Extracto
Hemos caracterizado un nuevo 21 amino ácido-péptido derivado de la mucosa del antro de proteínas (AMP) -18 que media la promoción del crecimiento de las células epiteliales normales cultivadas y mitiga la mucositis oral inducida por radiación en modelos animales, mientras que la supresión
in vitro
función de las células cancerosas. El objetivo de este estudio fue evaluar estos posibles efectos terapéuticos duales de péptido AMP en un modelo animal clínicamente relevante de cáncer de cabeza y cuello (CCC) mediante la evaluación simultáneamente su efecto sobre el crecimiento del tumor y la mucositis oral inducida por radiación en un modelo ortotópico de HNC . Se inyectaron células SCC-25 HNC bioluminiscentes en la lengua anterior y los tumores que se formó a continuación, se sometieron a un tratamiento de radiación focal. El tamaño del tumor se evaluó mediante un
vivo
sistema de imágenes en, y el grado de mucositis oral se comparó entre los animales tratados con el péptido AMP o vehículo (controles). La sinergia entre la terapia de radiación y péptido AMP fue sugerido por el hallazgo de que los tumores en el péptido /radioterapia cohorte de AMP demostró crecimiento inhibido frente a tumores de terapia de radiación de sólo tratados, mientras que el péptido AMP-tratamiento retrasó el inicio y la reducción de la severidad de la radiación Terapia inducida mucositis oral. Un efecto diferencial sobre la apoptosis parece ser un mecanismo por el cual AMP-18 puede estimular el crecimiento y la reparación de las células epiteliales de la mucosa lesionada, mientras que la inhibición de la proliferación de las células HNC. análisis de RNA microarrays identificado vías que están diferencialmente dirigidas por AMP-18 en HNC frente a células no transformadas. Estas observaciones confirman la idea de que las células normales y células tumorales pueden responder de manera diferente a los estímulos biológicos comunes, y que el aprovechamiento de este hallazgo en el caso de AMP-18 puede proporcionar una oportunidad clínicamente relevante
Visto:. Chen P, Mancini M, Sonis ST, Fernández-Martínez J, Liu J, Cohen PEE, et al. (2016) un nuevo péptido para el tratamiento Simultáneamente mejorada del cáncer de cabeza y cuello y Mitigación de la mucositis oral. PLoS ONE 11 (4): e0152995. doi: 10.1371 /journal.pone.0152995
Editor: Craig Murdoch, de la Universidad de Sheffield, Reino Unido
Recibido: 1 de octubre de 2015; Aceptado: 22 Marzo de 2016; Publicado: 6 Abril 2016
Derechos de Autor © 2016 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer (www.cancer.gov): CA 176032 para FGT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Biomodelos, LLC. prestado apoyo en forma de salarios de los autores MM, STS y el MFC, pero no tienen ninguna función adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores están articulados en la sección Contribuciones de autor
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. María Mancini, Stephen T. Sonis y Juan Fernández-Martínez son empleados por Biomodelos, LLC. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no alteró la adherencia de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
A pesar de su frecuencia, gravedad y sintomático y de impacto económico, no hay una intervención eficaz para la mucositis oral (OM) inducida por quimioterapia o radiación regímenes (CRT) que se usan para tratar el cáncer de cabeza y cuello (CCC) [1-4]. Clínicamente, la OM se caracteriza por la descomposición de la mucosa que resulta en extensas, profundas úlceras, dolor grave que altera la función, aumento del riesgo de infección secundaria, bacteriemia y sepsis, y la necesidad ampliado para la alimentación de gastrostomía y cuidados de apoyo ambulatoria y de hospitalización. Prácticamente todos los pacientes que reciben CRT para el tratamiento de HNC desarrollan OM al menos moderada; más de dos tercios sufren de formas severas de la enfermedad.
terapia estándar actual para la mucositis es predominantemente paliativa mientras se centró en el control del dolor y el mantenimiento de la nutrición. El único tratamiento aprobado para la mucositis hasta el momento es palifermina (Kepivance®), y su aplicación se limita a la mucositis en pacientes sometidos a regímenes de acondicionamiento antes del trasplante de células madre hematopoyéticas [5].
