación:. 1) oligonucleótido estabilizador para abrir la estructura secundaria del fragmento de PCR; 2) La "mezcla reportero universal". La mezcla contiene la de tipo salvaje y mutantes reporteros. Cada reportero se prolonga por una cola complementaria al oligonucleótido universal de etiquetado. Cyanine 3- (Cy3) y cianina 5 (Cy5) etiquetados oligonucleótido recocido universal a la de tipo salvaje y mutantes reporteros, respectivamente.
Estabilizador (oligonucleótido necesario abrir las estructuras secundarias presentes en el amplicón) y el diseño reportero se llevó a cabo con la ayuda de programas libres de web (servidor DNAmfold: http://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna y OligoANALYZER 3.0 por Integrated DNA Technologies: http: //www.idtdna .com) [24]. Todos los reporteros fueron diseñados utilizando la cadena antisentido como amplicón diana. Todas las 7 mutaciones de KRAS se analizaron con el mismo oligonucleótido estabilizador expuesto en la Tabla 1. La mutación BRAF codón 600 requiere el uso de dos estabilizadores (puñalada 1: situado en 5 'a la mutación; puñalada 2: situado en 3' a la mutación , en la Tabla 1).
preparación
recubrimiento de silicona de diapositivas y microarrays
Si no se trata de silicio se desliza 1000A óxido térmico (14 × 14 mm
2) fueron suministrados por la SVM, Silicon Valley Microelectrónica Inc . (Santa Clara, CA, EE.UU.). diapositivas de silicio fueron tratados previamente con hidróxido de sodio 0,1 M durante 30 min y se lavaron con agua y se secaron. Después de pre-tratamiento, las diapositivas de silicio se sumergieron durante 30 minutos en un copoli (DMA-NAS-MAPS) solución (1% w /v en 0,9 M (NH4)
2SO solución de agua
4). Copoli (DMA-NAS-MAPS) se sintetizó y caracterizó como se describe [14].
Las láminas fueron finalmente enjuaga con agua y se seca al vacío a 80 ° C.
Los productos de PCR para cada gen, amplificado a partir de cebadores con grupo amino primario de un 5 ', necesarios para unir los amplicones de forma covalente al sustrato a través de una reacción entre los grupos amino y los ésteres activos del recubrimiento de polímero, fueron vistos en los sustratos de microarrays. Tres l de los amplicones modificados con amino se imprimieron en 6 repeticiones utilizando un observador piezoeléctrico, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Alemania), en portaobjetos recubiertos de silicio. Un oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 fue vista como una referencia de posición en cuatro columnas en cada matriz. condiciones Spotting se llevó a cabo como se describe en [25]. Los amplicones se acoplaron a las matrices mediante la incubación en una caja de almacenamiento sin tapar, establecido en una cámara sellada, se saturó con cloruro de sodio (40 g /100 ml H
2O) y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche.
después de la incubación, todos los grupos reactivos residuales del polímero de recubrimiento se bloquearon sumergiendo el portaobjetos en solución de pre-calentado bloqueo según lo informado [25].
hibridación
Inmediatamente antes de la hibridación, se sumergieron portaobjetos impresos en NaOH 0,1 M durante 5 minutos para desnaturalizar los amplicones de doble cadena inmovilizados, posteriormente se aclaró con agua y se seca. Las secuencias de los reporteros y estabilizadores, junto con las temperaturas de hibridación se detallan en la Tabla 1. En la primera etapa, 0,5 l de oligonucleótido estabilizador se mezclaron con 49,5 l de tampón de hibridación (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml de BSA) hasta 1 M de concentración final y se extendió sobre el área manchada de la diapositiva. Los portaobjetos se incubaron a 20 ° C durante 30 min en la cámara de hibridación Thermomixer Comfort (Eppendorf), y después se lavaron a temperatura ambiente en un tampón SSC 4 × para eliminar la hoja de la cubierta. Esta primera etapa de lavado fue seguido de un breve lavado (30 s) en un tampón de bajo contenido de sal (0,2 x SSC). Entonces, para la detección de G12S, G12D, G12C, G12R, mutaciones G13D KRAS y para los BRAF
mutaciones V600E, el reportero de la de tipo salvaje y las secuencias mutadas y sus correspondientes oligonucleótidos universales marcadas con Cy3 y Cy5, respectivamente, se mezclaron entre sí en cantidades equimolares (concentración final 1 mM) y se añadió al tampón de hibridación (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml de BSA) (véase la Figura 1 para el esquema de ensayo). En el caso de las mutaciones G12A y G12V KRAS fue necesario incubar los amplicones en dos pasos consecutivos. En la primera etapa de los amplicones se hibridaron con el reportero complementaria a la secuencia mutada, junto con el oligonucleótido universal, correspondiente marcado con Cy5; a continuación, después de un breve lavado en 4 x SSC para eliminar la hoja de la cubierta, en el segundo de los amplificados se hibridaron con el reportero complementaria a la de tipo salvaje y su oligonucleótido universal, correspondiente marcado con Cy3. Ambas incubaciones duraron 1 hora.
