Extracto
A pesar de la notable mejora de postoperatorio 5-FU basado en,: PLOS ONE la tasa de recaídas de los pacientes con cáncer gástrico sometidos a resección curativa seguido por la quimioterapia adyuvante sigue siendo considerable. Por lo tanto, es importante para identificar marcadores de predicción de la eficacia quimioterapéutica de 5-FU. Recientemente hemos identificado NF-kB como un biomarcador de predicción de candidatas recaída en el cáncer gástrico. Para evaluar la significación biológica de NF-kB en el contexto de la quimioterapia basada en 5-FU, se analizó la respuesta biológica NF-kappa B-dependiente de tratamiento con 5-FU en líneas celulares de cáncer gástrico. Se identificaron siete genes inducidos por el tratamiento con 5-FU de manera NF-kappa B-dependiente, cinco de los cuales son conocidos p53 objetivos. Desmontables de
RELA
, que codifica la subunidad p65 de NF-kB, disminuyó tanto los niveles de proteína p53 objetivo y p53. Por el contrario, el NF-kappa B no se vio afectada por
TP53
caída. Se demostró además que las líneas celulares que llevan Pro homozygosity /Pro en codon72 de exón 4 p53, que es importante para NF-kB de unión a p53, son más resistentes a 5-FU que aquellos con Arg /Arg homozygosity. Concluimos que NF-kB juega un papel importante en la respuesta al tratamiento con 5-FU en líneas celulares de cáncer gástrico, con una posible función compensatoria de p53. Estos resultados sugieren que NF-kB es un potencial marcador de predicción de 5-FU-quimiosensibilidad que puede reflejar las vías de respuesta al estrés inducido-5-FU, incluyendo p53
Visto:. Endo H, Nishizuka SS, Kume K, Ishida K, Katagiri H, Ishida K, et al. (2014) una función compensatoria de NF-kB de p53 en respuesta a la quimioterapia basada en 5-FU para líneas celulares de cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (2): e90155. doi: 10.1371 /journal.pone.0090155
Editor: Thomas G. Hofmann, el Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Alemania |
Recibido: 17 de octubre de 2013; Aceptado 28 de enero de 2014; Publicado: 27 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Endo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por MIAST (innovación médica por Ciencia y Tecnología avanzada) del proyecto de subvención-en-Ayudas a la estratégica Centro Médico de Investigación de Ciencias del Ministerio de Educación, Cultura, Ciencia y Tecnología de Japón, 2010-2014 (SSN, K.Ku. , GW); y la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) (11,863,286) (S.S.N.), y (12877914) (K.Ko.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mayoría de cáncer gástrico en el mundo se diagnostica en Asia Oriental [1], en el que el tratamiento estándar para el cáncer gástrico avanzado sigue siendo la cirugía y la quimioterapia. Recientemente se han desarrollado regímenes de quimioterapia adyuvante después de la gastrectomía curativa para el cáncer gástrico avanzado han hecho notables progresos en cuanto al control de la supervivencia sin recaída y libre de la enfermedad, sobre todo en la población japonesa [2], [3]. Sin embargo, el 30-40% de los pacientes aún experimentan recaídas a pesar de recibir quimioterapia después de la gastrectomía curativa [3], lo que sugiere que la selección de pacientes basándose en la información molecular podría ser potencialmente muy eficaz para aumentar no recaída y las tasas de supervivencia de la quimioterapia mediada.