La complejidad de la mucositis como biológica proceso sólo se ha apreciado recientemente [6-8]. Se ha sugerido que la condición representa una interacción secuencial de células de la mucosa bucal y tejidos, especies reactivas de oxígeno, citocinas pro-inflamatorias, mediadores de la apoptosis y factores locales tales como saliva y la microbiota oral. Parece que los cambios tempranos asociados con la toxicidad de la mucosa inducida por radiación se producen dentro del endotelio y tejido conjuntivo de la submucosa [6]. En última instancia, resulta en daño y la interrupción de la barrera epitelial, el paso más crítico en el desarrollo de mucositis. función de la barrera epitelial depende en gran medida de las uniones intercelulares en los apicales-mayoría de los dominios de la membrana plasmática, es decir, las uniones estrechas (TJs) que regulan la permeabilidad paracelular a través del epitelio en los cultivos de células en monocapa y
in vivo
[9 ].
Hemos identificado y caracterizado un nuevo péptido de 21 aminoácidos derivado de los aminoácidos 77-97 de la proteína de la mucosa del antro (AMP) -18, también conocidos como gastrokine-1 (10-12) [GKN1 ], que fue descubierta inicialmente en las células epiteliales de la mucosa gástrica [10]. Tanto AMP-18 y el péptido protegen contra y acelerar la recuperación de lesiones de la mucosa en modelos animales de OM inducida por la radiación y /o quimioterapia, como se usa para tratar a pacientes con HNC [13, 14]. El péptido se puede sintetizar fácilmente, y presenta una estabilidad a largo plazo. En un modelo de ratón de OM inducida por una dosis única de radiación en el hocico, péptido AMP administra una vez al día cuatro días antes de la radiación y continuó 10 días después se evita efectivamente la pérdida completa de epitelio de la lengua observó en ratones irradiados dadas vehículo (solución salina) [13 ]. En los modelos de OM de hámster establecidos inducidas por una sola dosis de radiación, la radiación fraccionada, o radiación fraccionada junto con cisplatino para simular los tratamientos convencionales de HNC, la administración subcutánea diaria de péptido AMP retrasó la aparición de eritema de la mucosa, la reducción de la gravedad de la ulceración y acelerado por vía oral la recuperación de la mucosa en los tres modelos, probablemente en parte por sus efectos anti-apoptóticos visto en cultivos de células epiteliales y endoteliales [14].
a diferencia de otros agentes que alivian los síntomas de Code actualmente o que se utilizan actualmente para tratar la mucositis oral, el péptido AMP y humana recombinante (rh) AMP-18 parecen estar dirigidas únicamente TJs que conectan las células epiteliales adyacentes al aumentar la acumulación de proteínas TJ, lo que limita su pérdida durante la lesión, y facilitar la formación de nuevos TJs después de la lesión de la barrera mucosa [12, 15]. Este efecto TJ-mejora está estrechamente asociado con la reorganización de la actina perijunctional y formación de complejos '' de proteínas polaridad ". AMP-18 aparece para lograr sus efectos terapéuticos mediante la unión al receptor de gastrina /colecistoquinina B (Cckbr) y la activación de múltiples vías de señalización tales como MAPKs, PI3K /AKT, RhoA y PKCζ [13, 15, 16].
para continuar el desarrollo de péptido AMP como un agente terapéutico eficaz y seguro, sus efectos sobre el crecimiento de células cancerosas en la configuración de los protocolos de terapia de radiación
in vivo
fueron estudiados en un modelo de xenoinjerto utilizando células de carcinoma humano inoculados a generar tumores en ratas desnudas [14]. Se informó de que el tratamiento de radiación focal reduce significativamente el volumen del tumor como se esperaba. Inesperadamente, la administración de péptido AMP añade significativamente a la inhibición del crecimiento inducida por la radiación, lo que demuestra la propiedad supresora de tumores de AMP-18 nosotros y otros observado anteriormente [11, 17, 18]. En conjunto, estos resultados sugieren que AMP tratamiento péptido de OM no interferiría con los efectos terapéuticos de los protocolos de radiación en el tratamiento de tumores de cabeza y cuello, o promover el crecimiento de células cancerosas, pero en su lugar podría sensibilizar a las células tumorales a la radiación.
en este estudio nos propusimos determinar si AMP-18 podría sensibilizar a las células HNC a los agentes quimioterapéuticos, y también demostrar en el mismo animal, los efectos beneficiosos de la protección de la mucosa oral, junto con la supresión del crecimiento de células tumorales después de la radioterapia.