Finalmente las diapositivas de silicio fueron retirados de la cámara de hibridación y se sumergen brevemente en 4 x tampón de SSC para eliminar la hoja de la cubierta, lavaron dos veces durante 5 min en 2 x SSC /0,1% SDS , pre-calentado a la temperatura de hibridación específica, luego se sumerge, en secuencia, en una solución de 0,2 x SSC y 0,1 x SSC durante 1 min a temperatura ambiente, se secaron por centrifugación a 780 rpm durante 3 min y se escanean.
digitalización de imágenes y análisis de datos
ProScanArray (Perkin Elmer, MA, EE.UU.) se utilizó para escanear las diapositivas hibridados. En particular, un láser verde (λ
ex 543 nm /λ
em 570 nm) para el tinte Cy3 y un láser rojo (λ
ex 633 nm /λ
em 670 nm) para el Cy5 colorante se aplica. El fotomultiplicador (PMT) de ganancia tubo y la potencia del láser y cambiaron entre fluorocromos diferentes experimentos. Las imágenes TIFF de 16 bits se analizaron a 5 micras resolución. intensidades de datos se extrajeron con el software del escáner y se realizó el análisis de datos para cada experimento como se describe anteriormente [25].
Convencional y amplificación COLD-PCR seguida de alta resolución de fusión (GRH) y secuenciación directa
PCR convencional, COLD-PCR, los protocolos de gestión de recursos humanos y de secuenciación han sido ya descrito [11], [26].
resultados
1) convencional y COLD-PCR HRM amplificación y secuenciación resultados
Inicialmente, todas las 75 muestras fueron seleccionados para la investigación de mutaciones KRAS y BRAF
V600E por HRM y secuenciación. En una segunda fase, todas las muestras (mutado y de tipo salvaje) se vuelven a enviar una proyección completa utilizando la amplificación COLD-PCR seguida de secuenciación de gestión de recursos humanos y como ya se ha informado [11].
A nivel mundial, 59 de 75 muestras contenida alternativamente una mutación ya sea en puntos de acceso KRAS o la variante V600E BRAF
, mientras que 16 se clasificaron como muestras de tipo salvaje y se incluyen como controles negativos. Es importante señalar que en 9/59 muestras mutadas, la identificación de las sustituciones de bases solamente fue posible gracias a la utilización de protocolos de PCR-COLD rápidos o completos, probablemente debido a los porcentajes más bajos de alelos mutados en las muestras de partida. Estas muestras se introdujeron pertinentemente en el estudio de validación para probar la sensibilidad de la plataforma propuesta. Para una descripción detallada de la distribución de KRAS y BRAF variantes en nuestras muestras véase la Tabla 2.
2) Optimización del análisis de diapositivas de silicio
muestras de control de tipo salvaje y reconstituido de control heterocigoto muestras (generados por la mezcla adecuada de ADN plasmídico que contiene de tipo salvaje y secuencias mutadas de los 7 mutaciones KRAS y de la variante de BRAF V600E
) se utilizaron para probar la especificidad del ensayo. Después de la optimización de la temperatura y el tiempo de hibridación, se logró una identificación correcta de todos los genotipos. Un ejemplo se ilustra en las figuras 2 y 3, donde se muestra un experimento de hibridación para la G12R KRAS y BRAF el
mutación V600E, respectivamente. En el sistema optimizado, para todas las mutaciones analizadas podríamos evidencia de que: i) las señales fluorescentes eran altos, ii) no se obtuvo ninguna hibridación cruzada, incluso para las variantes que afectan a los mismos o adyacentes posiciones de nucleótidos (Figura 2D) y iii) una se encontró una buena reproducibilidad de un punto a (mostrado por las barras de error).