para seleccionar a los pacientes con cáncer gástrico que podrían beneficiarse de la quimioterapia, es importante comprender las sensibilidades individuales antes de la quimioterapia [4]. la quimioterapia adyuvante postoperatoria del cáncer gástrico ofrece la oportunidad de probar los tumores obtenidas de pacientes, antes de recibir quimioterapia. En un intento de identificar biomarcadores potenciales en este contexto a nivel de proteínas, se informó anteriormente un sistema de cribado panel de línea celular utilizando la expresión de proteínas cuantitativa perfiladora de fase inversa arrays de proteínas (RPPAs) [5], [6] combinada con una por células sistema de ensayo basado en el crecimiento basado en el concepto de grupo de selección línea celular NCI-60 [7], [8]. Se aislaron biomarcadores candidatos en base a los coeficientes de correlación de expresión de la proteína y la matriz de sensibilidad a los fármacos y luego validado adicionalmente usando especímenes retirados quirúrgicamente [9]. Sobre la base de este enfoque se identificaron dos biomarcadores a nivel de proteínas, incluyendo NF-kappa B y JNK, cuyos niveles tenido buena correlación con la respuesta a la quimioterapia. La mayor expresión de NF-kB parecía que se correlaciona con un pronóstico más pobre, mientras que JNK mostró una correlación inversa. Estos marcadores también fueron validados a nivel molecular utilizando líneas celulares de cáncer gastrointestinal. Se ha demostrado que desmontables siRNA mediada por p65 afecta casi exclusivamente a sensibilidad 5-FU entre los fármacos quimioterapéuticos que se utilizan actualmente; pero esto no es el caso de JNK knockdown [9]. Por lo tanto, concluimos que NF-kB juega un papel dominante en el tratamiento de 5-FU y JNK puede ser un indicador de la inflamación crónica de la mucosa gástrica fondo [10]. Como una extensión de este estudio de validación, hemos tratado de explorar estas proteínas funcionalmente y clarificar el papel de NF-kB como un factor de transcripción inducible por estrés durante el tratamiento con 5-FU. También se evaluó el papel de p53 después de la transactivación mediada por 5-FU de NF-kappa B [10], [11], ya que es bien sabido que p53 se activa en respuesta a este agente genotóxico [12]. En este estudio se presenta un potencial papel compensatorio de NF-kB por p53 a través del análisis de un p53-NF-kB sitio polimórfico de unión, codón 72 de p53. En conjunto, estos hallazgos sugieren que NF-kB /p53-codon72 podría ser un biomarcador robusto para la sensibilidad de 5-FU.
Materiales y Métodos
Líneas Celulares
Nueve gástrica humana líneas celulares de cáncer, incluyendo Kato-III, KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, GSS, GCIY, y MKN45 se obtuvieron del banco de células RIKEN de bio Center. TVN-1 era un
novo línea celular de Windows que estableció en nuestro laboratorio a partir de un japonés paciente con cáncer gástrico macho que habían recaído carcinomatosa peritonitis. El uso de la línea 1-TVN célula ha sido aprobado por el Consejo Médico de la Universidad de Iwate de Revisión Institucional (H25-116, y HG H25-15) y la familia del paciente donante que había muerto en el momento del establecimiento de la línea celular con una consentimiento informado por escrito con respecto a la toma de muestras y haciendo que la línea celular. Las células fueron cultivadas a 70-80% de confluencia en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2.
Preparación de la célula lisado
Las células fueron cosechadas por centrifugación y sedimentos celulares se lisaron usando tampón que contiene Rosa urea 9 M (Sigma-Aldrich, St Louis, MI, EE.UU.), 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1 -propanesul-fonate (CHAPS; Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Alemania), 2% de pH 8,0 a 10,5 Pharma-Lyte (GE Healthcare Japón, Tokio, Japón), y 65 mM de DTT (GE Healthcare Japón, Tokio, Japón) como descrito anteriormente [5], [13].
Western Blot
SDS-PAGE se realizó mediante electroforesis NuPAGE 4-12% Bis-TrisGel (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), XCell Sure Lock Mini-celular (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), y el Poder PAC HC (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Las proteínas resueltas en el gel se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa utilizando el Sistema de iBlot seco Blot (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las membranas resultantes se bloquearon con iBlot (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 5% y 0,1% de Tween-20 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) en TBS (TBST) durante 1 h. Las membranas fueron incubadas con los anticuerpos primarios indicados, incluyendo pan-actina, p53 (Thermo Scientific, Kalamazoo, MI, EE.UU.); p21, proyecto TIGAR, y PUMAα /β (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE.UU.); y NF-kappa B, α-tubulina, y PCNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japón). A continuación, las membranas se lavaron dos veces durante 5 min con TBST, se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 1 h, y después se lavaron dos veces durante 5 min en TBST. reactivos de detección de quimioluminiscencia se incubaron con las membranas durante 1-5 minutos y luego las imágenes fueron adquiridas utilizando Image Quant LAS500 (GE Healthcare Japón, Tokio, Japón). Para evaluar la inducción de proteínas de 5-FU, transferencias Western se cuantificaron usando ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
inmunocitoquímica
Las células fueron cultivadas a 70-80 % de confluencia en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS en 4-cámara portaobjetos de vidrio tratadas con cultivo de tejido de vasos de poliestireno y después se trató con 5-FU tal como se indica en cada experimento. Después de que las células se expusieron a 50 mM de 5-FU durante 4 h para ver una respuesta transcripcional temprana, que se fijaron en paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 en PBS, y se tiñeron con DAPI (0,6 M DAPI, 50 l de RNasa, y 5 ml de PBS) a temperatura ambiente durante 12 min. Las células fueron incubadas con los siguientes anticuerpos primarios: p65 anti-NF-kB, fosfo-NF-kB p65 (Ser536), y fosfo-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japón), y p53 (Thermo Scientific , Kalamazoo, MI, EE.UU.). Finalmente, las células se incubaron con Alexa Fluor488- o anticuerpo secundario conjugado 568 (Life Technologies Japan, Tokyo, Japón). Se utilizó un microscopio de fluorescencia BX43 (Olympus, Tokio, Japón) para la adquisición de imágenes.