Materiales y Métodos
Materiales
sintetizados químicamente AMP péptido (LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK), un péptido codificado (GKPLGQPGKVPKLDGKEPLAK), y humana recombinante (rh) AMP-18 se prepararon por GenScript (Piscataway, NJ) como se describe anteriormente [13]. En pocas palabras, rhAMP-18 se expresa y purifica como su proteína de fusión
6-etiquetados. La secuencia de codificación para la longitud completa humano AMP-18 se clonó en un
E
.
coli
vector de expresión, pGSE3, y la proteína expresada se purificó a partir de 5 l de medio de cultivo por cromatografía en columna de afinidad. AMP péptido y rhAMP-18 resultaron ser igualmente eficaces en el desencadenamiento de las respuestas celulares como se informó anteriormente [13-15]. Medio de cultivo celular, suero bovino fetal (FBS), penicilina y estreptomicina se obtuvieron de Gibco BRL, Life Technologies (Gaithersburg, MD). El factor de necrosis tumoral (TNF) -α se adquirió de PeproTech (Rocky Hill, NJ), y otros reactivos de Sigma-Aldrich menos que se especifique lo contrario.
Cultivos celulares
Para investigar los efectos del tratamiento con el péptido AMP o AMP-18 en las células cancerosas expuestas a cisplatino, dos líneas de células HNC humanos establecidos que se muestran en los estudios preliminares para exhibir sensibilidad diferencial al cisplatino se utilizaron: SCC-25 (American Type Culture Collection, ATCC CRL1628) (Manassas, VA), que es más sensible que la SCC-61 [19]. La línea celular SCC-25 se ha mantenido en el laboratorio de los autores durante 3 años; Se establecieron células SCC-61 y autenticadas por Weichselbaum
et al
. [20-22], se recibió como un regalo, y se mantuvo durante 4 años. Las células se cultivaron en una mezcla 1: 1 de medio de Eagle modificado de Dulbecco y medio F12 de Ham que contiene bicarbonato de 1,2 g /L de sodio, 2,5 mM de L-glutamina, HEPES 15 mM y piruvato de sodio 0,5 mM, y se suplementó con 400 ng /ml de hidrocortisona, 10% de FBS, penicilina (50 U /ml) y estreptomicina (50 mg /ml), a 37 ° C en una incubadora humidificada suplementada con 5% de CO
2. SCC-25 y las células SCC-61 (2 × 10
3 /pocillo) se cultivaron en placas de 96 pocillos durante 24 h en medio que contiene 1% de FBS, y después se deja sin tratamiento, expuestos a cisplatino solamente (2 M durante SCC-25 células, 10 micras para las células SCC-61), el cisplatino en presencia de 2 g /ml de péptido AMP, o rhAMP-18 (disuelto en solución salina tamponada con fosfato, PBS, vehículo) para 48 h. La viabilidad celular se ensayó por el reactivo CellTiter-Blue usando un lector de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT). Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Humano, adulto, (baja concentración de) Calcio, elevada temperatura (HaCaT) queratinocitos de la piel, una línea celular no transformada utilizada para modelar normal de epitelio escamoso estratificado de la mucosa oral [23], se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) y se mantuvieron en medio de Dulbecco modificado de Eagle con FBS, penicilina y estreptomicina como se describe [13] durante 5 años. Oral TERT-2 queratinocitos inmortalizados fueron considerados como un modelo celular para comparar con cáncer oral [24], pero se eligió la línea celular HaCaT porque ha sido más ampliamente utilizado para este propósito.
Creación del modelo ortotópico de HNC en ratones desnudos
Para estudiar los posibles efectos sinérgicos de péptido AMP en limitar el crecimiento de las células cancerosas al tiempo que protege contra la OM en el mismo animal, se utilizó un modelo ortotópico de HNC. Los tumores en la lengua se generaron, se evaluó su tamaño usando un
vivo sistema de imágenes
en (IVIS), y se comparó el grado de OM inducida por la radiación entre los animales tratados con el péptido AMP o vehículo (controles). El uso de animales fue aprobado por Biomodelos 'Institucional Cuidado de Animales y el empleo (12-1016-01). La Oficina del número de aseguramiento de los Animales de Laboratorio Bienestar es A4591-01.