barrido (a) de microarrays de la señal de fluorescencia de Cy3 correspondiente al alelo de tipo salvaje. Manchas en columna 1,2,3,4 representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. (B) de barrido de la señal de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. esquema de manchas (C) de microarrays. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het1, Het2 y Het3: muestras de control heterocigóticos para G12A, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D; mutaciones KRAS G12D; cuadrados de color gris claro representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 se utiliza como puntos de referencia. (D) la intensidad de fluorescencia relativa normalizada después de la hibridación de muestras de control conocidas con los reporteros complementarias a la variación G12R. Las barras son el promedio de la intensidad de los 6 replicados de cada muestra. Las barras de error son las desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia de cada muestra. Señal
(A) de fluorescencia Cy3 correspondiente al alelo de tipo salvaje. Manchas en columna 1,2,3,4 representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. de la señal (B) de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. esquema de manchas (C) de microarrays. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het1, Het2 y Het3: muestras de control heterocigotos; mut: homocigoto mutante muestra de control; cuadrados de color gris claro representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 se utiliza como puntos de referencia. (D) la intensidad de fluorescencia relativa normalizada después de la hibridación de muestras de control conocidas con los reporteros complementarias a la variación BRAF V600E. Las barras son el promedio de la intensidad de los 6 replicados de cada muestra. Las barras de error son las desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia de cada muestra.
3) La sensibilidad del ensayo
La sensibilidad del ensayo en proporciones diferentes de discriminación de alelos mutados se evaluó en diluciones en serie (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% mutado /de tipo salvaje) de ADN mutado mezclado oportunamente con silvestre escriba ADN. En particular, se utilizó la línea celular CCRF-CEM como referencia para KRAS mutación p.G12D (heterocigotos), la línea humana de células de carcinoma colorrectal SW620 (usado como referencia por la mutación KRAS pG12V, homocigotos), y el melanoma humano líneas de células A375 (utilizado como la fuente de homocigotos BRAF
ADN V600E). La línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 se utilizaron como de tipo salvaje de los genes KRAS y BRAF tanto. Para todas las otras mutaciones del gen KRAS se utilizaron los plásmidos mutantes que portan generados.
El límite de detección del método propuesto fue diferente para las 7 mutaciones KRAS y probados para la mutación BRAF V600E. En particular, el sistema de microarrays ha sido capaz de detectar un mínimo de aproximadamente 0,01% de los alelos mutados en un fondo de ADN de tipo salvaje para la mutación G13D, aproximadamente 0,025% de alelo mutado para la mutación G12R, 0,05% para la mutación G12C , 0,1% para la mutación G12D, 0,2% para la mutación V600E BRAF, 0,4% para el G12A y las mutaciones G12S y 0,8% para el G12V respectivamente. En la Figura 4 se muestran dos ejemplos de los resultados obtenidos para la mutación G13D KRAS y para la mutación BRAF
V600E.
Límite de detección de la mutación G13D (A) y de la mutación V600E BRAF (B) . en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het1, Het2 y Het3: muestras de control heterocigotos; números del 1 al 10: diluciones de serie, 1 = 6%, 2 = 3%, 3 = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4%, 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01%, respectivamente. Las barras son el promedio de la intensidad de los 6 replicados de cada muestra. Las barras de error son las desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia de cada muestra.
4) la validación de Ciegos
Validación del ensayo se llevó a cabo de una manera ciega mediante el análisis de 75 muestras de sujetos, ya sea positivo o de tipo salvaje de mutaciones de KRAS y BRAF, previamente caracterizada por HRM y secuenciación directa. Como ejemplo, los resultados de microarrays para el G12C mutación KRAS y para BRAF
mutación V600E para tejidos congelados se muestran en las figuras 5 y 6, respectivamente. Por otra parte, en la figura se muestran los 7 y 8 los resultados de microarrays para la mutación G12R KRAS y BRAF para
mutación V600E en muestras FFPE, respectivamente. El sistema era altamente específica en la asignación del genotipo correcto para todas las muestras. validación ciega muestra completa concordancia de los resultados (Tabla 2), con excepción esperado de muestras N.31 y N.40, que lleva el p.G13C y las variantes p.V14I KRAS, que se introdujeron expresamente para probar la especificidad del nuevo desarrollo sondas (ver Tabla 2).