perfiles de expresión génica
Se recogieron las células MKN45 después del tratamiento con o sin 50 mM de 5-FU durante 4 h . a continuación, se extrajo el ARN de las células recogidas y perfiles de expresión génica se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Claro Imprimir G3 humano GE8 × 60 K, Agilent Technologies Japan, Tokyo, Japón). Los datos en bruto se normalizaron primero dividiendo cada señal de la sonda por la 75
percentil de toda la señal. Cada experimento de microarrays se realizó por duplicado resultante en dos de control y dos conjuntos de datos de microarrays de 5-FU de tratamiento. Para identificar los genes que son expresados diferencialmente en respuesta a 5-FU, cada conjunto de datos de control se comparó por separado a cada tratamiento con 5-FU establecer comparaciones (4). Genes expresados diferencialmente fueron aquellos que tenían un cambio en la expresión & gt; 2 veces en cada comparación. Identificamos el conjunto final de 10 genes expresados diferencialmente en función de su frecuencia en las comparaciones 4 [14]. Para confirmar la reproducibilidad de estos cambios de expresión, cuantitativa en tiempo real RT-PCR de 5-FU muestras tratadas a las 0, 4, 8, 12, y 24 h se realizó para cada gen. Primer secuencias se enumeran en la Tabla S1. Para los genes inducidos por 5-FU, se realizó un análisis de los sitios de unión del promotor utilizando el algoritmo JASPAR (JASPAR, http://jaspar.genereg.net/). Se obtuvo una secuencia de promotor de 1000 pb específico a los respectivos genes de elemento regulador de la transcripción de base de datos (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/TRED/tred.cgi?process=home). sitios de unión se predijo mediante el escaneo de secuencias promotoras con las secuencias de consenso de NF-kB y p53 con un 70% de umbral de puntuación de perfil.
RELA y derribo de genes TP53
Las células fueron cultivadas a 70-80 % de confluencia en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de SFB en placas de cultivo celular de 6 pocillos y después se trató con NF-kB p65 o p53 siRNA (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo, Japón) durante 48 h. Brevemente, desmontables se realizó usando Trans IT-TKO (Mirus Bio Corporation, Madison, WI, EE.UU.) a una concentración de 3% durante 10 min a temperatura ambiente. Las concentraciones apropiadas de siRNAs para cada línea de células se mezclaron con las soluciones IT-TKO trans seguido de una incubación de 20 min a temperatura ambiente. Las concentraciones de ARNsi utilizados fueron los siguientes: 100 nM siRNA p65 para MKN45 y las células MKN74, y 150 nM para las células GSS y Kato-III; y 100 nM p53 siRNA para MKN45, y las células GSS, y 50 nM para células MKN74. Después de 48 h, las células se recogieron y los niveles de proteína se analizaron por Western blot. Dos construcciones de siRNA que poseen diferentes secuencias para el mismo gen diana se utilizó para cada gen para confirmar la especificidad caída. la distribución del ciclo celular se evaluó mediante el citómetro de Tali basada en imágenes (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Para ver el efecto máximo de siRNA sobre la respuesta de 5-FU, el fármaco se añadió 48 h después de siRNA se transfectó, y se midió el ciclo celular respectiva después de 24 h de incubación con 5-FU. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.
TP53 de estado y Codon72 Variant
Se extrajo el ADN a partir de líneas celulares de cáncer gástrico utilizando QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Japón, Tokyo, Japón). La amplificación por PCR para el
p53 se realizó
exón 4 codon72 variante (Tabla S1) y el
p53
mutación exon5-9 como se describe anteriormente [15], [16]. Cada producto de la PCR fue secuenciado usando el analizador genético ABI PRISM 3030xl (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Secuenciación resultados se analizaron mediante FinchTV (PerkinElmer Japón, Tokio, Japón) y MEGA 5.1 Beta 3 [17].