Sobre la base de
in vivo
estudios preliminares, SCC-25 células fueron marcadas con un doble bioluminiscente lentiviral y el vector de imagen fluorescente GFP-UBC -T2A-luciferasa (LUC) (Sistema Biosciences, Inc., Mountain View, CA), y se inyectan en la lengua anterior para formar tumores. Estas células bioluminiscentes SCC-25, que se refiere como SCC-25-LUC, permiten
selección in vitro
de células positivas por clasificación de citometría de flujo utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) y la monitorización no invasiva de la dinámica celular que utilizan una
in vivo
sistema de imagen (IVIS) (Perkin Elmer) para medir el tamaño del tumor. células SCC-25-luc fueron ordenados 3 veces por BD FACSAria (BD Biosciences), de modo que las células GFP-positivas eran & gt; 95% (datos no mostrados). La sensibilidad y la precisión de
in vitro
y
in vivo
monitoreo celular ofrece varias ventajas sobre los métodos tradicionales que requieren los animales se sacrifican y análisis histológico. Además, las correlaciones histopatológicas de los cambios clínicos evaluados en el modelo han sido ampliamente documentado [13, 25], por lo que la histología no era una parte de este estudio.
ratones desnudos atímicos (Foxn1
nu ) (edad 6 a 8 semanas, peso corporal 29,5 ± 2,0 g) fueron adquiridos de Charles River Laboratories. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y 1 x 10
se inyectaron 6 células SCC-25-luc en suspensión en 30 l de 1x HBSS directamente en la lengua anterior utilizando un ml jeringa 0,1 tuberculina con una aguja de calibre 30, como se describe por Myers
et al. [26]. Después de 21 días para permitir el crecimiento del tumor, un total de 32 ratones se asignaron al azar en 4 grupos (8 ratones /grupo) sobre la base de una evaluación cuantitativa del tamaño del tumor como se determina por el flujo total de cada tumor medido por IVIS de formación de imágenes [27].
El día de la aleatorización se designó el día 0. Los animales del grupo 1 no fueron tratados, Grupo 2 ratones recibieron vehículo (PBS), y los Grupos 3 y 4 recibieron péptido AMP a una dosis de 25 mg /kg una vez al día por vía subcutánea (sc) de inyección. En el Día de Estudio 4, los animales de los grupos 2 y 4 se les dio una sola dosis aguda de 30 Gy de radiación dirigida a la lengua para el tratamiento de los tumores e inducir la OM. El modelo aísla el tejido diana (espiga) con un blindaje de plomo, lo que evita la toxicidad sistémica. Después de la administración de la anestesia, los ratones se irradiaron con el uso de una fuente de 160 kilovoltios potencial (18,75-ma) a una distancia focal de 15 cm, endurecida con un sistema de filtración de 3,0 mm Al. El tratamiento con péptido AMP o vehículo se continuó durante 14 días.
Los animales fueron anestesiados, sus lenguas extruyen suavemente usando un fórceps y se obtuvieron fotografías para documentar la progresión del tumor. El crecimiento del tumor se evaluó y se comparó en los días 5, 8, 10 y 14 utilizando IVIS después de la inyección de D-luciferina. Después se tomaron fotografías, OM se anotó clínicamente, y los animales fueron imágenes utilizando el sistema IVIS. Antes de la formación de imágenes, los ratones fueron inyectados con 0,1 ml /20 g de peso corporal de 15 mg /ml de D-luciferina-K
+ sustrato bioluminiscente en PBS. Diez minutos después de la inyección, los ratones fueron anestesiados y colocados en el IVIS® Lumina la máxima sensibilidad para la exposición hasta 5 minutos para detectar bioluminiscencia con un filtro de emisión abierta. Las imágenes guardadas se cargaron en escalas de análisis de software y de color vivo IMAGE® fueron agrupados en base a la luminosidad máxima y mínima (fotones /segundo /cm
2 /estereorradián). regiones idénticas de interés se elaboraron para cada animal y se determinó el flujo total en términos de fotones /segundo para cada región de interés.