(a) señal de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. (B) Esquema de la localización. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het1, Het2 y Het3: muestras de control heterocigóticos para G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V G13D, mutaciones KRAS; números del 1 al 60: sesenta muestras de ADN de tumores sólidos diferentes. marcadores grises representan las muestras positivas para la mutación G12C; cuadrados de color gris claro representan un oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. (C) Análisis de HRM de número de muestra 30 (número 2) en comparación con perfiles de fusión de muestras de control (de tipo salvaje de referencia = número 1; mutado de referencia = número 3) después de la amplificación por COLD-PCR: el comportamiento de fusión es sugestiva de la presencia de mutada de ADN en la muestra. (D) el análisis de secuenciación directa de la muestra número 30 presentada al protocolo de amplificación COLD-PCR: el electroferograma confirma la presencia de ADN mutado (G12C) en la muestra
(A) señal de fluorescencia Cy3 correspondiente a. el alelo de tipo salvaje. Manchas en columna 1,2,3,4 representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. de la señal (B) de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. (C) Esquema de la localización. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; BRAF Het1, Het2 y Het3: muestras de control heterocigóticos; mut: homocigoto mutante muestra de control; números del 1 al 60: sesenta muestras de tumores sólidos diferentes. marcadores grises representan las muestras positivas para la mutación BRAF; cuadrados de color gris claro representan un oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. señal
(A) de fluorescencia Cy3 correspondiente al alelo de tipo salvaje. Manchas en columna 1,2,3,4 representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. de la señal (B) de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. (C) Esquema de la localización. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het: muestras de control heterocigóticos para G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, las mutaciones KRAS; números del 1 al 15: quince diferentes muestras de ADN de tumor sólido FFPE. marcadores grises representan las muestras positivas para la mutación G12R; cuadrados de color gris claro representan un oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. (D) la intensidad de fluorescencia relativa para la detección de la sensibilidad del sistema evaluado para la mutación G12R. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het: muestras de control heterocigotos; números del 1 al 15: muestras FFPE. Las barras son el promedio de la intensidad de los 6 replicados de cada muestra. Las barras de error son las desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia de cada muestra. Señal
(A) de fluorescencia Cy3 correspondiente al alelo de tipo salvaje. Manchas en columna 1,2,3,4 representan oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. de la señal (B) de fluorescencia Cy5 correspondiente al alelo mutado. (C) Esquema de la localización. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het1 BRAF, Het2: heterocigotos muestras de control; mut1 BRAF, mut2: homocigoto mutante muestra de control; números del 1 al 15: quince diferentes muestras de ADN de tumor sólido FFPE. marcadores grises representan las muestras positivas para la mutación BRAF; cuadrados de color gris claro representan un oligonucleótido amino-modificado marcado con Cy3 utiliza como puntos de referencia. (D) la intensidad de fluorescencia relativa para la detección de la sensibilidad del sistema evaluado para la mutación V600E BRAF. en peso: las muestras de control de tipo salvaje; Het: muestras de control heterocigotos; números del 1 al 15: muestras FFPE. Las barras son el promedio de la intensidad de los 6 replicados de cada muestra. Las barras de error son las desviaciones estándar de la intensidad de fluorescencia de cada muestra.
Discusión
La sensibilidad y la especificidad son características fundamentales de cualquier método de diagnóstico. Altamente ensayos sensibles, capaces de detectar pequeñas cantidades de la sustancia objeto de la investigación, pueden abrir nuevas oportunidades en varias aplicaciones clínicas. En particular, la identificación de alelos mutados minoritarios dentro de un exceso de alelos de tipo salvaje que representa un problema común en el análisis de ADN del cáncer, es técnicamente muy difícil, y requiere el uso de técnicas altamente sensibles.
Dentro de este