Crecimiento Ensayo de represión
Diez mil células por pocillo fueron sembradas en un 96 pocillos microplaca. Veinticuatro horas más tarde las células fueron tratadas con 5-FU durante 24 h. Después del tratamiento con 5-FU, se midió la fracción de células vivas usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japón) y un lector de microplacas 941 TriStar LB (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). El cincuenta por ciento de concentración de inhibición del crecimiento (GI
50) se calculó utilizando el software Prism (Graph Software Pad, La Jolla, CA, EE.UU.). El IG
50 valores se utilizan para determinar las correlaciones entre la eficacia y los niveles de proteína 5-FU basado en el coeficiente de correlación producto-momento de Pearson (
r
).
Resultados
fluorouracilo induce NF-kB
para confirmar el comportamiento típico de NF-kB en respuesta al tratamiento con 5-FU, se trazó la localización subcelular de NF-kB en el MKN45 (p53 de tipo salvaje), MKN74 (p53 mutante ), Servicio General de Seguridad (p53 mutante), y Kato-III (p53 homocigótica suprimido) líneas celulares. análisis de transferencia de Western con las fracciones nucleares y citoplasmáticas demostró que 5-FU inducida NF-kappa B en los dos compartimentos en MKN45 pero no se observó en líneas celulares p53 mutantes (Fig. 1A-D). También se examinó el efecto de 5-FU en NF-kB localización en las células por inmunocitoquímica (Fig. 1E-H). NF-kappa B localizado en el citoplasma en no tratado MKN45, mientras que 5-FU tratamiento provocó un aumento de NF-kB de localización nuclear (Fig 1E.); sin embargo, no se observó aumento en las líneas celulares mutantes de p53 (Fig. 1F-H). También se observó un aumento drástico en fosforilada NF-kappa B (p65 Ser536) en el núcleo de MKN45 tratados con 5-FU, lo que indica NF-kB se transactivated por 5-FU (Fig. 1E). Se observó la localización nuclear constitutiva y la fosforilación de p53 de vez en cuando en MKN74 pero no parecen ser inducida por 5-FU (Fig. 1G). localización nuclear de p53 fue inducida por 5-FU en GSS, pero la señal era débil activada (Fig. 1H).
A-D, Western blot de la inducción de NF-kB en el núcleo y la citoplasma por 50 mM de 5-FU durante 4 h para las líneas celulares indicadas. PCNA y α-tubulina se utilizaron como los controles de carga nucleares y citoplasmáticas, respectivamente. E-H, inmunocitoquímica de p65 y la inducción de p53 y la localización por tratamiento con 5-FU para las líneas celulares indicadas. p65 (rojo), fósforo-p65 (Ser536; rojo), p53 (verde), fosfo-p53 (Ser15; rojo) y DAPI (azul) tinción del núcleo sin (control) y con tratamiento con 5-FU. I, la expresión génica con cuantitativa en tiempo real RT-PCR en un transcurso de tiempo de tratamiento con 5-FU. Proyecto TIGAR, PUMA, CDKN1A, y BTG2 fueron identificados como genes inducidos 5-FU. Los valores cuantitativos eran relativas a la ß-actina expresión.
p53 objetivos son inducidos a 5-FU tratamiento
Desde NF-kB es un factor de transcripción (TF), su localización nuclear tratamiento sobre 5-FU sugiere fuertemente transactivación. Se identificaron los 7 mejores transcripciones entre los más de 60.000 que fueron inducidos después de 4 h de tratamiento con 5-FU en MKN45 utilizando perfiles de expresión génica (Tabla 1). Curiosamente, cinco de los 7 transcripciones, es decir,
BBC3 gratis (que codifica p53 hasta reguladas modulador de la apoptosis, PUMA),
BTG2, C12orf5 gratis (que codifica probable fructosa-2,6-bisfosfatasa proyecto TIGAR),
p53 objetivos CDKN1A, y GPR87
, son conocidos [18] - [22]. La presencia de sitios de unión del promotor se predijo mediante el análisis de las secuencias del promotor con las secuencias de consenso de NF-kB y p53 utilizando el algoritmo JASPAR (Tabla 1) [23].