La mucositis oral
El inicio y la progresión de la OM se puntuó usando clínicamente una escala de seis puntos bien establecida: Grado 0, no hay anomalías. Grado 1, leves cambios en la mucosa que se caracterizan por áreas de eritema leve, mucosa intacta. Grado 2, mucositis leves definidos por áreas de eritema de moderado a severo y necrosis del epitelio superficial, de tal manera que puede haber descamación leve, pero la base del epitelio está intacto. Grado 3, mucositis moderada se caracteriza por la formación de úlceras franca. Las úlceras suelen tener áreas de necrosis con coloración amarillenta asociados /gris con la formación seudomembranas. Superficie total de ulceración ≤ 25% del área de superficie de la lengua. Grado 4, mucositis severa con la formación de úlceras que afecta a 25% a 50% de la mucosa lingual. eritema marcado y la formación seudomembranas. Pérdida de la flexibilidad. Grado 5, la formación de úlceras graves de la mucositis prácticamente todas las áreas de la mucosa en situación de riesgo. Pérdida de movilidad y flexibilidad [25, 28, 29]. Decenas de 1 y 2 indican las fases leves de la mucositis. mucositis ulcerativa es característico de los grados 3-5 con los grados 3 y 4 representan las fases graves de la enfermedad. Imágenes representativas de esta escala se definen en la figura 1. Después de puntuación clínica visual, se tomó una fotografía de la mucosa oral de cada animal utilizando una técnica normalizada. Al final del experimento, las fotografías fueron contados al azar y se puntuaron por dos observadores independientes, formados que clasifican las imágenes en modo ciego utilizando la escala descrita anteriormente (puntuación ciego). Para cada fotografía, la puntuación ciego real se basa en la media de las puntuaciones de los 2 observadores. Sólo se informa de la puntuación de la evaluación ciega, fotográfico y utilizados para los análisis estadísticos.
Imágenes representativas de la mucositis inducida por radiación utilizada para la puntuación se muestran. Consulte los detalles en los métodos.
Los animales fueron pesados y controlados para todos los días de la salud general. Además de la dieta estándar, todos los animales se les dio alimentos blandos altamente apetitosa en sus jaulas. cambio de peso grupo se registra como un cambio porcentual medio de peso.
dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) e inmunotransferencia Ensayo de la caspasa 3 Escisión
Para determinar el papel de la apoptosis, un conducto para dispares AMP-18 efectos sobre las células cancerosas epiteliales y HNC normales, la caspasa 3 de escisión se utilizó como índice de la apoptosis de las células y se compara en no transformado HaCaT y HNC SCC-25 células expuestas a TNF-α mediante inmunotransferencia. Para preparar lisados de células, se lavaron los cultivos y después se recogieron en PBS helado por raspado de la monocapa con un levantador de célula. Las células desprendidas se sedimentaron a 4 ° C y se extrajeron en hielo durante 30 min en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% de desoxicolato de sodio, NaCl 150 mM, NaF 100, 10 % de glicerol, EDTA 10 mM) que contiene inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (ortovanadato de sodio 2 mM, 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 50 mg /ml de antipaína, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml de leupeptina, y 1 mg /ml de pepstatina). Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación a 14000 ×
g
durante 15 min a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó por ensayo BCA (Pierce).
Para los ensayos de inmunotransferencia, de 30 a 50 g de proteína /carril se resolvió por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas Immobilon (Millipore, Bedford, MA), seguido de bloqueo con 5% de albúmina de suero bovina en TBST (20 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de Tween 20, a pH 7,5), y se incubaron con anticuerpos designados. Después de la incubación con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios, bandas inmunorreactivas se visualizaron usando quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences). Cuando reprobed, blots fueron despojados primero con un tampón que contiene 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, y 0.1 M 2-mercaptoetanol. Las imágenes se analizaron por densitometría. Las inmunotransferencias se muestran en la figura representan uno de al menos tres experimentos.
ARN análisis de microarrays La comparación no transformadas y células HNC tratados con AMP-18
Para definir el impacto biológico diferencial y pertinencia de la AMP 18 en el tejido normal y tumoral, y para identificar objetivos de genes putativos vía que podría mediar los efectos terapéuticos de doble comparamos su efecto sobre la expresión génica de no transformado cultivadas (HaCaT) o células de carcinoma de células escamosas tratados con AMP-18.