Se encontró que los niveles de p53 fueron inducidos en el núcleo similares a los de NF-kappa B en respuesta a 5-FU tratamiento (Fig. 1E). El tratamiento de 5-FU también aumentó los niveles de fosforilación de p53 en Ser15, lo que sugiere su transactivación (Fig. 1E, ref. [24]). De hecho, la mayoría de p53 inducida total por 5-FU pareció ser fosforilados. También se observó una inducción dependiente del tiempo de los genes, incluyendo
C12orf5 (proyecto TIGAR)
,
BBC3 (PUMA)
,
CDKN1A (p21)
, y
BTG2 fotos: por 5-FU mediante RT-PCR (Fig. 1I). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la respuesta celular al tratamiento con 5-FU puede implicar tanto NF-kB y p53 para la activación transcripcional en este contexto, en MKN45.
RELA derribo tiene un mayor efecto sobre la p53 proteínas objetivo que Gen TP53 Derribo
para evaluar el efecto regulador de NF-kB y p53 en respuesta al tratamiento con 5-FU, se analizaron los niveles de proteína de p65, p53, así como p53 objetivos conocidos, p21, proyecto TIGAR, y PUMA, por el Western Blot después de
RELA
y
TP53
caída en MKN45, MKN74, GSS, y Kato-III.
RELA
caída causó una marcada disminución en los niveles de p53 en todas las líneas celulares. Como era de esperar, los niveles de p21, proyecto TIGAR, y PUMA fueron también disminuyeron (Fig. 2A). Por el contrario, mientras que
TP53
caída disminución de los niveles de p53, no afectó los niveles de p65. Como era de esperar, los niveles de proteínas diana de p53 se redujeron un
TP53
desmontables; sin embargo, esta reducción fue menor que la reducción causada por
RELA
desmontables (Fig. 2B). En el análisis del ciclo celular, la MKN74, GSS, y Kato-III líneas celulares mostraron un ligero aumento en la fracción de la fase S o G2 mientras que MKN45 exhibió un aumento en la fracción de G1 después de la exposición 24 h a 5-FU en el p65 y p53 caída similar a los revuelve correspondientes (Fig. 2C). Estos resultados pueden indicar la solidez de los mecanismos de respuesta al estrés celular que mantiene la distribución del ciclo celular a pesar de la caída de p65 y p53.
A, Western blot de
RELA
caída en cuatro cáncer gástrico líneas celulares. Además de las proteínas p53 y p65, p53 objetivos, incluyendo p21, proyecto TIGAR, y PUMA, fueron evaluados. Actina se utilizó como control de carga. Los resultados de las células incubadas con RELA siRNA (siRNA) y sin objetivo siRNA (control) se muestran. B, Western blot de
TP53
caída en tres líneas celulares de cáncer gástrico. p53 alelo de Kato-III se elimina homocigótica por lo que no se realizó TP53 caída. C, el análisis del ciclo celular inducido por medicamentos. El eje horizontal, la fuerza de yoduro de propidio (PI), y el eje vertical indica el número de células de cada línea celular.
TP53 Codon72 Pro Variant muestra una baja de 5-FU sensibilidad y alta NF-kB Niveles
Gene resultados experimentales desmontables indicaron que la interacción entre NF-kappa B y las proteínas p53 podría ser importante en el contexto del tratamiento con 5-FU. Para investigar la posibilidad de que el
TP53
variante codon72 puede afectar a las respuestas celulares al tratamiento con 5-FU, la secuencia
TP53
codon72, así como mutaciones en el ADN vinculante dominio regiones codificantes (es decir, los exones 5-8) de 9 líneas celulares de cáncer gástrico (Tabla 2). El estado de la variación codon72 y
TP53
mutación no demostró una asociación clara.
A continuación se investigó la asociación entre la sensibilidad al 5-FU y
TP53
estado ( Fig. 3A), así como los niveles endógenos de NF-kB y p53 (Fig. 3B). GSS, GCIY, y MKN45 líneas, que poseen la variante homocigota Pro, exhibieron una baja sensibilidad a 5-FU, mientras que el KE39, MKN74, MKN7, NUGC4, y IWT1 líneas que poseen el alelo Arg exhibió una sensibilidad relativamente alta. Kato-III, que tiene una gran
TP53
eliminación [25], fue la más sensible a 5-FU. los niveles de proteína NF-kB se particularmente correlacionados con 5-FU sensibilidad (
r
= 0,68;
p
= 0,04; Fig. 3C); Sin embargo, no hay una clara correlación entre los niveles de p53 y la sensibilidad de 5-FU (
r = -0.04
;
p
= 0,95; Fig. 3D). Estos resultados sugieren que Pro homocigosis se asocia con la resistencia a 5-FU, mientras que ni la mutación de p53 ni los niveles de p53 endógeno afecta directamente a la sensibilidad del 5-FU.