Nosotros [13, 14] y otros [30 a 34] han utilizado la piel no transformado línea de queratinocitos HaCaT inmortalizada humana [23] para modelar el epitelio de la mucosa oral y para la comparación con las células de cáncer de cabeza y cuello escamosas, mientras que por vía oral inmortalizada terc-2 queratinocitos han sido utilizados con menos frecuencia para modelar mucositis oral.
ARN total fue extraído a partir de células HaCaT SCC-61 y, con o sin AMP-18 de tratamiento, usando el kit RNeasy (Quiagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La integridad del ARN y la concentración se evaluaron utilizando un ARN total de Agilent Bioanalyzer 2100 se transformó en biotina cRNA usando el Kit Illumina® TotalPrep ™ -96 de amplificación del ARN (Ambion, nº de cat: 4393543). El cRNA se hibrida con Illumina matrices HumanHT12v4 utilizando Illumina proporciona protocolos y digitalizadas mediante un HiScan Illumina en la Universidad de Chicago laboratorios de Genómica.
Uso de datos de microarrays de HaCaT y SCC-61 células obtenidas a las 2 horas y 24 horas después de la exposición a AMP-18 (y controles sin tratamiento), se utilizó un enfoque que optimiza un componente supervisado inicial con la subsiguiente clasificación jerárquica estadísticamente conducido. Los genes que eran más discriminatorio entre los dos grupos se clasifican de acuerdo con su valor discriminatorio como se define por la relación de su de Fisher en el que la precisión de la predicción de los diferentes conjuntos ordenados reducidos se determinaron utilizando un algoritmo de función recursiva de eliminación hacia atrás. Este procedimiento elimina los genes redundantes o irrelevantes para producir el conjunto más preciso de los genes con el mayor valor predictivo. A continuación, evaluaron los genes expresados diferencialmente más para la atribución de la enfermedad, la asociación de vía, y la ontología de genes usando software GeneAnalytics y probamos asociaciones funcionales /fenotípicas utilizando VarElect [8, 35, 36]. Los 20 genes expresados diferencialmente en SCC-61 y las células HaCaT tratados con AMP-18 durante 2 horas se muestran en la Tabla S1.
Análisis estadísticos
La mucositis se anotó utilizando las fotografías ciego, comenzando en el día 4, y por cada día después de eso. Las diferencias estadísticas entre los grupos de tratamiento se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney suma de rangos y análisis de chi-cuadrado con un valor crítico de 0.05. El efecto del tratamiento con fármaco sobre la mucositis en comparación con el control del vehículo se evaluó de acuerdo a los siguientes parámetros: 1. La diferencia en el número de días en los ratones de cada grupo tenían mucositis grave (puntuación ≥ 3) fue analizado. En cada día se puntuaron los animales (días de evaluación), el número de animales con una puntuación de mucositis cegado de ≥ 3 en cada grupo de tratamiento se comparó con el grupo de vehículo. Las diferencias se analizaron en un diario, así como una base acumulativa. El éxito del tratamiento se determinó por un número estadísticamente significativo menor de ratones con esta puntuación en un grupo de tratamiento de drogas, frente al vehículo, tal como se determina por análisis de chi-cuadrado. 2. Se determinaron las diferencias en las puntuaciones de la suma de rangos de mucositis diarias en los grupos de tratamiento en comparación con el grupo de vehículo. Para cada día de evaluación las puntuaciones del grupo de vehículo se compararon con la de los grupos tratados mediante el análisis de suma de rangos no paramétrica. El éxito del tratamiento se determinó por una diferencia estadísticamente significativa reducción de las puntuaciones en el grupo tratado en dos o más días a partir del día 4 al día 14. Un ANOVA de una sola vía o ANOVA sobre los rangos se utilizó para evaluar el área bajo la curva para pesos de los animales y mediciones de IVIS. Los datos se analizaron con el software Minitab (Minitab, State College, PA). Los grupos se compararon por dos colas
t
prueba o, para más de dos grupos, por el análisis de la varianza. Se consideraron los
P ≤ 0,05
significativa.