A, ensayo de Supresión del crecimiento en tratamiento con 5-FU en células de cáncer gástrico líneas. ejes horizontales muestran GI
50 valor de 5-FU. B, los niveles de proteína endógenos de NF-B, p53, y la actina por Western blot en líneas celulares de cáncer gástrico. La actina se usa como control de carga. C, diagrama de dispersión de la distribución de los niveles de la proteína NF-kB en relación con la actina y GI
50 de 5-FU en cada línea celular. D, diagrama de dispersión de la distribución de los niveles de proteína p53 y GI
50 de 5-FU en cada línea celular. coeficiente de correlación producto-momento de Pearson (
r
), así como la
valor de p
se indica en cada diagrama de dispersión.
Discusión
han identificado previamente NF-kB como un marcador potencial para la predicción de la quimiosensibilidad basada en 5-FU después de la operación para el cáncer gástrico avanzado [9]. NF-kappa B es un factor de transcripción inducible compuesta de p65 (de RelA), c-Rel, Rel-B, p50 /NF-κB1, y p52 /NF-κB2 [26], y desempeña un papel central en las respuestas inmunes y de citoquinas inflamatorias la regulación [27] - [29]. Chang et al demostraron previamente que NF-KB inducida arriba o regulación a la baja de los genes expresados diferencialmente en mucositis intestinal inducidas en 5-FU mediante la inducción de citoquinas proinflamatorias, tales como IL-6, TNF-α, e IL-1β [10]. Estas respuestas inflamatorias inducidas por 5-FU se han considerado como parte de los procesos de evitar el estrés que pueden conducir a la desensibilización de la eficacia de 5-FU en la mucosa gástrica [30]. Aunque se ha sugerido que la activación de NF-kappa B no está directamente asociado con el desarrollo y progresión del tumor [31], NF-kB se ha considerado como un importante marcador biológico y objetivo terapéutico [32]. La evidencia directa de la reducción de la quimio-resistencia a 5-FU de siRNA para
RELA
junto con el alto poder discriminatorio de NF-kB tinción nuclear en los resultados terapéuticos de los tejidos extirpados quirúrgicamente nos llevó a cabo una validación adicional de NF-kB de un punto de vista biológico.
Nuestros perfiles de transcripción resultados reveló que varios genes p53 aguas abajo fueron hasta reguladas en respuesta a 5-FU, en el que la transactivación de NF-kB también ocurrió. Estas dos importantes factores de transcripción han sido previamente demostrado para ser co-regulados en respuesta a agentes genotóxicos [33] - [35] y TNF-α [36], [37]. Además, se ha propuesto que la co-activación de p53 y NF-kappa B en los tumores tratados con agentes genotóxicos podría conducir a fracaso terapéutico debido a la mediada por NF-KB de señalización de supervivencia [38].