Resultados
Efectos inhibidores de AMP Péptidos y rhAMP-18 en células HNC
Para investigar los efectos de la AMP péptido o AMP-18 en células HNC en cultivo, cabeza humana y el cuello carcinoma de células escamosas SCC-25 (Fig 2, panel a) y SCC-61 (panel B) las células se dejaron sin tratar, se expone a AMP-18 (2 g /ml), cisplatino (2 M para SCC-25 células, 10 mM para las células SCC-61) solamente, cisplatino en presencia o ausencia de péptido AMP o rhAMP-18. La viabilidad celular se evaluó con los reactivos de ensayo de viabilidad celular CellTiter-Blue® (Promega) utilizando un lector de microplacas. AMP-18 solo inhibe el crecimiento de SCC-25 (P = 0,02) y las células en un 10-15% SCC-61 (P = 0,04) (Figura 2). El cisplatino crecimiento significativamente inhibido de las dos líneas celulares: células SCC-25 en un 25%, y las células SCC-61 en un 50% en comparación con los cultivos de control (P & lt; 0,001). La adición ya sea de péptido AMP o rhAMP-18 amplificaron la citotoxicidad del cisplatino mediante la inhibición de crecimiento de SCC-25 células por & gt; 30% (péptido AMP, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), y las células SCC-61 por 65 % (P & lt; 0,05) y 75% (P & lt; 0,02)., respectivamente
SCC-25 (a) o SCC-61 células (B) se dejaron sin tratar, se expone a AMP-18 (2 g /ml), cisplatino (2 M para SCC-25 células, 10 mM para las células SCC-61) solamente, cisplatino en presencia de 2 g /ml de péptido AMP, o rhAMP-18 para 48 h. La viabilidad celular se ensayó por el reactivo CellTiter-Blue. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Los valores son medias ± SE. La adición ya sea de péptido AMP o rhAMP-18 amplificaron la citotoxicidad del cisplatino mediante la inhibición de crecimiento de SCC-25 células por & gt; 30% (péptido AMP, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), y las células SCC-61 por 65 % (P & lt; 0,05) y 75% (P & lt; 0,02), respectivamente
El crecimiento del cáncer de péptidos AMP tratamiento inhibe de forma aditiva con radiación
la anterior evidencia que el péptido AMP podría sensibilizar a las células cancerosas. a la radiación en un modelo de xenoinjerto [14] y dos líneas de células HNC humanos a cisplatino en cultivo (Fig 2), junto con nuestros estudios en ratones y hámsters que el tratamiento con el péptido tuvo efectos clínicos beneficiosos en por radiación y cisplatino inducida OM [ ,,,0],13, 14], nos llevó a preguntar si estos efectos duales del péptido AMP se pudo demostrar en un modelo ortotópico de HNC en el mismo animal. Se estudiaron cuatro grupos de animales: 1. no tratado; 2. PBS (vehículo) y la radiación; 3. péptido AMP; y 4. péptido AMP y la radiación.
Para determinar el impacto del tratamiento con el péptido AMP sobre la progresión tumoral con y sin terapia de radiación, se evaluaron los tumores de todos los animales mediante el sistema de IVIS. En los ratones no irradiados, los tumores ortotópicos en la lengua crecieron progresivamente, y la administración de péptido AMP no cambiaron de manera significativa el tamaño del tumor (Grupos 1 y 3) (Fig 3). En los días 5 y 8 valores de IVIS para no tratada (6,59 × 10
7 ± 9,6 × 10
6) y se trató péptido AMP (6,50 × 10
7 ± 8,67 × 10
6) no fueron estadísticamente diferente, como fue también el caso en los días 10 y 14 cuando los valores de IVIS para tratar (1,78 × 10
8 ± 2,47 × 10
7) y AMP péptido tratado (1,61 × 10
8 ± 2,32 × 10
7) no fue diferente. En los ratones de radiación dada (30 Gy), el tamaño del tumor, medido como media resplandor IVIS, seguido creciendo con PBS (vehículo) de tratamiento (Grupo 2), pero se mantuvo sin cambios con el tratamiento péptido AMP entre los días 5 y 8 y los Días 10 y 14 ( Grupo 4) (Fig 4). El tamaño del tumor (media ± SE) en ratones irradiados, péptido AMP dado en comparación con los ratones que recibieron PBS, se redujo significativamente (P = 0,03) cuando se evaluó en los días 10 y 14 (Fig 4). Esta observación sugirió que el péptido AMP no interfirió con la capacidad de la radiación enfocado a inhibir el crecimiento celular, sino más bien se detuvo el crecimiento de células cancerosas.
Un modelo ortotópico de cáncer de HNC se estableció mediante la inoculación de bioluminiscente SCC-25-LUC células en la lengua anterior de ratones desnudos. El tamaño del tumor en diferentes grupos se evaluó y se comparó en los días 5 y 8, así como los días 10 y 14 utilizando IVIS después de la inyección de D-luciferina. Los ratones en el Grupo 1 y el Grupo 3 no fueron irradiados, mientras que los animales en los Grupos 2 y 4 recibieron 30 Gy en el día 0 del estudio. El tratamiento con PBS (Grupo 2) o el péptido AMP (Grupo 4) se administró por inyección s. do. una vez al día. En los ratones irradiados, el tratamiento con el péptido AMP se asoció con mucho menor resplandor IVIS comparación con el tratamiento con PBS, lo que indica que el péptido AMP redujo el crecimiento del tumor. se muestran imágenes representativas de IVIS de los tumores de la lengua de 32 ratones.
animales irradiados fueron tratados con el péptido AMP o PBS, y IVIS radiación se midió en los días 5 y 8, y luego en los días 10 y 14. medias ± sE fueron comparados. En los ratones que recibieron PBS, IVIS resplandor pareció aumentar entre los días 5 y 8 y 10 y 14, mientras que la luminosidad en los animales tratados con el péptido AMP se mantuvo sin cambios entre los días 5 a 14. En los días 10 y 14, el tratamiento con el péptido AMP reducido significativamente el tamaño del tumor en comparación con el tratamiento con PBS (* P = 0,03). En los ratones no irradiados, los tumores ortotópico en la lengua crecieron progresivamente; administración del péptido AMP no cambió significativamente el tamaño del tumor (no se muestra).
péptido AMP no mostró ningún efecto adverso sobre el peso corporal. Los ratones en los 4 grupos exhibieron pérdida de peso después de los tumores se establecieron en la lengua que fue más marcado en los animales irradiados (datos no mostrados).
Efectos terapéuticos de AMP péptido sobre la radiación inducida por Oral Mucositis
de acuerdo con los resultados de estudios anteriores, el péptido AMP mitigó la mucositis oral inducida por radiación desarrollo [14]. Si bien el control radiada (PBS) todos los animales desarrollaron mucositis ulcerativa (Grupo 2) el día 12, sólo el 37,5% de los animales tratados con AMP (Grupo 4) fueron tan afectada (P = 0,03), mientras que en el día 11, ulceración de la mucosa apareció en el 62,5 % en el Grupo 2, pero ninguno dado péptido AMP (P = 0,003) (Fig 5). Por lo tanto, el péptido AMP retrasó la aparición de la mucositis ulcerativa y favorablemente afectada su duración.
La irradiación de la lengua y la mucosa oral fue seguido por tratamiento diario con péptido AMP o vehículo (PBS). mucositis oral ulcerativa que se desarrolló fue marcado como se describe en
Métodos
. Una puntuación de 3,0 mucositis (línea discontinua) indica ulceración de la mucosa que se correlaciona con la mucositis oral humana significativos. Los animales tratados con el vehículo alcanzaron una puntuación de 3 en el día 12, mientras que los ratones tratados con péptido AMP no lo hicieron. puntuación de mucositis fue significativamente menor en los Días 11 (* p = 0,003) y 12 (** p = 0,03), pero no el día 13 (P = 0,1) en los animales tratados con el péptido AMP en comparación con los que recibieron el vehículo. Los valores son medias ± SE.
AMP-18 inhiben la apoptosis en HaCaT pero no en células HNC
Los recientes resultados de nuestros estudios [10-15] y otros [17] sugieren que AMP-18 tiene efectos pleiotrópicos. AMP-18 estimula el crecimiento y es anti-apoptótica en las células epiteliales incluyendo queratinocitos HaCaT [13]. También parece funcionar como un supresor de tumores [37], posiblemente mediante la inducción de la apoptosis [38], la inhibición de la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y la migración de células de cáncer [39], y /o la inducción de la senescencia celular [40]. De hecho, la expresión de AMP-18 está regulado por disminución o ausente en tejido gástrico del cáncer [11, 17, 18], y disminuye a medida que la gastritis crónica progresa a atrofia y metaplasia [40, 41].
Para determinar si la apoptosis podría