caída individual de estos factores de transcripción de genes aguas abajo de p53 reveladas se vieron afectados por caída p65, mientras que el efecto fue limitado por caída p53. Los informes anteriores han sugerido una relación de cooperación entre p53 y NF-kB en el contexto de la autofagia, la apoptosis y la activación fase S de control [34], [39] - [41]. Nuestros resultados también indican que NF-KB puede compensar la actividad transcripcional de p53 cuando la función intacta se pierde en respuesta al tratamiento 5-FU. De hecho, la mayoría de los cánceres gástricos llevan mutaciones en el dominio de unión al ADN de p53, lo cual lo hace transcripcionalmente inactiva [42]. Un estudio reciente realizado por Frank
et al
. informaron que el polimorfismo codon72 de
TP53
afecta sustancialmente la capacidad de p53 para cooperar con NF-kB para la transactivación de genes, particularmente en la inducción de apoptosis a través de la caspasa 4/11 [40]. Junto con el presente hallazgo de que alguna actividad transcripcional de p53 requiere NF-kB en respuesta a 5-FU, p53 polimorfismo del codón 72 para su unión puede ser más influyente que el estado mutacional de
TP53
o expresión de la proteína NF-kB estado de p53
el impacto del polimorfismo codon72 en el riesgo de cáncer espontáneo ha sido previamente investigados, pero no establecido de manera concluyente debido a modelos de población humana y animal limitados [40], [43] - [45].. Sin embargo, el polimorfismo codon72 puede jugar un papel en el mantenimiento de las células cancerosas establecidas que desencadenar la transformación maligna celular. De hecho, estudios previos han informado de que el Pro /Pro alelo se asocia con la resistencia a la quimioterapia y mal pronóstico en la cavidad oral [46], así como de colon [47], de mama [48] y gástrico [49] cánceres y neuroblastomas [ ,,,0],43]. Una serie de
in vitro
estudios también apoyan esta hipótesis mostrando que el alelo Arg es un inductor de la apoptosis más potente que el alelo Pro [40], [50], [51]. La apoptosis es uno de los principales mecanismos inducidos por 5-FU y por lo tanto es razonable plantear la hipótesis de que la eficacia de la quimioterapia basada en 5-FU está asociada con polimorfismos de p53 específicos [49]. Nuestro
in vitro
hallazgos apoyan estos datos epidemiológicos y experimentales y sugieren un posible mecanismo para la interacción de p53 NF-B mediada por 5-FU en el sitio de unión de p53 codon72.
como se esperaba en , nuestro estudio demuestra que las líneas celulares con el alelo Pro eran más resistentes a 5-FU que aquellos con el alelo Arg. El perfil de la supresión del crecimiento de 9 líneas celulares de cáncer gástrico mostró una buena correlación con los niveles de proteína NF-kB. Estos resultados sugieren que el genotipo Arg /Arg tiene una inducción más fuerte de la apoptosis que el Pro genotipo Pro /en presencia de 5-FU. Entre las líneas celulares (todos derivados de pacientes con cáncer gástrico japoneses), la relación de Arg /Arg: Arg /Pro: Pro /Pro era 04:01:03, mientras que en pacientes japoneses sanos fue 4.5:4.4:1 [52] . Esto puede reflejar un proceso de selección que se produce durante el desarrollo del tumor y el establecimiento como una línea celular. Anterior meta-análisis del riesgo de cáncer y los polimorfismos de p53-codon72 sugieren que el genotipo Pro /Pro tiene un mayor riesgo de cáncer (más baja para el genotipo Arg /Arg) en las poblaciones de Asia [45], [53]. Sin embargo, el significado de "riesgo de cáncer" de malignidad del cáncer o la respuesta al tratamiento que queda por esclarecer, porque en general es difícil llevar a cabo un estudio clínico dominado por los polimorfismos genéticos y evaluar los verdaderos efectos genéticos de tratamiento. Hasta la fecha, la mayoría de los informes que describen una asociación entre el polimorfismo p53 codon72 y respuestas quimioterapéuticos han demostrado que el genotipo Arg /Arg tiene una respuesta favorable en una amplia gama de tipos de cáncer tratados con fármacos genotóxicos convencionales [49], [54], [55] . Proponemos un supuesto mecanismo de respuesta a 5-FU a través de NF-kB y la proteína p53 unión asociada con el polimorfismo de p53, y por lo tanto un diagnóstico combinatorio de expresión de la proteína NF-kB y codon72 puede ser un indicador útil para la quimioterapia adyuvante postoperatoria. Aparte de unas pocas grandes conjuntos de datos de escala [52], [56], en la medida de las distribuciones demográficas y étnicas del polimorfismo sigue siendo poco clara. La acumulación de datos sobre las diferencias étnicas para el polimorfismo puede explicar las diferencias en el riesgo de cáncer o la tasa de respuesta a la quimioterapia en la población de pacientes.
En resumen, nuestros resultados indican que NF-kB regula la actividad transcripcional de p53 en respuesta a 5-FU, que pueden estar asociados con un sitio polimórfico de p53 en codon72. Otros estudios clínicos y epidemiológicos deben evaluar la utilidad de la patológica concomitante /evaluación genética de NF-kB /p53-codon72 en muestras de cáncer gástrico quirúrgicamente removidos con el fin de predecir la eficacia de la quimioterapia adyuvante basada en 5-FU postoperatorio.
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doi: 10.1371. /journal.pone.0090155.s001 gratis (DOCX)